KR101431250B1 - 병원성 미생물의 항균활성을 가진 신규한 유산균과 유기물분해 활성을 갖는 신규 유용 미생물을 유효성분으로 함유하는 가금류용 발효사료 첨가제 조성물 - Google Patents

Abstract

병원성 미생물의 항균활성을 가진 신규한 유산균 및 이를 유효성분으로 함유하는 가금류용 발효사료 조성물에 관한 것으로 병원성 미생물의 항균활성을 가지는 유용균주를 선별하고 상기 선별균주의 생리적, 생화학적 특성을 확인한 후 유산균을 함유하는 가금류용 발효사료 조성물을 제조하였으며 상기 발효사료의 부형제의 결정 및 조성비율, 발효온도, 발효시간, 호기와 혐기상태의 차이, 당첨가 유무, 미생물 결정 및 조성비율의 최적 조건을 확인하여 제조한 본 발명 발효사료는 병원성 미생물의 항균활성을 가진 신규한 유산균을 제공하는 효과가 있을뿐 아니라, 영양학적, 기능적, 품질 측면에서 상기 유산균을 유효성분으로 함유하는 가금류용 발효사료 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

병원성 미생물의 항균활성을 가진 신규한 유산균과 유기물분해 활성을 갖는 신규 유용 미생물을 유효성분으로 함유하는 가금류용 발효사료 첨가제 조성물{Poultry fermented additive feed composition containing the novel Lactic acid bacteria having anit-pathogenic microorganism and Organic matter decomposition activity microorganism}

본 발명은 동물병원성 미생물의 항균활성을 가진 신규한 유산균 및 유기물분해 활성을 갖는 신규 유용 미생물를 유효성분으로 함유하는 가금류용 발효사료 첨가제 조성물에 관한 것이다.

가금류는 식육용 또는 산란용을 불문하고, 귀중한 단백질 자원으로 이용되고 있으며 닭고기에 대한 구매 증가로 첨가용 항생제의 사용은 크게 증가하여 사료용 첨가제로 사용되고 있다(Kang, G. H. et al., 2010, Effects of environmental temperature and antibiotic substitute on quality of chicken breast meat, Korean J. Food Sci. Ani. Resour, 30, 261-268). 축산업은 보편적으로 가축의 성장을 촉진하고 가축의 질병 예방 및 치료가 가능한 항생물질을 사용하고 있으나(Guo, F. C. et al., 2004, Effect of a Chinese herb medicine formulation, as an alternative for antibiotics, on performance of broilers, Br Poult Sci., 45, 793-797), 항생물질을 빈번하게 사용하게 되면 내성을 가지는 미생물이 증가하여 그 항생물질의 효능이 떨어지거나, 축산물 중에 잔류하게 되어 인체에 악영향을 초래할 수 있다는 점에서, 항생제의 사용이 점차 규제되고 있으며(Chae, M. H. et al., 2011, Antimicrobial resistance in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli isolated from food animals and raw meats in slaughterhouse in Korea during 2010, Kor. J. Vet. Publ. Hilth., 35, 239-245) 한국에서는 2011년 7월 이후 사료첨가용 항생제 사용이 금지되었다.

가금류에 질병을 유발하는 병원성 세균으로는 그람 음성균으로 살모넬라(Salmonella), 캄필로박터(Campylobacter), 대장균(Escherichia coli) 등이 있으며, 그람 양성균으로 클로스트리디움(Clostridium) 등이 있다. 특히 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum)은 간균으로서 장내에 기생하는 살모넬라균에 속하는 세균이며, 어린 병아리에 백색설사를 하며 패혈증으로 폐사시키는 급성전염병을 일으키는 균이다. 또, 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)은 성계에서 패혈증을 주증으로 하는 소화기 전염병으로서 난계대점염을 일으킨다. 상기와 같은 병원성 미생물들은 가축질병을 유발할 뿐만 아니라, 도축과정에서 식육에 오염되어 사람에게 질병을 유발하기도 한다.

한편, 유산균(lactic acid bacteria)은 프로바이오틱(probiotic)으로 널리 이용되고 있는 대표적인 세균으로 자연계에 널리 존재하고, 사람이나 동물의 장(腸)과 발효식품 등에서도 쉽게 발견되는 미국식품의약국(Food and Drug Administration)에서 안전하다고 인정한 미생물이다(Orrhge, K. et al., 2000, Bifidobacteria and lactobacilli in human health, Drugs Exptl. Clin. Res., 26, 95-111). 유산균은 장내 상피세포에 부착하여 기생하게 되어 장내 균총의 성질을 개선시켜 장내 균총의 안정화, 유해세균의 정착 억제에 따른 부패산물 생성 감소 및 질병 예방, 면역 활성화 작용, 항암작용, 콜레스테롤 저하 등 숙주동물에 많은 도움을 준다. 유산균이 여러 부패성 미생물 및 병원성 미생물에 대하여 생육억제 작용을 갖는 것은 몇 가지 대사적인 특성 때문인데 젖산균은 대사산물로서 항균활성 인자인 organic acid, hydrogen peroxide, reuterin, diacetyl, acetaldehyde, bacteriocin 등을 생산하기 때문이다(Fuller, K., 1989, Probiotics in man and animals, J. Appl. Bacteriol., 66, 365-378).

따라서 가금류를 보다 생산적으로 양육하기 위해서는 기능성이 향상된 가름류용 발효사료의 개발이 절실하다. 미생물과 농가 부산물을 이용한 가축사료 및 그 제조방법은 대한민국 등록특허 제10-0338122호에 개시된 바 있다. 또 유산균과 효모를 이용한 축산용 발효사료 및 그 제조방법은 대한민국 등록특허 제10-0840145호에 개시된 바 있고 내산성, 내담즙산성 및 항균 효과를 가진 신규한 유산균 및 이를 포함하는 조성물이 대한민국 공개특허 제10-2008-0110397호에 개시되어 있다. 그러나 상기문헌 어디에도 병원성 미생물의 항균활성을 가진 신규한 페디오코크스 액시딜락티시(Pediococcus acidilacticii BBG L1, KCTC 12504BP)를 유효성분으로 함유하는 가금류용 발효사료 조성물에 대하여는 개시된 바 없다.

따라서 본 발명의 목적은 병원성 미생물의 항균활성을 가진 신규한 유산균을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유산균을 함유하는 가금류용 발효사료 조성물을 제공하는데 있다.

분 발명의 상기 목적은 병원성 미생물의 항균활성을 가지는 유용균주를 선별하는 단계와; 상기 선별균주의 생리적, 생화학적 특성을 확인하는 단계와; 유산균을 함유하는 가금류용 발효사료 조성물 제조하는 단계와; 상기 추출물의 발효 전과 후의 일반성분, 아미노산성분 함량 차이를 확인하는 단계와; 상기 발효 부형제의 결정 및 조성비율, 발효온도, 발효시간, 호기와 혐기상태의 차이, 당첨가 유무, 미생물 결정 및 조성비율 등의 실험을 통한 차이와 최적 조건을 확인하는 단계를 통하여 달성하였다.

