KR102036275B1

KR102036275B1 - 항-염증 활성이 우수한 페디오코커스 악시딜락티시 ldtm 5201 신균주(kctc 13563bp)

Info

Publication number: KR102036275B1
Application number: KR1020180117761A
Authority: KR
Inventors: 허철성; 김인선; 김은지
Original assignee: 서울대학교 산학협력단
Priority date: 2018-10-02
Filing date: 2018-10-02
Publication date: 2019-10-24

Abstract

본 발명은 한국 전통 발효식품으로부터 분리한 장내 염증 완화 효과에 대한 기능성을 가지는 페디오코커스 악시딜락티시(Pediococcus acidilactici) LDTM 5201 신균주에 관한 것으로, 한국 전통 발효식품에서 분리한 유산균주가 항균 활성, 항염증 및 장세포를 연결해주는 단백질의 발현을 강화함으로써 장내 염증을 완화하는 효과를 가진다는 점에서 유산균 발효 제품 및 프로바이오틱스 제제와 같은 건강기능식품에 크게 활용될 것으로 예상되며, 특히 염증성 장질환과 같은 만성 장 염증으로 고통받는 환자들의 증상 완화를 위해 사용될 가능성이 높을 것으로 기대된다

Description

항-염증 활성이 우수한 페디오코커스 악시딜락티시 LDTM 5201 신균주(KCTC 13563BP){A new Pediococcus acidilactici LDTM 5201 having advanced anti-inflammation(KCTC 13563BP)}

본 발명은 한국의 전통 발효식품으로부터 분리한 인체 염증 완화 효과가 탁월한 페디오코커스 악시딜락티시(Pediococcus acidilactici) LDTM 5201 신균주에 관한 것으로, 특히 인체 내 생존성이 높고 장내에서 항-염증 활성이 우수한 프로바이오틱스에 관한 것이다.

최근 국내외 모두에서는 염증 및 과민성 대장 증상같은 대장관련 질환이 크게 증가하는 것으로 보고되고 있는데 그 원인은 매우 다양하고 발병률도 매년 증가하고 있다.

이러한 대장관련 질환에 대하여 업계에서는 뚜렷하게 정확한 원인과 치료법을 확실히 개발하지 못하고 있으나 최근 보고된 바에 따르면 이는 장내 균총(Gut microbiota)과도 매우 깊은 연관이 있는 것으로 알려지고 있으므로, 장 건강을 유지하기 위해서는 장내 미생물 균총의 균형과 조절을 담당하는 생균제(probiotics)가 매우 중요한 역할을 할 것으로 예상된다.

염증성 장질환은 염증성 및 항 염증성 사이토카인 간의 상호 불균형이 병원균 감염과 밀접하다고 알려져 있고 특히 장내 미생물 균총의 불균형(Dysbiosis)으로 인해 유익균이 소멸되고 병원균이 우점하면 과도한 면역 반응을 촉진시켜 만성 염증이 유발된다는 점에 주목, 이를 개선하고자 하여 연구개발된 것이다.

특히 염증성 장질환 환자에게는 장내 상피세포의 손상도 관찰되는데 상피세포는 세포접합단백질(tight junction protein)을 통해 보호 장벽 역할을 수행하여 이 단백질의 발현이 억제되면 염증이 발생한다.

이처럼 다양한 장내 염증은 프로바이오틱스가 완화할 수 있는데 이는 프로바이오틱스가 염증성 사이토카인을 억제하여 면역을 조절하고, 박테리오신을 생산함으로써 유해 병원균을 억제하고, 동시에 장내에 부착, 생존하면서 프로바이오틱스 자체가 장내 미생물을 조절하여 균총을 정상화하고, 세포접합단백질(tight junction protein)의 발현을 증대시킴으로써 장벽을 강화하기 때문이다.

지금까지 염증성 장 질환의 치료 및 예방을 위한 생균제는 많이 연구되었는데 대표적으로 출시된 제품명은 VSL#3(Danisco, Madison, WI, USA)이다. 상기 제품은 수종의 균주를 혼합한 것인데 즉, Lactobacillus(L. paracasei , L. plantarum , L. acidophilus, L. delbrueckii subsp . bulgaricus)와, 3종의 Bifidobacterium (B. longum , B. breve , B. infantis) 및, 1종의 Streptococcus salivarius subsp . thermophilus를 모두 포함한 것이다.

공개특허공보 제10-2014-0017754호에 따르면, 염증 인자인 사이토카인 발현을 억제하는 유산균으로 락토바실러스 카제이 MCL균주(KCCM 11290P)를 선발하여 이용하기도 하였다.

그러나 VSL#3을 비롯한 대부분의 생균제는 미국, 유럽 또는 일본 등으로부터 수입되고 있어 외국에 지불하는 기술 사용료가 점차 증가하고 있으므로 한국인 장질환 치료 및 예방에 적합한 동등 기능의 한국 토종 균주 개발이 국내업계에서 매우 시급한 실정이며, 상기 MCL 균주는 균학적 특성이 상이하여 적용의 한계가 있다.

공개특허공보 제10-2014-0017754호(2014.02.12.공개)

상기 문제를 해결하기 위하여 본 발명은 한국 전통 발효식품으로부터 장내 염증을 치료하고 예방할 수 있는 한국 토종의 균주를 확보하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 인체 내 생존성이 높고 장내 항염증 활성이 우수한 신균주를 개발하고 프로바이오틱스 균주 등 식품 및 약품 산업의 생물 소재로 활용하고자 한다.

따라서 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 기탁번호 KCTC13563BP로 한국생명공학연구원에 기탁되며, (a) 서열목록 1의 16s-rRNA 염기서열을 가짐. (b) 상업용균주 LGG에 비해 염증발현 사이토카인인 IL-8 생성을 더 효과적으로 억제함. (c) 상업용균주 LGG에 비해 장세포 부착능이 높음. (d) 상업용균주 LGG에 비해 장내 세포접합단백질 Claudin-1 및 Tight Junction Protein1(TPJ1) 발현량을 더 많게 유도시킴. (e) 상업용균주 LGG에 비해 니트릭옥사이드(NO) 생성을 적게 유도시킴. (f) 상업용균주 LGG에 비해 염증성 사이토카인인 TNF-α 변화없이 항염증성 사이토카인인 IL-10은 증가시키고 조절 사이토카인인 IL-17은 억제시킴.의 특징을 나타내는 페디오코커스 악시딜락티시(Pediococcus acidilactici) LDTM5201 신균주를 제공함으로써 달성할 수 있다.
또한 본 발명은 LDTM5201 신균주를 이용한 항염증성 발효유 식품 또는 항염증성 사료를 제공함으로써 달성할 수 있다.