본 발명은 병원성 미생물의 항균활성을 가진 신규한 유산균을 제공하는 효과가 있을뿐 아니라, 영양학적, 기능적, 품질 측면에서 상기 유산균을 유효성분으로 함유하는 가금류용 발효사료 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 본 발명 선별 유산균의 항균활성을 나타낸 사진도이다.
도 2는 본 발명 균주 L1의 유전자 염기서열 분석결과를 바탕으로 L1이 페디오코크스 액시딜락티시(Pediococcus acidilactici)임을 나타내는 계통모식도이다.
도 3은 본 발명 균주 L29의 유전자 염기서열 분석결과를 바탕으로 L29가 페디오코크스 펜토사케우스 (Pediococcus pentosaceus)임을 나타내는 계통모식도이다.
도 4는 본 발명 균주 L30의 유전자 염기서열 분석결과를 바탕으로 L30이 락토바실러스 플란타룸(Lacobacillus plantarum)임을 나타내는 계통모식도이다.
도 5는 본 발명 균주 B1의 유전자 염기서열 분석결과를 바탕으로 B1이 바실러스 테퀼렌시스(Bacillus tequilensis)임을 나타내는 계통모식도이다.
도 6은 본 발명 균주 B5의 유전자 염기서열 분석결과를 바탕으로 B5가 바실러스 아밀로리큐프 아시엔스(Bacillus amyloliquef aciens)임을 나타내는 계통모식도이다.
도 7은 본 발명 균주 Y6의 유전자 염기서열 분석결과를 바탕으로 Y6이 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)임을 나타내는 계통모식도이다.
도 8은 본 발명 선별균주의 미생물간의 길항효과를 나타낸 사진도이다.
도 9는 본 발명 선별균주의 단일배양시 소맥피 발효 최적조건을 탐색한 그래프이다.
도10은 본 발명 선별균주의 유산균과 바실러스 혼합배양시 소맥피 발효 최적조건을 탐색한 그래프이다.
도11은 본 발명 선별균주의 유산균과 효모 혼합배양시 소맥피 발효 최적조건을 탐색한 그래프이다.
도12는 본 발명 선별균주의 유산균, 효모, 바실러스의 혼합배양시 소맥피 발효 최적조건을 탐색한 그래프이다.
도13은 본 발명 선별 혼합균주의 소맥피 발효시 pH 변화를 측정한 그래프이다.
도14는 본 발명 가금류용 발효사료 조성물의 부산물 혼합제제를 사용한 후 생균수를 탐색한 그래프이다.
도 15는 본 발명 가금류용 발효사료의 당첨가 차이에 따른 미생물 변화를 나타낸 그래프이다.
도 16은 본 발명 가금류용 발효사료의 호기와 혐기적 배양법 차이에 따른 미생물 변화를 나타낸 그래프이다.
도 17은 본 발명 가금류용 발효사료의 배양온도 차이에 따른 미생물 변화를 나타낸 그래프이다.
도 18은 본 발명 가금류용 발효사료의 미생물 접종량 차이에 따른 미생물 변화를 나타낸 그래프이다.
도 19는 본 발명 가금류용 발효사료의 미생물 접종비율에 따른 미생물 변화를 나타낸 그래프이다.
도 20은 본 발명 가금류용 발효사료의 최적조건으로 배양후 당첨가량 차이에 따른 미생물 변화를 나타낸 그래프이다.
도 21은 본 발명 가금류용 발효사료 조성물의 부산물 첨가에 따른 pH 및 생균수를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 실시예와 도면에 의거 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것에 불과하며 본 발명의 권리범위를 한정하는 것으로 의도되지는 않는다.

<실험예 1> 본 발명 미생물의 유용균주 분리

(1) 균주 분리 및 배양

자사에서 기 보유한 균주와 새로운 균주 분리를 위해 산토양, 하우스토양, 돼지분변 등에서 각각 시료를 채취한 후 시료 1 g에 멸균된 생리식염수(0.85% NaCl) 9 mL에 현탁 시킨후 바실러스 속은 NB(Nutrient Broth) agar 배지, 유산균 속은 MRS agar 배지, 효모균 속은 PDB(Potato Dextrose Broth) agar 배지에 10³ ~ 10⁶ 희석한 희석액 0.1 mL를 첨가하여 유리봉으로 도말하여 2일 배양한 후 항균활성 균주를 순수 분리하였다.

(2) 본 발명 미생물의 항균활성 검정

병원성미생물 Salmonella gallinarum, Salmonella pullorum, Salmonella typhimurium은 LB(Luria Bertani media broth) agar 배지에 35℃에서 계대배양하여 사용하였다. 상기 분리한 균주의 병원성미생물의 항균활성을 통한 균주 선발을 하였다. 상기 계대배양한 병원성미생물 Salmonella gallinarum, Salmonella pullorum, Salmonella typhimurium을 LB 배지에 전 배양하여, LB agar에 현탁액(1.0×10⁶ cfu/ml) 10 μL를 퍼지지 않게 주입하고 도말한 후 직경 5 mm의 Cokr Borer를 이용하여 구멍을 내었다. 상기 구멍에 MRS 배지에서 1일 배양한 배양액을 시린지 필터(0.2 μL)로 여과하여 각각 200 μL를 주입하고 35℃에서 20시간 배양후에 clear zone의 지름을 측정하였다.

실험결과, [표 1]에 나타낸 바와 같이 Salmonella gallinarum, Salmonella pullorum, Salmonella typhimurium의 3종에 대해 모두 항균활성이 나타나는 것은 L1, L30, L39로 나타났고, Salmonella pullorum, Salmonella typhimurium의 2종에 대해 항균활성이 나타나는 것은 L29, L37으로 나타났으며, Salmonella gallinarum, Salmonella pullorum의 2종에 대해 항균활성이 나타나는 것은 L36으로 나타났다. Salmonella gallinarum의 1종에 대해 항균활성이 나타나는 것은 L5로 나타났다.

상기 방법과 마찬가지로 효모와 바실러스도 Salmonella gallinarum, Salmonella pullorum, Salmonella typhimurium의 3종에 대해 항균활성을 검정하였으나 모두 항균활성을 나타내지 않았다.

본 발명 유산균의 항균활성 결과

BBG No	Source	Salmonella gallinarum (mm)	Salmonella pullorum (mm)	Salmonella typhimurium (mm)
L1	Cecal of chick	9	15	12
L2	KACC10771	0	0	0
L3	Cecal of chick	0	15	0
L4	Cecal of chick	0	0	0
L5	Cecal of chick	12	0	0
L6	Cecal of chick	0	0	0
L7	Cecal of chick	0	12	0
L8	Cecal of chick	0	13	0
L9	Dung of chick	0	0	0
L10	Dung of chick	0	0	0
L11	Dung of pig	0	0	14
L12	Dung of pig	0	0	13
L13	Dung of pig	0	12	0
L14	Dung of pig	0	0	0
L15	Soil of mountain	0	13	0
L16	KACC91016	0	14	0
L17	KCTC3600	0	9	0
L18	KCTC3145	0	9	0
L19	Soil of mountain	0	15	0
L20	Soil of mountain	0	9	0
L21	Soil of mountain	0	0	0
L22	Soil of mountain	0	0	0
L23	KCTC3928	0	12	0
L24	KCTC3109	0	14	0
L25	KACC10779	0	0	0
L26	KACC10251	0	11	0
L27	KCTC3112	0	13	0
L28	KCTC3194	0	14	0
L29	Soil of mountain	0	12	9
L30	Cecal of chick	11	13	13
L31	Dung of chick	0	12	0
L32	Dung of chick	0	13	0
L33	Dung of pig	0	0	0
L34	Dung of pig	0	15	0
L35	Dung of pig	0	0	0
L36	Dung of pig	9	12	0
L37	KACC10773	0	14	9
L38	KACC10213	0	13	11
L39	Soil of mountain	9	13	13
L40	KACC10557	0	0	0

L : lactic acid bacteria

(2) 본 발명 병원성미생물에 길항 유산균의 항균 스펙트럼 조사

상기 계대배양한 병원성미생물 Bacillus cereus, Candida albicans, Clostridium perfrigens, Escherichia coli, Haemophillus parasuis, Haemophillus simmunus, Listeria monocytogens, Mammheimia haemolytica type A, Pseudomonas aeruginosa, Pasteurella multocida type A, Staphylococcus aereus을 LB 배지에 전 배양하여, LB agar에 현탁액(1.0×10⁶ cfu/ml) 10 μL를 퍼지지 않게 주입하고 도말한 후 직경 5 mm의 Cokr Borer를 이용하여 구멍을 내었다. 상기 구멍에 MRS 배지에서 1일 배양한 배양액을 시린지 필터(0.2 μL)로 여과하여 각각 200 μL를 주입하고 35℃에서 20시간 배양후에 clear zone의 지름을 측정하였다.

상기 유산균의 항균활성 실험에서 항균활성이 높게 나온 BBG L1, L5, L29, L30, L36, L37, L39에 대해 병원성 미생물인 Bacillus cereus, Candida albicans, Clostridium perfrigens, Escherichia coli, Haemophillus parasuis, Haemophillus simmunus, Listeria monocytogens, Mammheimia haemolytica type A, Pseudomonas aeruginosa, Pasteurella multocida type A, Staphylococcus aereus에 대한 항균 스펙트럼을 조사하였다.

실험결과 [표 2]와 도 1에서 보는 바와 같이 BBG L1은 11개의 병원성 균주 중 9개의 병원성 미생물에 대한 항균 효과를 나타냈으며, L29는 9개의 병원성 미생물에 대한 항균효과를 나타냈고, L30은 L1과 같이 9개의 병원성 미생물에 대한 항균효과가 높게 나타났다.

본 발명 선별 유산균의 항균 스펙트럼 결과

BBG NO	L1 (mm)	L5 (mm)	L29 (mm)	L30 (mm)	L36 (mm)	L37 (mm)	L39 (mm)
Bacillus cereus	10	10	10	0	0	0	11
Candida albicans	0	0	0	0	0	0	0
Clostridium perfrigens	18	13	15	14	11	14	0
Escherichia coli	13	0	13	13	0	0	0
Haemophillus parasuis	14	15	12	11	11	12	13
Haemophillus simmunus	14	18	19	16	15	18	17
Listeria monocytogens	18	16	12	15	0	12	14
Mammheimia haemolytica type A	14	14	12	11	0	0	0
Pseudomonas aeruginosa	0	0	0	14	0	0	0
Pasteurella multocida type A	13	13	11	14	11	12	13
Staphylococcus aereus	14	12	9	11	0	14	11

L : Lactic acid bacteria

<실험예 2> 본 발명 미생물의 Amylase, Protease, Cellulase 분해능이 높은 균주 선발

(1) Amylase 분해능이 높은 균주 선발

2.0% soluble starch 첨가한 Nutrient agar 배지를 조제하였으며, 35℃에서 24시간 동안 배양한 후에 Gram's iodine을 균체를 배양한 녹말 한천 평판상에 한방울 씩 떨어뜨려 균체 주위에 투명환(Clear zone)이 큰 균주들을 선발하였다. 같은 방법으로 glucoamylase 분해능을 관찰하였다.

(2) Protease 분해능이 높은 균주 선발

1.0% skim milk 첨가한 Nutrient agar배지를 조제하였으며, 35℃에서 24시간 동안 배양한 후에 균체 주위에 투명환(Clear zone)이 큰 균주들을 선발하였다.

(3) Cellulase 분해능이 높은 균주 선발

0.5% carboxymethyl cellulose를 함유한 Nutrient Broth agar에 접종하여 37℃에서 배양하였다. 배양된 균들의 replica plate를 만들고 24시간 동안 배양한 후에 Gram's iodine을 균체를 배양한 녹말 한천 평판상에 한방울 씩 떨어뜨려 균체 주위에 투명환(Clear zone)이 큰 균주들을 선발하였다.

본 발명 미생물의 Amylase, Protease, Cellulase 분해능 측정 결과

BBG NO	Source	Protease (mm)	Amylase (mm)	Cellulase (mm)
B1	Soil of mountain	16	5	16
B2	Soil of mountain	10	5	8
B3	Soil of mountain	10	5	12
B4	Soil of mountain	10	6	12
B5	Soil of mountain	17	12	21
B6	Vinyl house	10	5	0
B7	Dung of pig(BS)	15	4	0
B8	Dung of pig	15	0	0
B9	Dung of pig	12	0	0
B10	Dung of pig	15	0	0
B11	Soil of vinyl house	15	0	0
B12	KCTC1662	7	4	0
B13	KCTC3709	8	0	0
B14	KCTC1507	8	5	0
B15	KCTC1509	8	6	0
B16	Dung of chick	8	6	0
B17	Dung of chick(BT)	13	0	0
B18	Dung of chick(BC)	12	0	10
B19	Dung of chick(BS)	13	0	0
B20	Dung of chick(BS)	15	4	13
B21	Dung of chick(BS)	5	0	0
B22	Soil of vinyl house	0	6	0
B23	KCTC3014	15	0	0
B24	Soil of vinyl house	13	5	0
B25	Soil of vinyl house	13	3	13

B : Bacillus

<실험예 3> 본 발명 미생물의 Xylanase, Phytase, Mannanase 분해능이 높은 균주 선발

(1) Xylanase 분해능이 높은 균주 선발

1.0% oat spelt xylan(sigma)를 함유한 Nutrient Broth agar에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 후에, Gram's iodine을 균체를 배양한 녹말 한천 평판상에 한방울 씩, 떨어뜨려 균체 주위에 투명환(Clear zone)이 큰 균주들을 선발하였다.

(2) Phytase 분해능이 높은 균주 선발

Phytase screening medium agar(glucose 1.5%, calcium phytate 0.5%, MgSO₄7H₂O 0.05%, KCI 0.05%, FeSO₄7H₂O 0.001%, MnSO₄7H₂O 0.001%, NH₄H₂PO₄ 0.5%, agar 2%)을 조성하였으며, 10N NaOH로 pH 5.5으로 조정하여 121℃, 15분 멸균하여 agar 배지를 조제하였다. 35℃ 2일 경과 후 주변에 clear zone이 큰 균주들을 선발하였다.

(3) Mannanase 분해능이 높은 균주 선발

0.5% Mannan를 함유한 Nutrient Broth agar에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 후에, Gram's iodine 균체를 배양한 녹말 한천 평판상에 한방울 씩 떨어뜨려 균체 주위에 투명환(clear zone)이 큰 균주들을 선발하였다.

Xylanase, Mannanase, Phytase 분해능 측정결과

BBG NO	Xylanase (mm)	Mannanase (mm)	Phytase (mm)
B1	16	14	0
B5	23	20	0
B20	14	14	0
B25	12	14	0

B : Bacillus

(4) 본 발명 바실러스에 대한 유기물 분해테스트 종합결과

바실러스에 대한 유기물(protease, amylase, cellulase)분해 효과에 대한 조사결과, protease 분비효과는 B5 > B1 > B20의 순으로 높게 나타났으며, amylase 분비효과는 B5 > B4 = B15 = B22 순으로 나타났고 cellulase 분비효과는 B5 > B2 > B1 > B20 > B25 순으로 나타났다. 종합적으로 판단했을 때 protease, amylase, cellulase를 모두 분비하는 미생물에 대한 효소분비 능력은 BBG B1, B5, B20, B25의 균주가 뛰어났다.

<실험예 4> 본 발명 효모에 대한 유기물 분해테스트

실시예 2, 3, 4와 같은 방법으로 효모에 대한 유기물(Protease, glucoamylase, cellulase)의 분해효과에 대한 조사하였다.

실험결과, [표 5]에 나타낸 바와 같이 BBG Y3, Y6가 유일하게 cellulase 분해 효과가 나타났다. cellulase의 효소분비가 나타난 BBG Y3, Y6의 균주를 이용하여 xylanase, mannanase, phytase의 효소분비 효과를 검사하였으며, 그 결과 xylanase, mannanase, phytase에 대한 효소분비는 2종 모두다 분비하지는 않은 것으로 나타났다(표 6).

본 발명 효모에 대한 Protease, glucoamylase, cellulase의 분해능 측정결과

BBG NO	Source	Protease(mm)	Glucoamylase(mm)	Cellulase(mm)
Y1	Soil of vinyl house(SC)	0	0	0
Y2	Soil of vinyl house(SC)	0	0	0
Y3	Soil of vinyl house(SC)	0	0	5
Y4	Soil of vinyl house(SC)	0	0	0
Y5	Soil of vinyl house(SC)	0	0	0
Y6	Soil of vinyl house(SC)	0	0	8
Y7	Dung of pig	0	0	0
Y8	KCTC7004	0	0	0
Y9	KCTC7238	0	0	0
Y10	KCTC7906	0	0	0
Y11	KCTC7118	0	0	0
Y12	Dung of pig	0	0	0
Y13	Dung of pig	0	0	0
Y14	Dung of pig	0	0	0
Y15	Dung of pig	0	0	0

Y : Yeast spp.

본 발명 Cellulase 분해능을 가진 효모에 대한 Xylanase, Mannanase, Phytase의 분해능 측정결과

BBG NO	Xylanase(mm)	Mannanase(mm)	Phytase(mm)
Y3	0	0	0
Y6	0	0	0

Y : Yeast spp.

<실험예 5> 본 발명 미생물 종균(유산균, 바실러스, 효모)의 후보균주 동정

선별한 균주(BBG L1, L29, L30, B1, B5, Y3, Y6)의 동정을 위해 생태학적, 생화학적 특성을 검토하여 Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology를 참고하여 균주 특성을 조사하였으며, 생화학적 실험은 Lactobacillus 속은 API50 CHL medium, Bacillus 속은 API50 CHB/E medium, Saccharomyces 속은 API20 C AUX Kit system을 이용하여 조사하였고, 유산균(BBG L1, L29, L30) 바실러스(BBG B1, B5)속의 균주동정은 16S rDNA 유전자 염기서열을 분석하였으며, 효모(BBG Y3, Y6)속의 균주동정은 18S rDNA 유전자 염기서열을 분석하였다.