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본 발명은 장내 염증 완화에 효과있는 한국 전통의 발효식품으로부터 분리한 토종의 페디오코커스 악시딜락티시(Pediococcus acidilactici) LDTM 5201 신균주를 제공한다.

또한 페디오코커스 악시딜락티시(Pediococcus acidilactici) LDTM 5201 신균주는 내산성 및 내담즙성, 장 세포에의 부착능, 장내 염증 유발 병원균 및 식중독균에 대한 항균활성이 우수하며, 장 세포 접합 단백질인 세포접합단백질(tight junction protein)의 발현을 강화하는 효과가 있다.

따라서, 본 발명에 의한 페디오코커스 악시딜락티시(Pediococcus acidilactici) LDTM 5201 신균주는 기능성 유제품이나 식품으로 섭취시 염증성 장질환 또는 과민성 장질환 환자의 증상 완화에 효과적으로 작용할 수 있을 것으로 기대되며, 나아가, 항균 활성이 우수하여, 유제품 또는 사료 등 또는 이를 포함한 조성물 형태로 다른 병원균을 억제하는 용도로도 활용될 수 있다.

특히, 본 발명에 의한 페디오코커스 악시딜락티시 (Pediococcus acidilactici) LDTM 5201 신균주는 대한민국 강원도 유래 전통발효식품에서 분리한 유산균으로써 수입종을 대체하며 한국인의 장내 적응성이 확인되었다는 점에서 한국인 맞춤형 프로바이오틱스로 활용될 수 있다. 이를 통해 산업적으로는 항균력이 우수한 다양한 유제품 (요거트, 치즈, 발효버터 등)의 종균으로 활용 가능할 뿐만 아니라 이 종균을 이용하여 발효한 유제품을 판매함으로써 기능성 유제품 개발도 가능하고, 종균 그 자체를 프로바이오틱스 제제와 같은 건강기능식품의 형태로 제조하여 사용하고, 더 나아가 대장 관련 질환을 완화할 수 있는 치료용 프로바이오틱스 등으로 활용 가능하다.

도 1은 배양 균주의 내담즙성 산출 수식이다.
도 2는 2시간 배양 균주의 생존율 산출 수식이다.
도 3은 균주의 탄수화물 대사 프로파일로, 본 발명 페디오코커스 악시딜락티시(Pediococcus acidilactici) LDTM 5201 신균주는 valin arylamidase, L-arabinose, D-xylose, D-mannose, D-mannitol, D-sorbitol, Amygdalin, D-maltose, D-saccharose, D-melezitose, D-tagatose, Potasium gluconate 대사 활성이 특별히 높은 것으로 확인되었다.
도 4는 선발된 5종 균주의 장 세포에 대한 상대적 부착율을 조사한 것으로, LDTM5201은 대조 균주인 LGG에 비해 약 2배이상의 높은 부착능을 시현하였다.
도 5는 마우스 셀에 대한 항염증성 평가결과로서, 본 발명의 페디오코커스 악시딜락티시(Pediococcus acidilactici) LDTM 5201 신균주는 니트릭 옥사이드(NO) 생성이 매우 억제되는 효과가 있음을 확인할 수 있다.
도 6은 TNF-α로 자극받은 HT-29세포의 염증발현 사이토카인인 IL-8 생성을 LDTM 5201 신균주가 상업용 균주 LGG에 비해 탁월하게 억제하는 것을 확인할 수 있다.
도 7은 qRT-PCR 조건으로 표 4의 프라이머를 이용한 것으로, 도 8의 결과를 얻었다.
도 8은 세포접합단백질 관련 mRNA 유전자 발현 결과로서, (a)는 Occludin (b)는 Zonula occludens-1, (c)는 Claudin-1를 대상으로 한 것으로 특히 LDTM 5201는 세포접합단백질 발현량이 타 균주에 비해 월등히 우수한 것을 확인할 수 있다.
도 9는 DSS로 유발한 마우스의 염증모델을 평가한 것으로, (a) DSS 처리 기간동안 타임 스케쥴, (b) 체중 변화, (c) 평균 사료 섭취량, (d) 3일째의 분변 사진, (e) 질병활성도 (disease activity index, DAI) 결과로서, 혈변과 함께 사료섭취량이 유의적으로 감소하고 질병활성도가 급증하여 염증이 효과적으로 유발된 것을 확인할 수 있다.
도 10은 도 9의 마우스 염증에 대하여 선발 균주를 처리 시 마우스의 장내 염증 완화 효과를 검증한 것으로, (a)는 유산균 처리 시 타임 스케쥴, (b)는 체중 변화, (c)는 평균 사료 섭취량, (d)는 7일 및 14일째의 분변 사진, (e)는 생존율, (f)는 질병활성도 (disease activity index, DAI) 결과이며, 특히 LDTM 5201 섭취시 체중 증가, 사료섭취량 증가, 혈변이 없고, 생존율이 대조군에 비해 매우 높고, 질병활성도 값은 감소하여 병변이 없어진 것을 확인할 수 있다.
도 11은 DSS로 염증이 유도된 쥐의 장 사진 및 길이 측정 결과로서, 특히 LDTM 5201 섭취시 장의 길이가 타 먹이 섭취시와 달리 크게 증가하였는데, 이는 쥐의 염증반응이 일어나 염증이 발생하는 경우 장의 길이는 줄어든다는 지난 연구성과에 비추어 상업용 균주인 LGG보다 장 활동을 더 활발히 지원한 효과를 확인할 수 있다.
도 12는 각 유산균 투여 그룹 당 serum 내 사이토카인 수준을 확인한 도표로, (a)는 염증성 사이토카인인 TNF-α의 정도, (b)는 항염증성 사이토카인인 IL-10의 정도, ⓒ는 조절 사이토카인인 IL-17의 정도를 t-test 분석을 통해 평가한 것으로, 특히 LDTM 5201 투여시 14일 경과시점에 확인한 TNF-α는 변화가 없었으나, IL-10은 오히려 유의하게 증가하였고, IL-17은 크게 감소하여 항-염증 효과에서 상업용 균주인 LGG에 비해 탁월한 것으로 확인되었다.
도 13은 qRT-PCR 조건이며 표 7의 프라이머를 이용한 결과, 도 13의 결과를 얻을 수 있었다.
도 14는 유산균 투여 14일 째의 장내 세포접합단백질(tight junction protein) mRNA 상대적 발현량을 조사한 것으로, (a)Claudin-1과 (b) Tight junction protein 1(TJP1) 단백질 모두 상업용 균주인 LGG에 비해 LDTM 5201는 크게 증대시킴으로써 염증 완화효과가 탁월한 것을 확인할 수 있다.

<실험예 1>

1. 전통발효식품에서 유산균 분리

전통 발효 식품에서 유산균을 분리하기 위해서 평창, 횡성, 강릉 등의 강원 지역의 재래시장에서 김치, 젓갈, 장류, 막걸리 등의 전통 발효식품을 77개 수집하였다. 상기 전통 발효식품으로부터 유산균을 분리하기 위하여 선택배지를 활용하였다.

상기 수집된 시료들을 0.85％ NaCl에 10배 단계 희석하여 De Man Rogosa, Sharpe agar (MRS broth; Difco, USA)와 10 % Lactose 첨가한 M17 (Difco, USA) 고체 배지에 도말한 후 48시간 동안 호기조건에서 배양 후, 형태가 상이한 콜로니(colony)를 선택하여 각각 MRS broth 와 10 % Lactose 첨가 M17 broth에 계대 배양하여 순수 분리를 확인하고, 3.5 % H₂O₂를 이용해 카탈레이즈 (Catalase) 실험을 했고 그람 염색을 한 후 현미경으로 형태를 확인하였다.

또한 카탈레이즈 음성 및 그람 양성의 구균 또는 간균을 선발하여 유산균임을 판정하고, 선발 균주는 60% (v/v) 글리세롤이 함유된 MRS broth에 현탁하여 -80℃에 동결하여 보관함으로써 강원지역에서 수집한 77개의 전통발효식품 샘플에서 미동정 분리균을 확보하였다.

<실험예 2>

2. 내담즙성 및 내산성 우수 유산균 선발 및 안전성 검증

유산균주가 기능성 균주로서 숙주에게 유익한 영향을 주기 위해 인체 내 소화기관에서 생존하며 독성을 갖고 있는지 평가되어야 하므로, 선발된 균주의 내답증성 및 내산성, 용혈성, 생체아민 생성, 항생제 내성 등의 프로바이오틱스 특성 검증이 반드시 필요하다.

이를 위해 실험예 1에서 분리한 유산균주를 손쉽게 평가하기 위해 흡광도를 측정하여 내담즙성을 확인하였다. 즉, 0.3 % (w/v) oxgall이 첨가된 MRS 배지에 배양된 유산균주를 1% 접종하고, 동시에 oxgall이 첨가되지 않은 MRS 배지에도 배양된 유산균주를 같은 양으로 접종한 후 37℃ 호기 배양하였다. 12시간 배양 후 분광 광도계 (SPECTROstar Nano microplate reader, BMG LABTECH)로 600nm에서의 흡광도를 측정하고, oxgall을 첨가하지 않은 MRS 배지에 배양한 균주의 흡광도를 control 값으로 사용하였다. 유산균주의 상대적 내담즙성은 도 1의 수식으로 산출하였는데, 도 1은 상대적 내담즙성 산출식으로 0.3% oxgall이 첨가된 MRS 배양액의 흡광도(600nm)를 oxgall이 첨가되지 않은 MRS 배양액의 흡광도(600nm)로 나눈 비율이다.

일반적으로 위장의 pH는 음식물 종류 및 섭취방법에 따라 2.0~4.0까지 범위가 다양하게 나타나는 것으로 알려져있다. 본 실험에서는 평균값으로 pH 3.0 조건을 기준으로 유산균주의 생존율을 측정하여 내산성이 우수한 균주를 선발하였다. 즉, pH 3.0으로 조정된 MRS 배지에 배양 유산균주를 1% 접종하고 2시간동안 호기 배양하여, 배양 전후의 샘플을 각각 단계 희석하여 MRS 고체 배지에서 drop plate method로 진행하였다. 배양 전 유산균주의 생균수 대비 2시간 배양 후의 생균수를 측정하여 생존율(%, survival rate)을 도 2의 수식을 이용하여 산출한다.

또한, 내담즙성 및 내산성은 일반적으로 종간 차이가 있으므로 종 특이적인 특성으로 고려하여야 하나 각 종의 대표적 비교 균주가 존재하지 않고 스크리닝 단계 간소화 등의 이유로 도 1 및 도 2의 두 가지 산출식을 통해 얻은 값을 연구가 많이 이루어진 Lactobacillus rhamnosus GG(LGG) 균주를 비교 균주로 선정하여 LGG의 내산성 및 내담즙성보다 우수한 균주 5종을 선발하였다. 다음 표 1은 이렇게 선발된 유산균주의 최종 동정 결과와 특징을 정리한 것이다.

식품에서 분리한 균주가 유산균으로 동정될 경우 숙주에 적용 가능 여부를 판단하기 위해서는 안전성 지표인 용혈작용 여부, 생체 아민 생성 및 항생제 내성 여부가 필수적으로 요구되며, 용혈 작용 확인을 위해 (주) 기산바이오로부터 5% (v/v) defibrinated sheep blood 첨가 agar(MB-B1005-P50)를 사용하였다. 선발 균을 배양한 후 상기 blood agar에 streaking하여 37℃에서 4일 동안 호기 배양후 용혈환 생성 여부를 관찰하였다. Positive control로는 β-hemolysis 활성을 갖는 Enterococcus faecalis ATCC 29212를 사용한 결과, 선발된 5 균주에서는 모두 용혈 작용이 없었다.

생체 아민은 부적절한 발효 과정에서 미생물에 의한 아미노산 탈카르복실화 활성에 의해 생성되며, 대표적으로 히스타민, 티라민, 푸트레신, 카다베린 등이 있고 이는 신경독성, 혈압 상승 등의 건강에 심각한 문제를 유발하는 요인으로 작용한다. 본 발명에서는 선발된 5개 균주를 Bover-Cid and Holzapfel (1999)에 의해 고안된 배지 조성물에서 탈카르복실화 활성을 조사하였는데, 상기 4종의 생체 아민의 전구체 histidine monohydrochloride, tyrosine free base, ornithine monohydrochloride 및 lysine monohydrochloride (Sigma-aldrich, USA)를 첨가하여 준비하였다. 배지 내에 포함되어 있는 bromocesol purple이 indicator로 사용되어 아민 성분이 생성될 경우에는 색깔이 보라색으로 변하게 된다. Positive control로는 Enterococcus faecalis ATCC 29212를 사용하고, 균주를 배지에 streaking하여 4일간 37℃에 호기 배양 후 배지의 색 변화 관찰을 통해 확인한 결과, 상기 5종의 선발된 유산균은 생체 아민을 생성하지 않는 것으로 확인하였다.