(1) 본 발명 선별 균주의 생화학적 특성조사

선별된 유산균인 BBG L1, L29, L30, 바실러스 BBG B1, B5와 효모 균인 Y3, Y6의 균주의 동정을 위해 생태학적, 생화학적 특성을 검토하여 Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology를 참고하여 생리적, 생화학적 특성을 조사하였다. Cell type, spore formation은 현미경으로 관찰하여 조사하였으며, Colony color는 agar plate상에서 자라는 균체 콜로니의 색상을 보고 관찰하였으며, Gram stain은 gram 염색약을 사용한 염색법을 통하여, 현미경으로 관찰하여 gram (-), gram(+)을 결정하였으며, Oxidase reaction는 1% Tetramethyl-p-phenylenediamine dichloride용액을 agar 배지에서 배양한 균체를 여과지에 묻힌 후 떨어트려 청색이 나타나면 양성으로 나타내었다. Catalase reaction는 agar 배지에 3% 과산화 수소를 1 mL 가하고 5분 후에 기포가 발생되는 것을 양성으로 나타내었으며, Citrate utilization는 Simmon's citrate agar 배지에 배양된 균체에 bromthymol blue 지식약을 떨어트려 청색으로 변하면 양성으로 나타내었으며, Marked acidity from glucose는 glucose만을 첨가한 액상배지 에 미생물을 배양하여 pH가 산성으로 변화하면 양성으로 나타내었다.

실험결과, [표 7]에서 나타낸 바와 같이 BBG L1, L29, L30, B1, B5는 gram(+) 균으로 판명되었다. 분리된 유산균, 바실러스, 효모 모든 균은 citrate를 이용하였으며, glucose로부터 산을 분비하였다.

본 발명 선별 균주의 생화학적 특성

Test of characteristics	L1	L29	L30	B1	B5	Y6
Gram stain	+	+	+	+	+	fungi
Cell type	spherical	spherical	Rod	Rod	Rod	spherical
Colony color	White	White	White	Ivory	Ivory	White
Spore formation	-	-	-	+	+	+
Oxidase reaction	+	+	-	+	+	+
Catalase reaction	-	-	-	+	+	+
Urease reaction	-	-	-	+	+	-
Citrate utilization	+	+	+	+	+	+
Marked acidity from glucose	+	+	+	+	+	+

L : lactic acid bacteria, B : Bacillus, Y : Yeast

균주 특성 실험은 API kit system을 이용하여 조사하였으며, 실험결과 [표 8] 및 [표 9]에 나타낸 바와 같이 유산균은 BBG L30이 L1, L29에 비해 다양한 유기물을 이용하는 것으로 나타났으며, 바실러스균은 B1, B5의 똑같은 결과가 나타났다.

본 발명 선별 균주의 생화학적 특성

NO	Substrate	L1	L29	L30	B1	B5
1	Glycerol	-	-	-	+	+
2	Erythritol	-	-	-	-	-
3	D-Arabinose	-	-	-	-	-
4	L-Arabinose	+	+	+	+	+
5	Ribose	+	+	+	+	+
6	D-Xylos	+	+	-	+	+
7	L-Xylose	-	-	-	-	-
8	Adonitol	-	-	-	-	-
9	Methyl-D-xyloside	-	-	-	-	-
10	Galactose	+	+	+	+	+
11	Glucose	+	+	+	+	+
12	Fructose	+	+	+	+	+
13	Manose	+	+	+	+	+
14	Sorbose	-	-	-	-	-
15	Rhamnose	+	+	+	-	-
16	Dulcitol	-	-	+	-	-
17	Inositol	-	-		+	+
18	Mannitol	-	-	+	+	+
19	Sorbitol	-	-	+	+	+
20	α-Methyl-D-mannoside	-	-	+	-	-
21	α-Methyl-D-glucoside	-	-	+	+	+
22	N-Acetyl glucosamine	+	+	+	+	+
23	Amygdalin	-	+	+	+	+
24	Arbutin	+	+	+	+	+
25	Esculin	+	+	+	+	+
26	Salicin	+	+	+	+	+
27	Cellobiose	+	+	+	+	+
28	Maltose	-	+	+	+	+
29	Lactose	-	+	+	+	+
30	Melibiose	-	+	+	+	+
31	Sucrose	-	+	+	+	+
32	Trehalose	+	+	+	+	+
33	Inulin	-	+	-	+	+
34	Melezitose	-	-	+	-	-
35	Raffinose	-	+	+	+	+
36	Starch	-	-	-	+	+
37	Glycogen	-	-	-	+	+
38	Xylitol	-	-	-	-	-
39	Gentiobiose	+	+	+	+	+
40	D-Turanose	-	-	+	+	+
41	D-Lyxose	-	-	-	-	-
42	D-Tagatose	+	+	-	-	-
43	D-Fucose	-	-	-	-	-
44	L-Fucose	-	-	-	-	-
45	D-Arabitol	-	-	+	-	-
46	L-Arabitol	-	-		-	-
47	Gluconate	-	-	+	-	-
48	2 keto-gluconate	-	-	-	-	-
49	5 keto-gluconate	-	-	-	-	-

L : lactic acid bacteria, B : Bacillus, Y : Yeast

본 발명 선별 균주의 생화학적 특성

NO	Substrate	Read	NO	Substrate	Read
1	D-glucose	+	11	Methyl-aD-glucopyranoside	+
2	Glycerol	-	12	N-acetyl-glucosamine	-
3	Calclium 2-keto-gluconate	-	13	D-cellobiose	-
4	L-arabinose	-	14	D-lactose	-
5	D-xylose	-	15	D-maltose	+
6	Adonitol	-	16	D-saccharose	+
7	Xylitol	-	17	D-trehalose	+
8	D-galactose	+	18	D-melezitose	+
9	Inositol	-	19	D-rafinose	+
10	D-sorbitol	-

(2) 본 발명 선별 균주의 염기서열 분석

순수분리된 대표 유효세균을 각 세균을 바실러스(NB), 유산균(MRS), 효모(PDB)에 2일간 배양하여 Benzyl chloride법을 변형한 방법을 이용하여 DNA를 추출하였다. 16S rDNA의 PCR 증폭산물은 PCR Product Purification Kit(Qiagen)를 사용하여 정제하였으며, PCR 정제산물은 Genetic analyer 310A(Applied Biosystems)을 사용하여 염기서열을 분석하였다. 염기서열은 NCBI/Genebank와 Ribosomal Database Project II(RDP II)의 database에서 상동성 검색을 수행하고, CLUSTAL X 프로그램(Thompson et al., 1994) 및 PHYLIP 프로그램(Felsenstein, 1993)을 이용하여 계통학적 위치를 확인하였으며, 균주를 최종적으로 동정하였다.

실험결과, 유산균인 BBG L1은 Pediococcus acidilacticii 나타났으며(유전자 염기서열번호 1 및 도2), L29는 Pediococcus pentosaceus로 나타났고(유전자 염기서열번호 2 및 도3), L30은 Lactobacillus plantarum로 나타났다(유전자 염기서열번호 3 및 도4). 바실러스균인 BBG B1은 Bacillus tequilensis로 나타났으며(유전자 염기서열번호 4 및 도5), B5는 Bacillus amyloliquef aciens로 나타났다(유전자 염기서열번호 5 및 도6). 효모균인 BBG Y3, Y6을 동정하였으나 Y3의 경우 더블피크가 검출되어 순수분리가 되지 않은 것으로 판단되어, Y6만을 진행하였다. 그 결과 BBG Y6은 Saccharomyces cerevisiae로 나타났다(유전자 염기서열번호 6 및 도7).

<실험예 6> 본 발명 선별 균주의 길항효과 검정

(1) 본 발명 선별균주의 미생물간의 길항효과 검정

선별한 균주(BBG L1, L29, L30, B1, B5, Y6)의 길항 여부를 확인하기 위해, 항균활성 방법과 동일하게 하여 실험하였으며, 유산균에 대한 길항 효과는 MRS agar에서 확인하였으며, 바실러스에 대한 길항 효과는 NB agar에서, 효모에 대한 길항 효과는 PDB agar에서 확인하였다.

실험결과, 도 8에서 보는 바와 같이 유산균에 대한 효모, 바실러스, 유산균의 길항효과는 나타나지 않았으며, 효모에 대한 바실러스, 유산균의 길항효과는 나타나지 않았다. 바실러스에 대한 길항효과는 유산균(Pediococcus acidilactici BBG L1, Lactobacillus plantarum BBG L30)과, 효모(Saccharomyces cerevisiase BBG Y6) 배양액에서 Bacillus tequilensis BBG B1, Bacillus amyloliquefaciens BBG B5에 대한 길항효과를 나타내었다. 고체배지를 이용한 실험에서는 바실러스 2종에 대한 유산균과 효모의 길항효과가 나타났으나, 배양환경이 다르므로, 고상배양 시에는 다른 결과가 나올 수 있을 것으로 판단되어, 선별한 균주(BBG L1, L29, L30, B1, B5, Y6)를 이용하여 고상배양 테스트에 이용하였다.