선발된 유산균에 대한 항생제 내성을 조사를 위해 LSM(LAB susceptibiltiy medium) 배지를 사용하였다. 계대배양한 균주를 2번 0.8 % NaCl 용액을 이용하여 세척하고 균체를 2xLSM broth에 O.D600에서 1.0이 되도록 맞춘후, microplate에 100㎕씩 분주하였다. 항생제는 Ampicillin, Kanamycin, Streptomycin, Erythromycin, Gentamycin, Tetracyclin, Chloramphenicol을 이용하였고, 각 1mg/L에서 128mg/L까지 단계적으로 희석하여 microplate에 100㎕씩 분주하였다. 배양은 48시간 호기 배양한 뒤 OD값을 측정하여 균이 접종되지 않은 대조군에 비해 OD값이 증가 되었는지 확인하였다. OD값이 증가되기 시작한 최소 저해농도 (Minimal inhibitory concentration, MIC)를 확인하였고, 선발된 5종 균주는 EFSA기준에 충족되어 항생제 내성에 대해 문제가 없음을 확인하였다. 다음 표 2는 In vitro 장내 생존성에 관한 선발 균주 5종과 대조군인 LGG의 장내 생존성(내담즙성, 내산성) 및 항생제에 대한 최소 저해농도를 표시한 것으로, 선발된 균주가 모두 널리 알려진 상업용 균주 LGG보다 높은 생존성이 있음을 확인할 수 있다.

3. 선발된 유산균의 당 발효 및 효소 프로파일 확인

유산균주의 탄수화물 대사는 API 50 CH kit (BioMerieux, Marcy l’Etoile, France)로 조사하였다. 18시간 37℃에서 배양한 유산균주를 원심분리 (15,000rpm, 8min, 4℃)하여 1xPBS (Phosphate buffer saline, Corning, USA)로 2번 세척하여 준비한 뒤, API CH strip의 각 큐플 (cuple)에 100μl씩 접종하였다. Mineral oil을 각 큐플에 한 방울씩 떨어뜨린 후, 트레이에 약 10 ml의 증류수를 부어 배양 중의 수분 손실을 방지하도록 조치하였다. 37℃에서 호기 배양하여 48시간 후 지시약의 색 변화가 있는지 확인하여 당 발효 여부를 측정하였다.

유산균주의 효소 활성은 API ZYM kit (BioMerieux)를 이용, 18시간 37℃에서 배양한 균주를 원심분리 (15,000rpm, 8min, 4℃)하여 1xPBS로 2번 세척한 뒤, 0.85% NaCl 용액에 흡광도 (600nm)값이 약 1.0이 되도록 준비하였다. 준비된 균체를 API ZYM strip의 각 큐플에 65μl씩 접종한 후, 37℃에서 호기배양 하였다. 4시간 뒤 각 큐플에 ZYM A, B 시약을 한 방울씩 떨어뜨리고, 5분 후 나타나는 색의 강도에 따라 0～5로 점수를 기록하였다.

상기와 같은 당 발효 및 도 3의 효소 프로파일 확인을 통해 선발된 균주가 모두 같은 strain이 아닌 것을 확인하였고, 16s-rRNA sequencing을 통해 검증하였고, 본 발명 페디오코커스 악시딜락티시(Pediococcus acidilactici) LDTM 5201 신균주는 서열목록 1의 16s-rRNA를 확인하고 한국생명공학연구원에 기탁하였다(KCTC 13563BP).

<실험예 3>

4. 선발된 유산균주의 장 부착능 확인

선발된 5개 균주에 대하여 프로바이오틱스의 장세포 부착 성능을 확인하였다. 유산균의 장 부착능 확인에는 caucasian 성인의 대장에서 분리한 colorectal adenocarcinoma로 알려져있는 대표적으로 알려진 HT-29 cell line을 사용하였다.

실험은 HT-29 세포를 12-well plate에 2 × 10⁵cell/ml로 seeding하여 monolayer가 될 때까지 약 4～7일간 37℃, 5% CO₂ 조건에서 Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640; Gibco, Carlsbad, CA, USA) 배지에 10 % heat-inactivated FBS와 penicillin 100units/ml, streptomycin 100μg/ml, Fungizone (amphotericin B) 0.25μg/ml (Gibco, USA)를 첨가하여 배양하였다.

미생물 배양액은 원심분리 (15,000rpm, 10min, 4℃) 후 균체를 회수하여 1×PBS로 세척하고, 항생제가 첨가되지 않은 세포 배지에 흡광도(600 nm)가 1.0 (대략 1 × 10⁸ CFU/ml)이 되도록 희석하였다. 각 세포가 confluent하게 자란 각 well에 미생물 시료 1ml씩 접종하고, 120분 동안 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 각 well은 1×PBS로 2회 세척하고 1ml의 0.05% Trypsin-EDTA (Gibco, USA)를 처리하여 동물세포를 회수하였다. 10배 단계 희석 후 drop plate (DP) method로 MRS 고체 배지에서 생균수를 계수하였다. L. rhamnosus GG (LGG; Valio Ltd, Finland)는 잘 알려진 상업용 균주로 LGG의 장세포 부착능을 1로 보았을 때 총 5개 균주 모두가 LGG에 비해 유의적으로 우수한 부착능이 있음이 도 4에서와 같이 확인되었다.

<실험예 4>

5. 선발된 유산균의 항균력 검증

항균력 검증은 식중독을 일으키는 병원균과 대장 질환 유발 병원균을 선정하여 Agar well diffusion assay로 3반복 평가하였다. 실험은 ① 실험 전날 유산균과 병원성 미생물을 접종해 놓고, ② OD값을 0.2로 맞춘 병원성 미생물 균액 100μl를 BHI (Brain heart infusion) 고체 배지 위에 도말 후 10-30분 동안 말린다. ③ Soft agar가 굳고 난 후 멸균된 1000μl tip 뒷부분으로 구멍을 뚫고, ④ 구멍 난 well 부분에 유산균 배양액을 100μl 접종한 후 12시간 배양한 다. 배양 후 ⑤ Clear zone을 자로 가로, 세로 측정하여 평균값을 이용하였다. 아래 표의 C. coli는 Capmpylobacter coli KTCC 15212, HP는 Helicobacter pylori KTCC 12083, CJ는 Campylobacter jejuni subsp. Jejuni ATCC 33560, K88은 Escherichia coli K88이며, SA는 Staphylococcus aureus ATCC 25922, EF는 Enterococcus faecalis ATCC 29212, LI는 Listeria innocua ATCC 33090, LM은 Listeria monocytogenes KCTC 13064, PAO1는 Pseudomonas aeruginosa PAO1이며, Lactobacillus rhamnosus GG(LGG)가 대조 균주로 사용되었다.

실험 결과, 표 3과 같이 병원균에 대한 항균력을 측정할 수 있었는데, 이를 통해 본 발명의 페디오코커스 악시딜락티시(Pediococcus acidilactici) LDTM 5201 신균주는 상업용 균주인 LGG와 비교하여도 손색이 없을 정도의 항균력을 확인할 수 있었다. 표 3의 각 수치는 해당 균주 배양시에 발생하는 억제환 직경이다.

<실험예 5>

6. 마우스 셀에 대한 균주의 항염증 기능성 평가

본 실험에서는 in vivo 실험과 향후 임상에서의 기능성 효과 가능성을 기대하기 위해 마우스 셀(mouse cell line)과 휴먼 셀(human cell line)을 각각 이용하여 항염증 효과를 검증하였다.

실험에 사용된 RAW264.7 cell line은 마우스 대식세포주(Mus musculus macrophage)로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에서 분양받았다.

실험에 사용된 염증 유도용 LPS (Lipopolysaccharide)는 그람 음성 세균의 세포벽에 존재하는 물질로, 대식세포는 이를 인식하여 면역 반응이 일어나는 것으로 알려져 있어, LPS를 이용하여 대식세포 자극시 니트릭 옥사이드(Nitric oxide,NO)가 생성되며 이 물질은 염증 반응 동안 분비되어 신호 전달 및 숙주 방어 역할을 한다. 대장 질환 환자의 경우 과도한 염증 반응을 억제하는 것이 중요하기 때문에 니트릭 옥사이드 생성 억제효과가 우수한 균주를 선발하고자 하였다.

실험은 ① 18 시간 37 ℃ 배양한 유산균액을 원심분리하여 균체를 회수 후 1×PBS로 2회 세척한다. ② 미생물의 흡광도를 600nm의 파장에서 약 1.0이 되도록 1×PBS에 희석하고, 110 ℃로 설정해둔 heating block에서 15분 동안 열처리하여, ③ 10% heat-inactivated FBS와 penicillin 100units/ml, streptomycin 100μg/ml, Fungizone　 (amphotericin B) 0.25μg/ml (Gibco, USA)이 첨가된 DMEM 배지에서 배양중인 RAW264.7 세포에 처리하였다. ④ RAW264.7 세포는 실험을 위해 24-well plate에 1.0 × 10⁵ cell/ml로 seeding하고 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 2시간 동안 배양 후, ⑤ 배지 성분을 제거하여 LPS (Lipopolysaccharides from E. coli O111:B4, Sigma-Aldrich, 최종 농도: 1μg/ml)가 첨가된 세포 배지를 450μl씩 각 well에 분주하였다. ⑥ heat-killed 유산균주 샘플을 각각 50μl씩 접종하고, 양성 대조군 (PBS로 표기)과 음성 대조군 (Mock)에는 heat-killed 유산균주 처리 대신에 1×PBS를 50μl씩 처리하고, Mock 그룹에는 LPS가 첨가되지 않은 배지 450 μl를 첨가하였다. ⑦ 37 ℃, 5 % CO2 조건으로 48 시간 동안 배양한 후, 각 well에서 배양액 500μl를 e-tube에 옮겨 담고 원심분리 (2,520 rpm, 8 min, 4 ℃) 하여 상등액을 샘플링하였다. ⑧ 96-well microplate에 상등액 샘플을 각각 50μl씩 3회 반복으로 분주하고 Sulfanilamide Solution을 50μl씩 처리하여 상온에서 10분 배양 하였다. ⑨ NED solution을 50μl씩 처리하여 상온에서 10분 배양 후, 30분 이내로 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 (Nitrite 표준 곡선은 실험마다 새로 측정) 니트릭 옥사이드 농도를 산출하였다.

조사 결과, 도 5와 같이 선발 유산균주 M7k-1, LDTM 5201, HS-2 세가지 균주는 상업용 균주 LGG에 비해 효과적인 것으로 확인되었고, 그 중 LDTM 5201는 가장 강력한 니트릭 옥사이드 생성억제 효과(LGG 대비 약 30% 수준에 불과)가 확인되었다.

<실험예 6>

7. 휴먼 셀에 대한 균주의 항염증 기능성 평가

정상적인 경우 인체의 장내에서는 염증성 및 항염증성 사이토카인이 균형을 이루면서 항상성을 유지하는데, 만약 이들 사이토카인의 균형이 무너지면 비정상적인 염증이 발생하게 된다. 특히, 염증성 사이토카인 중 종양 괴사 인자로 불리는 TNF는 대표적 염증성 사이토카인으로 염증성 장질환 환자에게 매우 높은 수치가 관찰되곤 한다.

TNF는 다양한 세포에서 분비되며 다양한 메커니즘으로 염증 및 세포 괴사를 유발하게 되는데, 초기 염증 반응에서 분비됨으로써 다른 사이토카인의 발현을 조절하기도 한다. 이에 본 실험에서는 휴먼 셀(Human cell line)에 TNF-α로 염증을 유발한 후 선발된 LDTM5201 및 HS-2 등 균주의 염증 억제 효과를 살펴 in vitro 상에서 만성 염증 질환 모델을 구축하고자 하였다. 휴먼 셀로는 장세포로 널리 알려진 HT-29 cell line을 이용하였고 염증 반응의 지표로는 IL-8을 선정하였다. IL-8은 염증 반응에서 가장 기본적으로 발현되는 사이토카인으로 neutrophil 유도 인자로도 잘 알려져 있다. 실험 방법은 다음과 같다.