(2) 본 발명 선별균주의 미생물간의 고상배양시 환경에 따른 성장능력 평가

고상배양테스트에서는 유산균으로 Pediococcus acidilactici BBG L1, Lactobacillus plantarum BBG L30를 혼합하여 사용하였으며, 효모는 Saccharomyces cerevisiase BBG Y6를 사용하였고, 바실러스는 Bacillus tequilensis BBG B1, Bacillus amyloliquefaciens BBG B5를 혼합하여 사용하였다.

pH에 따른 미생물 성장 검사는 HCl와 NaOH를 이용하여 배지의 pH를 각각 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 및 10.0으로 조정하여 테스트 하였으며 NaCl에 따른 미생물 성장 검사는 배지 전체중량%에 각각 0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0 및 10.0중량%을 첨가하여 테스트 하였고, 온도에 따른 미생물 성장 검사는 각각 10℃, 18℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃ 및 50℃에 배양하였다. 배양시 각 전 배양한 미생물을 준비하여 접종량은 배지 전체중량부 대비 1중량%를 접종하여 35℃, 150rpm, 2일 배양하여 성장여부를 판단하였으며, 유산균은 MRS, 바실러스는 NB, 효모는 PDB를 멸균하여 이용하였다.

실험결과, [표 10]에서 나타낸 바와 같이 pH 변화에 따른 유산균 Pediococcus acidilactici BBG L1, Lactobacillus plantarum BBG L30은 pH 4 ~ 10의 범위에서는 생육이 가능한 것을 확인하였으며 바실러스 Bacillus tequilensis BBG B1, Bacillus amyloliquefaciens BBG B5는 pH 4 ~ 9의 범위에서는 생육이 가능한 것을 확인하였고 효모 Saccharomyces cerevisiase BBG Y6는 pH 3 ~ 10의 범위에서는 생육이 가능한 것을 확인하였다.

또, NaCl 농도변화에 따른 유산균 Pediococcus acidilactici BBG L1, Lactobacillus plantarum BBG L30은 6.0%의 이하의 농도에서는 생육이 가능한 것을 확인하였으며 바실러스 Bacillus tequilensis BBG B1, Bacillus amyloliquefaciens BBG B5는 0 ~ 10.0%의 농도에서도 생육이 가능한 것을 확인하였고 효모 Saccharomyces cerevisiase BBG Y6는 0 ~ 10.0%의 농도에서도 생육이 가능한 것을 확인하였다(표 11).

또한, 온도 변화에 따른 유산균 Pediococcus acidilactici BBG L1, Lactobacillus plantarum BBG L30은 18 ~ 45℃의 온도에서는 생육이 가능한 것을 확인하였으며 바실러스 Bacillus tequilensis BBG B1, Bacillus amyloliquefaciens BBG B5는 18 ~ 50의 온도에서는 생육이 가능한 것을 확인하였고 효모 Saccharomyces cerevisiase BBG Y6는 10 ~ 50의 온도에서 생육이 가능한 것을 확인하였다(표 12).

본 발명 선별균주의 미생물간의 고상배양시 pH에 따른 성장능력 평가

pH	L1	L30	B1	B5	Y6
2	-	-	-	-	-
3	-	-	-	-	+
4	+	+	-	-	+
5	+	+	+	+	+
6	+	+	+	+	+
7	+	+	+	+	+
8	+	+	+	+	+
9	+	+	+	+	+
10	+	+	-	-	+

L : lactic acid bacteria, B : Bacillus, Y : Yeast

본 발명 선별균주의 미생물간의 고상배양시 NaCl 농도에 따른 성장능력 평가

NaCl(%)	L1	L30	B1	B5	Y6
0	+	+	+	+	+
2	+	+	+	+	+
4	+	+	+	+	+
6	+	+	+	+	+
8	-	-	+	+	+
10	-	-	+	+	+

L : lactic acid bacteria, B : Bacillus, Y : Yeast

본 발명 선별균주의 미생물간의 고상배양시 온도에 따른 성장능력 평가

Temperature(℃)	L1	L30	B1	B5	Y6
10	-	-	-	-	+
18	+	+	+	+	+
25	+	+	+	+	+
30	+	+	+	+	+
35	+	+	+	+	+
40	+	+	+	+	+
45	+	+	+	+	+
50	-	-	+	+	+

L : lactic acid bacteria, B : Bacillus, Y : Yeast

<실험예 7> 본 발명 소맥피 발효물과 비발효물의 일반성분 및 아미노산 성분변화

소맥피에 미생물(Pediococcus acidilactici BBG-L1, Lactobacillus plantarum BBG-L30, Bacillus tequilensis BBG-B1, Bacillus amyloliquefaciens BBG-B5, Saccharomyces cerevisiase BBG-Y6)을 1중량% 접종하여 수분함량을 50중량%가 되게 물을 첨가하였다. Growth chamber를 이용하여 35℃, 상대습도 95%으로 하여, 4일간 배양 및 발효를 진행한 후 건조시켜 시료로 이용하였다. 발효시킨 것과 발효시키지 않은 것의 일반성분(조단백, 조지방, 조섬유, 조회분)을 AOAC법에 의하여 정량하였고, 조단백질은 semi-micro Kjeldahl 법으로 측정하였다. 아미노산 17종에 대한 성분 비교를 amino acid auto analyzer(Amino acid analyzer S-433, Germany)를 사용하여 진행하였다.

실험결과, [표 13]에 나타낸 바와 같이 조단백질 성분은 발효물이 16.72%으로 비발효물의 15.09% 보다 1.63% 높게 나타났으며, 조지방 성분은 발효물이 2.84%, 비발효물이 3.44%로, 발효물보다 0.6% 높게 나타났다. 조회분 성분은 발효물이 5.10%으로 비발효물의 4.69% 보다 0.41% 높게 나타났으며, 조섬유 성분은 발효물이 9.79%으로 비발효물의9.11% 보다 0.78% 높게 나타났다. 칼로리는 발효물이 4.049cal/g으로 미발효물의 3,945 보다 104칼로리 높게 나타났다.

또한, [표 14]에 나타낸 바와 같이 17종 아미노산 성분함량은 비발효물인 Tyrosine(0.456%)성분이 발효물의 Tyrosine(0.441) 성분보다 높은 것을 제외하고는 16종(Alanine, Arginine, Aspartic acid, Cystein, Glutamic acid, Glycine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Proline, Serine, Threonine, Valine)의 아미노산 함량이 비발효물보다 발효물의 함량이 높게 나타났다.

본 발명 소맥피 발효물과 비발효물의 일반성분

Material	Crude Protein (%)	Crude Fat (%)	Crude Ash (%)	Crude Fiber (%)	Energy (cal)
Wheat bran	15.09	3.44	4.69	9.11	3,945
Fermented Wheat bran	16.72	2.84	5.10	9.79	4,049

본 발명 소맥피 발효물과 비발효물의 아미노산 함량

Contents	Wheat bran (%)	Fermented Wheat bran (%)
Alanine	0.744	0.833
Arginine	1.068	1.157
Aspartic acid	1.091	1.137
Cystein	0.275	0.284
Glutamic acid	2.718	2.878
Glycine	0.822	0.904
Histidine	0.439	0.482
Isoleucine	0.461	0.516
Leucine	1.039	1.136
Lysine	0.683	0.749
Methionine	0.178	0.181
Phenylalanine	0.617	0.696
Proline	0.968	1.051
Serine	0.663	0.709
Threonine	0.550	0.587
Tyrosine	0.456	0.441
Valine	0.666	0.721
Total	13.438	14.462

<실험예 8> 본 발명 선별 혼합균주의 소맥피 발효 최적조건 탐색

첨가 미생물 종류를 선택하기 위해, 균종(유산균+바실러스+효모, 유산균+효모, 유산균+바실러스, 유산균)을 달리하여, 배지 전체중량부의 1중량% 미생물을 소맥피에 접종하였고 수분이 50중량%가 되게 물을 첨가하였다. 1, 4, 7일간, 35℃에서 혐기조건에서 발효시켜, 경과일에 따른 생균수 및 pH 변화를 측정하였다. 고상 배양시 사용된 균주는 유산균은 Pediococcus acidilactici BBG-L1, Lactobacillus plantarum BBG-L30를 혼합하여 사용하였으며, 바실러스는 Bacillus tequilensis BBG-B1, Bacillus amyloliquefaciens BBG-B5를 혼합하여 사용하였고, 효모는 Saccharomyces cerevisiase BBG-Y6를 이용하였다.

실험결과, 도 9에서 보는 바와 같이 유산균 단일 배양 시에 1일 차에 1.2×10⁸cfu/g의 생균수가 검출되었으나, 발효 4일째 5.0×10⁶cfu/g이 나타났고, 발효 7일째에 1.0×10⁶cfu/g로 생균수가 검출되어, 발효일이 늘어나면 유산균의 생균수가 지속적으로 저하되는 현상이 나타났다.

유산균 + 바실러스 배양 시에 1일 차에 유산균 4.3×10⁸cfu/g, 바실러스 1.5×10⁶cfu/g 의 생균수가 검출되었으나 발효 4일째 유산균 7.0×10⁷cfu/g, 바실러스 1.3×10⁶cfu/g이 나타났고 발효 7일째에 유산균 6.7×10⁷cfu/g, 바실러스 1.5×10⁵cfu/g로 생균수가 검출되어 발효일이 늘어나면 유산균의 경우 유산균 단일 배양 시보다는 안정적인 상태로 된 것으로 판단되나, 바실러스의 생균수가 지속적으로 저하되는 현상이 나타났다(도 10).

유산균 + 효모 배양 시에 1일 차에 유산균 5.9×10⁶cfu/g, 효모 2.1×10⁶cfu/g의 생균수가 검출되었으나, 발효 4일째 유산균 4.2×10⁸cfu/g, 효모 3.3×10⁶cfu/g이 나타났고 발효 7일째에 유산균 6.0×10⁷cfu/g, 효모 1.0×10⁷cfu/g로 생균수가 검출되어 발효일이 늘어나면 유산균의 경우 유산균 단일 배양보다는 느리게 배양이 진행되는 것으로 나타났으며 안정성 부분에는 유리한 것으로 판단된다. 효모의 경우 느린 성장으로 인해, 발효 마지막 날에 배양이 되는 것으로 나타났다(도 11).

유산균 + 바실러스 + 효모 배양 시에 1일 차에 유산균 8.3×10⁷cfu/g, 바실러스 1.4×10⁶cfu/g, 효모 4.0×10⁶cfu/g 의 생균수가 검출되었으나 발효 4일째 유산균 2.2×10⁸cfu/g, 바실러스 1.2×10⁸cfu/g, 효모 3.2×10⁸cfu/g이 나타났고 발효 7일째에 유산균 1.110⁷cfu/g, 바실러스 2.210⁵cfu/g, 효모 3.210⁶cfu/g로 생균수가 검출되어 발효일이 늘어나면 유산균의 경우 유산균 단일 배양 시보다는 느리게 배양이 진행되는 것으로 나타났으며 안정성 부분에는 유리한 것으로 판단된다. 바실러스의 경우 발효 4일차에 급격하게 생장이 이루어 지는 것으로 나타났으며, 효모의 경우도 발효 4일차에 급격하게 증가하 하는 것으로 나타났다(도 12).

발효에 의한 pH 변화는 발효 1일 차는 유산균 단일 배양 시에 가장 낮게 나탔으며, 유산균 + 바실러스 + 효모 배양 시가 가장 높게 나타났다. 발효 4일 차는 유산균 단일 배양 시에 가장 낮게 나타났으며, 유산균 + 바실러스 + 효모 와 유산균 + 효모 배양 시에 높게 나타났다. 발효 7일 차는 유산균 단일 배양 시에 가장 낮게 나타났으며, 유산균 + 효모 배양 시에 가장 높게 나타났다(도 13).

미생물의 접종액의 균조성(1. 유산균, 2. 유산균+바실러스, 3. 유산균+효모, 4. 유산균+바실러스+효모)에 따라, 배양 패턴이 달라지는 것으로 나타났으며, 이상의 결과로 판단하였을 때, 발효사료 제조 시에는 유산균+바실러스+효모의 조성으로 결정하였고, 발효시간은 4일로 결정하였다.

<실험예 9> 본 발명 가금류용 발효사료 조성물의 부산물 혼합제제 탐색

상기 실험예 8의 방법에 따라 발효하였으며 발효물 부산물은 소맥피, 탈지대두박, 탈지미강, 옥테말분을 혼합하여 4일간 발효시켜 생균수 검사를 진행하였으며 그 조성은 하기 [표 15]에 나타낸 바와 같다.

본 발명 가금류용 발효사료 조성물의 부산물 혼합비율

No	탈지대두박(%)	소맥피(%)	탈지미강분(%)	옥테말분(%)
1	100	-	-	-
2	-	100	-	-
3	-	-	100	-
4	-	-	-	100
5	50	50	-	-
6	50	-	50	-
7	50	-	-	50
8	50	25	25	-
9	50	-	25	25
10	25	50	-	25
11	25	25	25	25

실험결과, 도 14에서 보는 바와 같이 유산균, 바실러스, 효모의 생균수를 보았을 때, 혼합 조성 시, 7(대두박 50%, 옥태말분 50%, 유산균 2.6×10⁹cfu/g, 바실러스 1.2×10⁴cfu/g, 효모 1.2×10⁴cfu/g)의 제형에서 유산균이 잘나온 것을 제외하고는, 단일 조성 시 보다 생균수가 적게나와 혼합 조성보다는 단일 조성으로 가는 것으로 결정하였다.

<실험예 10> 본 발명 가금류용 발효사료 조성물의 최적조건 탐색

(1) 본 발명 가금류용 발효사료의 당첨가 차이에 따른 미생물 변화 검사

실험예 9와 같은 방법으로 발효 시 당첨가(옥수수전분, 포도당, 자당, 가용성녹말)에 따른 생균수 및 pH 검사를 통해 발효상태를 검사하였다.

실험결과, 도 15에 보는 바와 같이 유산균의 경우 당 첨가 하였을 때 보다 무첨가구에서 높게 나타나 당 첨가에 의해 유산균이 생장하는데 이용하지 않은 것으로 판단된다. 또 바실러스의 경우 당 첨가 하였을때 대조구가 1.0×10⁵cfu/g로 나타났으며 포도당 첨가구가 2.3×10⁷cfu/g, 자당 첨가구가 2.6×10⁷cfu/g로 다른 실험구에 비해 높게 나타났다. 또한 효모의 경우 당 첨가 하였을 때 대조구가 2.2×10⁶cfu/g로 나타났으며 옥수수전분 첨가구가 1.6×10⁷cfu/g 가용성녹말 첨가구가 1.2×10⁷cfu/g로 다른 실험구에 비해 높게 나타났다.

(2) 본 발명 가금류용 발효사료의 배양법 차이에 따른 미생물 변화 검사

실험예 9와 같은 방법으로 발효 시 호기배양 혐기배양조건에 발효시켜 미생물 변화 경향을 검사하였으며 미생물 균종 변화(유산균+바실러스+효모, 바실러스)에 따른 차이를 검사하였다.

실험결과, 도 16에서 보는 바와 같이 호기 배양 시에는 효모의 개체수가 혐기 배양 시보다 높게 나타났으며, 유산균의 개체수는 호기는 보다 혐기 배양 시에 증가하는 것으로 나타났다.

(3) 본 발명 가금류용 발효사료의 배양온도 차이에 따른 미생물 변화 검사

실험예 9와 같은 방법으로 대두박을 이용한 발효 시 발효 온도(25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃) 차이에 따른 생균수 및 pH 검사를 통해 발효상태를 검사하였다.

실험결과 도 17에서 보는 바와 같이 유산균, 효모의 개체수는 25℃, 30℃ 배양 시에 35℃, 40℃, 45℃보다 높게 나타났으며 바실러스 개체수는 오히려 감소하는 것으로 나타났다.

(4) 본 발명 가금류용 발효사료의 미생물 접종량 차이에 따른 미생물 변화 검사

실험예 9와 같은 방법으로 대두박을 이용한 발효 시 혼합 미생물 접종량(1, 3, 5, 10%)에 차이에 따른 생균수 및 pH 검사를 통해 발효상태를 검사하였다.

실험결과, 도 18에서 보는 바와 같이 유산균의 개체수는 접종량에 관계없이 비슷한 개체수를 나타내었으며 바실러스는 개체수는 동일 비율로 혼합된 미생물 혼합액 10% 첨가 시에 증가하는 것으로 나타났으며, 효모는 5% 이상 접종 시에 증가하는 것으로 나타났다.

(5) 본 발명 가금류용 발효사료의 미생물 접종비율에 따른 미생물 변화 검사

유산균을 고효율로 배양하기 위한 최적 고상배양 조건(25℃, 혐기, 발효 4일, 수분함량 50%)으로 [표 16]과 같이 미생물을 조성하여, 미생물 조성비에 따른 발효상태를 검사하였다.