먼저 ① HT-29 세포를 10 % heat-inactivated FBS와 penicillin 100 units/ml, streptomycin 100 μg/ml, Fungizone　 (amphotericin B) 0.25 μg/ml (Gibco, USA)이 첨가된 DMEM 배지에서 1주일간 배양하고, ② HT-29 세포는 실험을 위해 24-well microplate에 1.0 × 10⁵cell/ml로 seeding하고 7일간 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하여 6일째 항생제가 첨가되지 않은 DMEM (5% heat-inactivated FBS 함유)로 배지를 갈아 준다. ③ Overnight 배양 후, 미생물을 원심분리 (15,000rpm, 10min, 4℃)해 균체를 회수, 1×PBS로 2회 세척하여 흡광도(600 nm) 측정시 약 1.0 (1.0 × 10⁸ CFU/ml)이 되도록 DMEM 순수 배지에 미생물을 희석하한다. ④ 배지를 제거한 24-well plate에 100 μl/well씩 넣고, recombinant human TNF-α(PeproTech, USA)가 10 ng/ml의 농도로 첨가된 세포 배지를 각 well에 900 μl씩 분주하고(TNF-α 최종 농도: 10ng/ml, 유산균 최종농도: 1.0 × 10⁸CFU/ml), 37℃의 5% CO2 조건에서 6시간 배양 후, 세포 배양액을 e-tube에 옮겨 담아 원심분리(13,000rpm, 5min, 4 ℃)하고, 상층액을 샘플링한다. ⑤ 시료는 ELISA 분석을 위해 필요시까지 -80℃에 보관하며 시료 내 IL-8의 양은 Human IL-8 ELISA kit (Koma biotech, Korea)를 사용하여 프로토콜에 따라 측정하였다.

실험 결과, 도 6과 같이 LDTM 5201는 실험 균주 중 TNF-α로 자극받은 HT-29 세포의 IL-8 생성을 가장 효과적으로 억제하는 강력한 효과가 있음을 확인하였다. 참고로 상업용 균주 LGG 함유 우유는 우유 과민성 성인이 우유를 마신 후 염증반응은 하향 조절하는 것이 이미 보고된 바 있어(Majamaa and isoauri, 1997) 본 발명의 LDTM 5201은 더욱 강력한 효과가 합리적으로 기대된다.

본 실험 결과에 기초하여 장 세포내 세포접합단백질(tight junction protein) 발현 강화 효과가 있는지 더욱 검증하고자 LDTM5201 및 HS-2 선발 균주에 한해 추가 실험을 진행하였다.

<실험예 7>

8. 균주의 세포접합단백질(tight junction protein) 발현 효과 실험

인체의 장내 상피세포는 세포접합단백질(tight junction protein)로 단단히 연결되어 외부 보호장벽 역할을 수행하는데, 대장 관련 질환 중 염증성 장질환 환자의 경우 다양한 요인에 의해 TNF-α, IFN-γ와 같은 사이토카인이 과분비됨으로써 tight junction이 느슨해지고 장내 세포가 사별하는 악순환을 반복하게 된다.

선발 균주의 세포접합단백질(tight junction protein) 강화 효과를 확인하기 위해 본 실험은 선발한 두 균주, LDTM5201 및 HS-2에 대하여 qRT-PCR 기법을 사용하였다.

즉, 대장 상피세포인 caco-2 cell을 TNF-α로 48시간 자극하여 세포접합단백질의 발현을 억제한 후, 유산 균주를 처리하여 세포접합단백질(tight junction protein)의 상대적 발현량을 확인하였다. 세포접합단백질(tight junction protein)로는 널리 알려진 Occludin (OCLN), Zonula occludens -1 ( ZO-1 ), Claudin-1(CLDN1)을 사용하였고, Reference gene으로는 housekeeping gene인 β-actin을 사용하였다.

실험은, ① Caco-2세포를 20% heat-inactivated FBS와 penicillin 100units/ml, streptomycin 100μg/ml, Fungizone(amphotericin B) 0.25μg/ml(Gibco, USA)이 첨가된 MEM 배지에서 1주일 배양하고, ② 세포는 실험을 위해 12-well microplate에 1.0 × 10⁵cell/ml로 seeding하고 confluent 상태가 될 때까지 37℃, 5% CO2 조건에서 배양한다. ③ Cell이 confluent한 상태가 되면 Recombinant human TNF-α(PeproTech, USA)가 10 ng/ml의 농도로 첨가된 세포 배지를 각 well에 1 ml씩 분주 후 24 시간동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양한다. ④ overnight 배양된 미생물을 원심분리(15,000rpm, 10min, 4℃)하고 균체 회수후 1×PBS로 2회 세척하여 미생물의 흡광도(600 nm)를 약 0.1(1.0 × 10⁷ CFU/ml)이 되도록 DMEM 순수배지에 희석하고, caco-2 세포 배지를 제거하여 1×PBS로 2회 세척한 12-well plate에 준비한 미생물 균액을 1ml/well씩 넣어주고, ⑤ 37℃, 5% CO2 조건에서 6시간 배양한다. ⑥ 상층액을 버리고 각 well은 1×PBS로 2회 세척하고 1ml의 0.05% Trypsin-EDTA(Gibco, USA)를 처리하여 세포를 떼어낸 후, 떼어낸 세포는 배양시 사용하는 MEM 배지를 1ml 넣고 원심분리하여 (1,000 rpm, 3 min, 4 ℃) 균체를 회수한 후 1×PBS로 1회 세척한다. ⑦ 세척한 세포를 다시 원심분리하여 균체를 회수한 후 AccuZolTM (Bioneer,USA) 용액을 1 ml 처리 후 vortexing 해주고 -80 ℃에서 1~2 시간 보관 후 한 번 녹였다가 -80 ℃에 다시 보관한다. ⑧ 시약 프로토콜에 따라 RNA 추출 후 the ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover kit (TOYOBO, Japan)를 이용하여 cDNA 합성하여, ⑨ TOPreal^TMqPCR2Ⅹ PreMIX (SYBR Green with low ROX) kit(Enzynomics, Korea)를 이용하여 quantitative real-time PCR(qRT-PCR)을 실행하였다. 사용된 프라이머와 qRT-PCR 조건은 표 4의 프라이머들과 도 7의 시간 및 온도로 설계된 조건이다.