실험결과, 도 19에서 보는 바와 같이 유산균은 0.33%(5.2×10⁹cfu/g) 첨가구 보다는, 0.5% 첨가한 조성 비에서, 1.0×10¹⁰cfu/g 이상의 개체수가 나타났다. 효모는 첨가량이 증가함에 따라 비례적으로 증가하지 않았으나, 지금까지 테스트 한 결과에서 최대치가 10⁷ cfu/g수준으로 나타난 것이 10⁸ cfu/g수준으로 전체 테스트 시료에서 향상되었다. 바실러스는 첨가량에 따라 증가하는 경향이 있으나 미생물 개체수는 10⁶ cfu/g 수준으로 크게 증식되지는 않았다.

본 발명 가금류용 발효사료 조성물의 선별 균주의 혼합비율

No	Lactic acid bacterial(%)	Bacillus(%)	Yeast(%)
1	0.34	0.33	0.33
2	0.50	5.00	4.50
3	0.50	6.00	3.50
4	0.50	7.00	2.50
5	0.50	8.00	1.50
6	0.50	9.00	0.50

(6) 본 발명 가금류용 발효사료의 당첨가량 차이에 따른 미생물 변화 검사

유산균을 고효율로 배양하기 위한 최적 고상배양 조건(25℃, 혐기, 발효 4일, 수분함량 50%)으로 동일 비율로 혼합된 미생물의 접종량을 10중량%로 하였을 때 sucrose 농도(0중량%, 1중량%, 2중량%, 3중량%, 4중량%)에 따른 미생물 변화를 검사하였다.

실험결과, 도 20에서 보는 바와 같이 당첨가량에 따른 영향은 나타나지 않았으며, 전반적으로 유산균과 효모의 미생물 개체수가 효율적으로 증식되었다.

<실험예 11> 본 발명 가금류용 발효사료 조성물의 부산물 첨가에 따른 pH 및 생균수 검사

상기 실험예 9의 방법에 따라 발효하였으며 발효물 부산물은 소맥피, 탈지대두박, 탈지미강, 옥테말분, 두유박을 첨가하여 4일간 발효시켜 생균수 및 pH검사를 진행하였다.

실험결과, 도 21에서 보는 바와 같이 유산균, 바실러스, 효모의 생균수를 보았을 때 대두박(soybean meal) 발효물이 유산균 2.3×10⁹cfu/g, 바실러스 4.3×10⁶cfu/g, 효모 2.8×10⁷cfu/g으로 나타나 소맥피 발효 물에 비해 유산균 개체수가 많았으며 미강에 비해 효모, 바실러스 개체수가 많아 부형제 단일 사용 시, 대두박을 주원료로 결정하였다. 또, 발효물의 pH 측정결과 소맥피(6.40→4.4)0, 대두박(6.38→5.00), 두유박(5.50→4.70), 미강(5.96→4.73), 옥태말분(6.10→4.57)로 나타났으며, 대두박 발효물의 pH가 5.00으로 나타나, 유산균, 바실러스, 효모의 저장성이 다른 원료에 비해 유리한 것으로 판단되었다.

<실시예 1> 본 발명 가금류용 발효사료 조성물의 제조

페디오코크스 액시딜락티시(Pediococcus acidilacticii BBG L1, KCTC 12504BP)를 유효성분으로 함유하는 가금류용 발효사료 조성물을 제조하기 위해서는 발효 부형제로 대두박 및 미강을 단독으로 사용하는 것이 바람직하나, 이 중 혼합 미생물 배양을 위해서는 대두박을 단독으로 사용하는 것이 가장 바람직하다. 발효온도는 25 ~ 30℃에서 바람직하게는 25℃에서 발효시키는 것이 바람직하며, 발효 시간은 72 ~ 96시간 중 96시간을 발효하는게 가장 바람직하다. 수분함량은 50%로 맞추어주며 당 성분은 따로 첨가하지 않아도 미생물 생육이 잘되므로 당을 첨가하지 않으며 호기 배양보다는 통성혐기배양으로 발효하는게 바람직하다. 미생물의 첨가 비율은 혼합된 미생물 혼합액 10% 접종하는 것을 원칙으로 하며 유산균 배양액 0.5%, 효모 배양액 0.5%, 바실러스 배양액 9.0%로 하는 것이 가장 바람직하다. 상기 방법으로 하였을 때 2.3×10⁹cfu/g의 고농도의 발효사료 조성물을 제조하였다.

본 발명은 병원성 미생물의 항균활성을 가진 신규한 유산균을 제공하는 효과가 있을뿐 아니라, 영양학적, 기능적, 품질 측면에서 상기 유산균을 유효성분으로 함유하는 가금류용 발효사료 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 식품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

한국생명공학연구원 KCTC12504BP 20131014

<110> BIGBIOGEN CO., LTD <120> Poultry fermented feed composition containing the novel Lactic acid bacteria having anit-pathogenic microorganism <130> 01 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1483 <212> DNA <213> Pediococcus acidilactici BBG L1 <400> 1 ctatacatgc agtcgaacga acttccgtta attgattatg acgtgcttgc actgaatgag 60 attttaacac gaagtgagtg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcccagaagc 120 aggggataac acctggaaac agatgctaat accgtataac agagaaaacc gcctggtttt 180 cttttaaaag atggctctgc tatcacttct ggatggaccc gcggcgcatt agctagttgg 240 tgaggtaacg gctcaccaag gcgatgatgc gtagccgacc tgagagggta atcggccaca 300 ttgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccacaat 360 ggacgcaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa gggtttcggc tcgtaaagct 420 ctgttgttaa agaagaacgt gggtgagagt aactgttcac ccagtgacgg tatttaacca 480 gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttatc 540 cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg cggtctttta agtctaatgt gaaagccttc 600 ggctcaaccg aagaagtgca ttggaaactg ggagacttga gtgcagaaga ggacagtgga 660 actccatgtg tagcggtgaa atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg cgaaggcggc 720 tgtctggtct gtaactgacg ctgaggctcg aaagcatggg tagcgaaaca ggattagata 780 ccctggtagt ccatgccgta aacgatgatt actaagtgtt ggagggtttc cgcccttcag 840 tgctgcagct aacgcattaa gtaatccgcc tggggagtac gaccgcaagg ttgaaactca 900 aaagaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagctacgcg 960 aagaacctta ccaggtcttg acatcttctg ccaacctaag agattaggcg ttcccttcgg 1020 ggacagaatg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1080 gtcccgcaac gagcgcaacc cttattacta gttgccagca ttcagttggg cactctagtg 1140 agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggacgacgt caaatcatca tgccccttat 1200 gacctgggct acacacgtgc tacaatggat ggtacaacga gtcgcgaaac cgcgaggttt 1260 agctaatctc ttaaaaccat tctcagttcg gactgtaggc tgcaactcgc ctacacgaag 1320 tcggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta 1380 cacaccgccc gtcacaccat gagagtttgt aacacccaaa gccggtgggg taacctttta 1440 ggagctagcc gtctaaggtg ggacagatga ttagggtgaa gtc 1483 <210> 2 <211> 1472 <212> DNA <213> Pediococcus pentosaceus BBG L29 <400> 2 ggcgtgctat aatgcaagtc gaacgaactt ccgttaattg attatgacgt gcttgcactg 60 aatgagattt taacacgaag tgagtggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgccc 120 agaagcaggg gataacacct ggaaacagat gctaataccg tataacagag aaaaccgcct 180 ggttttcttt taaaagatgg ctctgctatc acttctggat ggacccgcgg cgcattagct 240 agttggtgag gtaacggctc accaaggcga tgatgcgtag ccgacctgag agggtaatcg 300 gccacattgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc 360 cacaatggac gcaagtctga tggagcaacg ccgcgtgagt gaagaagggt ttcggctcgt 420 aaagctctgt tgttaaagaa gaacgtgggt gagagtaact gttcacccag tgacggtatt 480 taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc 540 gttatccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcggt cttttaagtc taatgtgaaa 600 gccttcggct caaccgaaga agtgcattgg aaactgggag acttgagtgc agaagaggac 660 agtggaactc catgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatat ggaagaacac cagtggcgaa 720 ggcggctgtc tggtctgtaa ctgacgctga ggctcgaaag catgggtagc gaacaggatt 780 agataccctg gtagtccatg ccgtaaacga tgattactaa gtgttggagg gtttccgccc 840 ttcagtgctg cagctaacgc attaagtaat ccgcctgggg agtacgaccg caaggttgaa 900 actcaaaaga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagct 960 acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ttctgccaac ctaagagatt aggcgttccc 1020 ttcggggaca gaatgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1080 gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat tactagttgc cagcattcag ttgggcactc 1140 tagtgagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggac gacgtcaaat catcatgccc 1200 cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggatggtac aacgagtcgc gaaaccgcga 1260 ggtttagcta atctcttaaa accattctca gttcggactg taggctgcaa ctcgcctaca 1320 cgaagtcgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc 1380 ttgtacacac cgcccgtcac accatgagag tttgtaacac ccaaagccgg tggggtaacc 1440 ttttaggagc tagccgtcta aggtggacag at 1472 <210> 3 <211> 1461 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum BBG L30 <400> 3 ggacggcgtg ctataatgca gtcgaacgaa ctctggtatt gattggtgct tgcatcatga 60 tttacatttg agtgagtggc gaactggtga gtaacacgtg ggaaacctgc ccagaagcgg 120 gggataacac ctggaaacag atgctaatac cgcataacaa cttggaccgc atggtccgag 180 cttgaaagat ggcttcggct atcacttttg gatggtcccg cggcgtatta gctagatggt 240 ggggtaacgg ctcaccatgg caatgatacg tagccgacct gagagggtaa tcggccacat 300 tgggactgag acacggccca aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg 360 gacgaaagtc tgatggagca acgccgcgtg agtgaagaag ggtttcggct cgtaaaactc 420 tgttgttaaa gaagaacata tctgagagta actgttcagg tattgacggt atttaaccag 480 aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc 540 ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcaggc ggttttttaa gtctgatgtg aaagccttcg 600 gctcaaccga agaagtgcat cggaaactgg gaaacttgag tgcagaagag gacagtggaa 660 ctccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct 720 gtctggtctg taactgacgc tgaggctcga aagtatgggt agcaaacagg attagatacc 780 ctggtagtcc ataccgtaaa cgatgaatgc taagtgttgg agggtttccg cccttcagtg 840 ctgcagctaa cgcattaagc attccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct gaaactcaaa 900 ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gctacgcgaa 960 gaaccttacc aggtcttgac atactatgca aatctaagag attagacgtt cccttcgggg 1020 acatggatac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 1080 cccgcaacga gcgcaaccct tattatcagt tgccagcatt aagttgggca ctctggtgag 1140 actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga 1200 cctgggctac acacgtgcta caatggatgg tacaacgagt tgcgaactcg cgagagtaag 1260 ctaatctctt aaagccattc tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct acatgaagtc 1320 ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca 1380 caccgcccgt cacaccatga gagtttgtaa cacccaaagt cggtggggta accttttagg 1440 aaccagccgc ctaagtgaca g 1461 <210> 4 <211> 1483 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum BBG L30 <400> 4 ctatacatgc agtcgaacga acttccgtta attgattatg acgtgcttgc actgaatgag 60 attttaacac gaagtgagtg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcccagaagc 120 aggggataac acctggaaac agatgctaat accgtataac agagaaaacc gcctggtttt 180 cttttaaaag atggctctgc tatcacttct ggatggaccc gcggcgcatt agctagttgg 240 tgaggtaacg gctcaccaag gcgatgatgc gtagccgacc tgagagggta atcggccaca 300 ttgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccacaat 360 ggacgcaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa gggtttcggc tcgtaaagct 420 ctgttgttaa agaagaacgt gggtgagagt aactgttcac ccagtgacgg tatttaacca 480 gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttatc 540 cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg cggtctttta agtctaatgt gaaagccttc 600 ggctcaaccg aagaagtgca ttggaaactg ggagacttga gtgcagaaga ggacagtgga 660 actccatgtg tagcggtgaa atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg cgaaggcggc 720 tgtctggtct gtaactgacg ctgaggctcg aaagcatggg tagcgaaaca ggattagata 780 ccctggtagt ccatgccgta aacgatgatt actaagtgtt ggagggtttc cgcccttcag 840 tgctgcagct aacgcattaa gtaatccgcc tggggagtac gaccgcaagg ttgaaactca 900 aaagaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagctacgcg 960 aagaacctta ccaggtcttg acatcttctg ccaacctaag agattaggcg ttcccttcgg 1020 ggacagaatg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1080 gtcccgcaac gagcgcaacc cttattacta gttgccagca ttcagttggg cactctagtg 1140 agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggacgacgt caaatcatca tgccccttat 1200 gacctgggct acacacgtgc tacaatggat ggtacaacga gtcgcgaaac cgcgaggttt 1260 agctaatctc ttaaaaccat tctcagttcg gactgtaggc tgcaactcgc ctacacgaag 1320 tcggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta 1380 cacaccgccc gtcacaccat gagagtttgt aacacccaaa gccggtgggg taacctttta 1440 ggagctagcc gtctaaggtg ggacagatga ttagggtgaa gtc 1483 <210> 5 <211> 1450 <212> DNA <213> Bacillus tequilensis BBG B1 <400> 5 catggcggcg tgctatacat gcaagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt 60 agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg 120 aaaccggggc taataccgga tgcttgtttg aaccgcatgg ttcaaacata aaaggtggct 180 tcggctacca cttacagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca 240 ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac 300 ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 360 ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag 420 aacaagtgcc gttcaaatag ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 480 actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc 540 gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga 600 gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc 660 ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa 720 ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780 ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc 840 attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg 900 gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg 960 tcttgacatc ctctgacaat cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg 1020 tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 1080 caacccttga tcttagttgc cagcattcag ttgggcactc taaggtgacg ccggtgacaa 1140 accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1200 gtgctacaat gggcagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat 1260 ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa 1320 tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1380 ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct tttggagcca gccgccgaac 1440 gtgacgaatg 1450 <210> 6 <211> 1064 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefaciens BBG B5 <400> 6 tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta aagaaattta ataattttga aaatggattt 60 ttttgttttg gcaagagcat gagagctttt actgggcaag aagacaagag atggagagtc 120 cagccgggcc tgcgcttaag tgcgcggtct tgctaggctt gtaagtttct ttcttgctat 180 tccaaacggt gagagatttc tgtgcttttg ttataggaca attaaaaccg tttcaataca 240 acacactgtg gagttttcat atctttgcaa ctttttcttt gggcattcga gcaatcgggg 300 cccagaggta acaaacacaa acaattttat ctattcatta aatttttgtc aaaaacaaga 360 attttcgtaa ctggaaattt taaaatatta aaaactttca acaacggatc tcttggttct 420 cgcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga tacgtaatgt gaattgcaga attccgtgaa 480 tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc cttggtattc cagggggcat gcctgtttga 540 gcgtcatttc cttctcaaac attctgtttg gtagtgagtg atactctttg gagttaactt 600 gaaattgctg gccttttcat tggatgtttt ttttccaaag agaggtttct ctgcgtgctt 660 gaggtataat gcaagtacgg tcgttttagg ttttaccaac tgcggctaat ctttttttat 720 actgagcgta ttggaacgtt atcgataaga agagagcgtc taggcgaaca atgttcttaa 780 agtttgacct caaatcaggt aggagtaccc gctgaactta agcatatcaa taagcggagg 840 aaagaaaccg cgaggttaag ccaatcccac aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg 900 caactcgact gcgtgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat 960 acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt 1020 cggtgaggta accttttgga gccagccgcc gaacgtgacg aatg 1064

Claims (6)

1. 병원성 미생물 살모넬라 갈리나룸(S. gallinarum), 살모넬라 플로룸(S. pullorum), 살모넬라 티피무리움(S. typhimurium)에 모두 항균활성을 가지며 분리원이 닭의 맹장 유래인 것이 특징인 페디오코크스 액시딜락티시(Pediococcus acidilactici BBG L1, 수탁번호 KCTC12504BP) 미생물 균주.
   
2. 제 1항 기재의 미생물 페디오코크스 액시딜락시티 BBG L1 균주를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 가금 난계 대점염 및 어린병아리 백색설사병 예방 및 치료용 약학적 조성물.
   
3. 삭제
4. 제 1항 기재의 페디오코크스 액시딜락티시 BBG L1 미생물 균주를 25 ~ 30℃에서 72 ~ 96시간 수분함량 50%로 조절하여 통성혐기적 조건으로 발효하여 제조되는 미생물 균주 배양액.
   
5. 제 4항 기재의 페디오코크스 액시딜락티시 BBG L1 미생물 균주 배양액 0.5 ~ 0.7%(v/v), 효모 배양액 0.5 ~ 0.7%(v/v), 바실러스 배양액 8.0 ~ 9.0%(v/v)의 비율로 혼합된 미생물 혼합액 10%(v/v)를 접종하고 배양하여서 수득된 병원성 미생물 살모넬라 갈리나룸(S. gallinarum), 살모넬라 플로룸(S. pullorum), 살모넬라 티피무리움(S. typhimurium)균주 전부에 항균활성을 가지는 사료 조성물.
   
6. 제 5항 기재의 사료 조성물을 유효성분으로 함유하는 것이 특징인 가금류용 사료 첨가제.

Images