확인 결과, 세 가지 세포접합단백질 모두 무처리군에 비해 TNF-α 처리군에서 유의적으로 발현이 억제되었고, 특히 도 8과 같이 LDTM 5201은 ZO-1과 claudin-1의 발현을 유의하게 증가시킨 것이 확인된다. 즉, 선발된 두 균주 모두 TNF-α로 인하여 감소된 세포접합단백질(tight junction protein)의 발현을 강화하는 효과를 나타내었고, 특히 LDTM 5201의 효과가 탁월한 정도로 평가된다. 이처럼 LDTM 5201은 in vitro 실험에서 항균 활성, 항염증, 세포접합단백질(tight junction protein) 강화 효과를 가지는 것이 모두 확인되었다. 이를 바탕으로 동물실험을 통해 염증 완화 효과를 더 검증하고자 하였다

<실험예 8>

9. 동물실험을 통한 염증완화 효과 검증

(1) 동물 실험 디자인

실험용 마우스로는 8주령의 암컷 C57BL/6을 사용하였고, 무작위로 3그룹으로 나누어 표 5 및 표 6과 같이, 1그룹당 3마리씩, 총 3cage로 설정하였다. Dextran sulfate sodium (DSS)를 하루에 2.5% 농도로 1일간 처리, 2일간 5 %로 DSS를 처리하여 장내 염증을 유발하였다.

대장염 유발 후 LDTM 5201가 포함되는 균주를 1.0 × 10⁷ CFU/ml 농도로 14일간 경구투여하였을 때 일어나는 체내 변화 및 염증 완화 효과를 확인하였다. 3일간 염증 유도 후 첫 번째 그룹에는 Lactobacillus rhamnosus GG 균주를 처리하여 대조군으로 설정하였고, 두 번째 그룹 Weissella cibaria HS-2, 세 번째 그룹 Pediococcus acidilactici LDTM 5201 균주를 이에 대비하는 실험군으로 설계하여 각각 염증 완화 효과를 검증하였다. 실험군 및 대조군에 처리할 균주는 18시간 동안 37℃에 배양후 원심분리(14,000rpm, 7min, 4℃)하여 균체를 회수하고 1×PBS로 2회 세척하였다. 미생물의 흡광도(600 nm)를 약 1.0(1.0 × 10⁸ CFU/ml)이 되도록 1×PBS에 현탁하여 준비하여, 14일 간 매일 같은 시간에 유산균 200μl 씩 경구 투여하였다.

(2) 마우스에 DSS 투여를 통한 염증 검증 모델 구축

실험적으로 대장염은 가장 널리 사용되는 Dextran sulfate sodium (DSS)를 처리하여 유도한다.

본 실험에서는 도 9와 같이, DSS처리 후 체중변화는 크게 없었으나 사료 섭취량이 2~3일 후에 유의적으로 감소하고, 혈변 및 설사를 관찰할 수 있었다. 병변의 심각도를 평가하는 질병활성도 측정시 3일째 유의적으로 증가하였다. 질병활성도 평가는 Murthy 등의 기준에 의하면 a) 체중감소 (0점 = 없음, 2점 = 1~2 % 감소, 3점 = 2~5 % 감소, 4점 = 5~10 % 감소, 5점 = 10 % 이상 감소) b) 분변 굳기 정도/설사 (0점 = 정상, 3점 = 약간 무른 정도, 5점 = 설사) c) 혈변 (0점 = 정상, 3점 = 약간의 혈액이 관찰, 5점 = 심각한 혈변)을 기준으로 평가하였다. 이를 통해 DSS 처리 시 염증이 효과적으로 유발된 것이 확인되었다.

(3) 선발 균주 투여 시 염증 완화 효과 확인

14일 동안 선발 LGG, LDTM5201 및 HS-2 균주를 투여하면서 0일 째 및 14일 째 분변 샘플 및 혈액을 샘플링하였고, 0일 째, 7일째, 14일째에 체중과 사료 섭취량을 측정하였다. 도 10과 같이 LDTM 5201 등 균주를 투여하면서 유의적이지는 않으나 모든 그룹에서 쥐의 체중이 점차 증가하는 경향을 보이는 것을 확인할 수 있고 사료 섭취량은 LDTM 5201균주를 섭취한 그룹에서 유의하게 증가된 것이 확인되었다. 7일째와 14일째 분변 사진을 확인한 결과 혈변은 거의 관찰되지 않았고 변의 굳기 또한 정상화된 것을 확인하였다.

총 9마리씩 3그룹의 생존율은 LGG 투여 그룹에 비해 LDTM 5201 균주 등을 투여한 두 그룹이 더 좋은 것을 확인할 수 있고, 질병활성도에서도 다른 그룹은 유의한 차이가 없으나 LDTM 5201균주 투여 그룹은 값이 유의하게 감소하여 병변의 심각도가 크게 완화된 것을 확인하였다. 참고로, 쥐에 염증 반응이 일어날 경우 염증으로 인해 장의 길이가 줄어든다는 종래의 연구를 토대로 도 11과 같이 유산균 투여 마지막 날 안락사 시킨 쥐의 장을 적출한 결과 LGG 그룹에 비해 다른 두 그룹은 모두 유의적으로 장의 길이가 증가한 것을 알 수 있어 염증 완화효과가 LGG에 비해 LDTM 5201균주가 탁월한 것을 확인할 수 있다.

(4) 혈액 내 염증 지표 확인

염증이 유발되면 염증성 사이토카인은 증가하고 항염증성 사이토카인이 감소한다는 것은 잘 알려진 사실이며, DSS를 처리한 마우스에서 조절 사이토카인인 IL-17이 유의적으로 감소한다는 것이 알려져 있다.

이들 선행 연구를 토대로 각각의 사이토카인 양을 측정하고자 ELISA 기법을 이용해 혈액 내 염증성 사이토카인 TNF-α, 항염증성 사이토카인 IL-10 및 조절 사이토카인 IL-17의 양을 ELISA kit(Koma biotech, Korea)로 측정하였다.

측정 결과, 도 12와 같이 TNF-α는 균주 투여 전에 비해 14일째에도 유의적인 변화가 관찰되지 않았으나, 항염증성 사이토카인 IL-10은 LGG, HS-2 그룹에서는 유의하게 감소하였음에도 특이하게 LDTM 5201 그룹에서는 오히려 유의하게 증가한 것이 확인되었고, 사이토카인 IL-17은 LGG 및 LDTM 5201 그룹 모두에서 유의하게 감소하였다. 즉, LDTM 5201는 염증성 사이토카인 TNF-α의 변화없이 항염증성 사이토카인을 유의하게 증가시킴과 동시에 조절 사이토카인 IL-17을 억제시킴으로써 상업용 균주로서 염증완화 기능이 알려진 LGG 보다 훨씬 탁월한 효과를 기대할 수 있을 것으로 사료된다.

(5) 세포접합단백질(tight junction protein) 발현 검사

14일째에 적출한 장에 AccuZol^TM (Bioneer,USA) 용액 1ml 처리 후 -80 ℃에 보관하였다가, 얼음에 샘플을 박아놓고 mini homogenizer로 장을 작게 다진 후, 다시 -80 ℃에서 1~2시간 얼린 후 다시 녹였다. 시약 프로토콜에 따라 RNA 추출 후 the ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover kit (TOYOBO, Japan)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. TOPreal^TMqPCR2Ⅹ PreMIX (SYBR Green with low ROX) kit (Enzynomics, Korea)를 이용하여 quantitative real-time PCR (qRT-PCR)을 실행하였다. 사용된 프라이머와 qRT-PCR 조건은 아래 그림과 같다.

타겟으로 선정한 세포접합단백질(tight junction protein)은 가장 잘 알려진 단백질인 Cloudin-1(CLDN1), Tight junction protein 1(TJP1)을 사용하였고, (Occludin (OCLN)의 경우 발현양이 충분하지 않아 증폭이 잘 되지 않은 문제가 있어 제외하고,) Reference gene으로는 대표적 housekeeping gene인 GAPDH를 사용하였다.

실험 결과, 도 14와 같이 HS-2 및 LDTM 5201 처리군에서는 훨씬 유의하게 발현이 증가된 것이 확인되었다. 특히 상업용 균주 LGG 보다 LDTM 5201의 염증 완화가 훨씬 뛰어난 것을 확인하였다.

이상의 동물실험 결과를 다시 정리하면, LDTM 5201를 투여한 그룹은 LGG 투여 그룹에 비해 유의적으로 높은 사료 섭취량, 생존률 및 낮은 질병활성도 점수를 보였으며, 섭취 후의 장의 길이가 덜 짧아졌으며, 세포접합단백질 발현을 강화하는 효과를 보였다.

이처럼 인체 내 생존성이 높고 장내 항염증 활성이 우수한 LDTM 5201 균주는 Pediococcus acidilactici LDTM 5201으로 명명하였고, 다양한 유제품 발효시 면역 기능성을 강화할 좋은 생물소재로 활용될 수 있을 것으로 예상된다.

한편 본 발명의 LDTM5201 신균주에 대한 기탁 기관과 수탁번호 및 일자는 아래와 같다.

기탁기관명 : 한국생명공학연구원

수탁번호 : KCTC13563BP

수탁일자 : 2018627

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> A new Pediococcus acidilactici LDTM 5201 having advanced anti-inflammation(KCTC 13563BP) <130> P18-007 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1009 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Pediococcus acidilactici LDTM 5201 <400> 1 ccacgtcggc gtctccatgc ggattactta atgcgttagc tgcagcactg aagggcggaa 60 accctccaac acttagtaat catcgtttac ggcatggact accagggtat ctaatcctgt 120 tcgctaccca tgctttcgag cctcagcgtc agttacagac cagacagccg ccttcgccac 180 tggtgttctt ccatatatct acgcatttca ccgctacaca tggagttcca ctgtcctctt 240 ctgcactcaa gtctcccagt ttccaatgca cttcttcggt tgagccgaag gctttcacat 300 tagacttaaa agaccgcctg cgctcgcttt acgcccaata aatccggata acgcttgcca 360 cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccgtg gctttctggt taaataccgt 420 cactgggtga acagttactc tcacccacgt tcttctttaa caacagagct ttacgagccg 480 aaacccttct tcactcacgc ggcgttgctc catcagactt gcgtccattg tggaagattc 540 cctactgctg cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag tcccaatgtg gccgattacc 600 ctctcaggtc ggctacgcat catcgccttg gtgagccgtt acctcaccaa ctagctaatg 660 cgccgcgggt ccatccagaa gtgatagcag agccatcttt taaaagaaaa ccaggcggtt 720 ttctctgtta tacggtatta gcatctgttt ccaggtgtta tcccctgctt ctgggcaggt 780 tacccacgtg ttactcaccc gtccgccact cacttcatat taaaatctca ttcagtgcaa 840 gcacctcata atcaattaac ggaagttcgt tcgacttgca tgtattaggc acgccgccag 900 cgttcatcct acgaagaaaa aaaactaaat atataaaaac cccccaaagg gggggaaaaa 960 gggggttata tatcttaaat ctcttcccaa aaatatctat ttacggggt 1009 <210> 2 <211> 709 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Pediococcus acidilactici strain LDTM 5201 <400> 2 cggaacgatg atactaagtg ttggagggtt tccgcccttc agtgctgcag ctaacgcatt 60 aagtaatccg cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact caaaagaatt gacgggggcc 120 cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagctacg cgaagaacct taccaggtct 180 tgacatcttc tgccaaccta agagattagg cgttcccttc ggggacagaa tgacaggtgg 240 tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 300 cccttattac tagttgccag cattcagttg ggcactctag tgagactgcc ggtgacaaac 360 cggaggaagg tggggacgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt 420 gctacaatgg atggtacaac gagtcgcgaa accgcgaggt ttagctaatc tcttaaaacc 480 attctcagtt cggactgtag gctgcaactc gcctacacga agtcggaatc gctagtaatc 540 gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc 600 atgagagttt gtaacaccca aagccggtgg ggtaaccttt taggagctag ccgtctaagg 660 tgggacagat gattagggtg aatcaaaagg ggggggcaaa acaaatttt 709

Claims

기탁번호 KCTC13563BP로 한국생명공학연구원에 기탁된 하기의 특징을 나타내는 페디오코커스 악시딜락티시(Pediococcus acidilactici) LDTM5201 신균주.
(a) 서열목록 1의 16s-rRNA 염기서열을 가짐.
(b) 상업용균주 LGG에 비해 염증발현 사이토카인인 IL-8 생성을 더 효과적으로 억제함.
(c) 상업용균주 LGG에 비해 장세포 부착능이 높음.
(d) 상업용균주 LGG에 비해 장내 세포접합단백질 Claudin-1 및 Tight Junction Protein1(TPJ1) 발현량을 더 많게 유도시킴.
(e) 상업용균주 LGG에 비해 니트릭옥사이드(NO) 생성을 적게 유도시킴.
(f) 상업용균주 LGG에 비해 염증성 사이토카인인 TNF-α 변화없이 항염증성 사이토카인인 IL-10은 증가시키고 조절 사이토카인인 IL-17은 억제시킴.
제1항의 LDTM5201 신균주를 이용한 항염증성 발효유 식품
제1항의 LDTM5201 신균주를 이용한 항염증성 사료