KR100627428B1 - 미생물 오염을 방지하는 페디오코커스 펜토사세우스 st-01 및 그의 제조방법 - Google Patents

미생물 오염을 방지하는 페디오코커스 펜토사세우스 st-01 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미생물의 오염을 방지하는 미생물 균주들 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 본 발명은 새로운 페디오코커스 속(Pediococcus sp.) 균주, 이를 토양으로부터 분리하는 방법 그리고 이를 미생물의 오염을 방지하는 데 사용하는 용도에 관한 것으로서, 상기 방법으로 분리한 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)는 미생물의 발효 과정에서 일어날 수 있는 미생물의 오염을 효과적으로 방지하여 2차적인 부패 및 악취 등을 제거하며 병원균 발생 등을 억제할 수 있으므로, 가축 생균제, 기능성 화장지, 기능성 식품 및 영양제, 기능성 사료 첨가제, 환경 개선제 및 각종 효소제제 등으로 널리 개발될 수 있다.
페디오코커스 속 균주, 미생물의 오염 방지, 토양으로부터 분리한 미생물, 가축 생균제, 기능성 사료 첨가제

Description

미생물 오염을 방지하는 페디오코커스 펜토사세우스 ST-01 및 그의 제조방법{Pediococcus Pentosaceus ST-01 for preventing microbial contamination and method for preparing the same}
도 1은 본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) ST-01의 MRS 배지를 이용한 성장 곡선을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) ST-01의 아밀라아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 자일라나아제 및 파이타아제 활성을 MRS 아가 플레이트 상에서 조사하여 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스 ST-01의 내산성을 pH 2.0 ~ 5.0 범위에서 조사하여 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스 ST-01의 내열성을 30 ~ 60℃ 범위에서 조사하여 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스 ST-01의 내담즙산성을 다양한 염 농도에서 조사하여 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스 ST-01의 MRS 배지를 이용한대장균 생육 억제 정도를 조사하여 나타낸 것이다.
본 발명은 미생물의 오염을 방지하는 미생물 균주들 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 본 발명은 새로운 페디오코커스 속(Pediococcus sp.) 균주, 이를 토양으로부터 분리하는 방법 그리고 이를 미생물의 오염을 방지하는 데 사용하는 용도에 관한 것이다.
자연 흙 속에는 많은 원소들이 있고, 이 중에는 알려지지 않은 많은 성분들이 함께 존재하고 있다. 특히, 자연 흙 속에는 사람을 구성하는 원소 99만 가지와 정확히 일치하는 원소 99만 가지가 있다고 한다. 따라서 사람에게도 질서가 있듯이 흙 속에도 질서가 있다. 흙 속에서 사는 토착 미생물은 수분과 산소를 공급하여 끊임없이 조건과 환경을 변형하며 맞추어 살아가는 데, 수분과 영양이 없으면 미생물은 활동하지 않고 마취 상태로 들어가게 된다.
흙을 미생물 분해에 의하여 완전히 효소화한 미네랄 효소는, 흙을 미생물에 의하여 300매시 이상 분해가 될 때까지 수분과 산소를 공급하면서 환경에 변화를 주어 분해시킨 흙 효소라고도 할 수 있는 데, 우리 인체도 흡수할 수 있고 작물도 흡수할 수 있는 형태이다. 이와 같이 흙은 안정화를 이루어 미네랄 효소로 인한 분해를 진행하고 부패를 방지하며 악취를 제거하여 깨끗한 환경을 만든다.
실제로 흙 속에는 한 스푼에도 2억 마리 이상의 미생물이 살고 있고, 이러한 미생물들이 환경을 바꾸어 가면서 흙 자체를 효소화 하는 과정을 진행하고 있다. 토양 속에 살고 있는 미생물을 잘 활성화시키면 300매시 이상의 미립자로 모든 물질 분해할 수 있는 데, 기계를 이용한 어떠한 방법도 이와 같이 300매시 이상으로 분해할 수는 없다.
발명자들은 자연 환경 속에서 각자 자기 역할을 하는 미생물들을 그대로 훈련 배양시키는 오염원의 처리 방법을 수행한 결과, 악취가 제거되는 것은 물론 기타 분해 효과도 탁월한 점을 발견하고 자연에 순응하는 단순한 방법이 부작용이 없이 환경에 적응하여 미생물에 의한 2차 오염과 병원균의 발생을 효과적으로 억제시킬 수 있음을 확인한 바 있었다.
또한, 최근 많은 사람들이 건강에 대해 깊은 관심을 가지면서 건강에 악 영향을 미칠지 모르는 위해 요소에 대한 인식이 점차 높아지고 있으며, 이로 인해 안전성이 높은 식품에 대한 선호도가 증가하고 소비자의 지출이 식품 안전성에 더욱 비중을 두게 되었다. 따라서 항생제의 사용을 최소화할 수 있는 다양한 방법이 개발 시도되고 있으며, 안전성에 기능성을 도입한 각종 신제품의 생산이 필요한 실정이다.
실제로 축산물 개발에 있어서, 집약적 사육 방식으로 인해 각종 병원균의 감염 가능성 및 항병력 약화, 질병 예방을 위한 항생제 과용의 위험성, 축산물 내 환경 호르몬 및 잔류 항생제 축적의 증가 그리고 환경 오염으로 인한 사료 자원의 오염 등이 큰 문제가 되고 있다. 따라서 건강 증진을 위한 기능성 축산의 생산에 대한 필요가 증가하여 고품질 안전 축산물의 생산 기술의 개발이 요구되는 바이다.
이에 본 발명자는 토양으로부터 유익한 미생물을 분리하기 위하여 노력을 계속한 결과, 미네랄을 다량 함유하는 토양으로부터 미생물의 오염을 방지하는 페디오코커스 속 균주를 분리하고, 이를 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) ST-01로 동정한 다음 이 균주가 가축 생균제 등으로 효과적으로 적용될 수 있는 점을 확인함으로써 본 발명을 성공적으로 완성하였다.
본 발명은 새로운 페디오코커스 펜토사세우스 ST-01, 이를 토양으로부터 분리하는 방법 및 이를 미생물의 오염을 방지하는 데 사용하는 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미생물의 오염을 방지하는 페디오코커스 펜토사세우스 ST-01를 제공한다.
또한, 본 발명은 페디오코커스 속(Pediococcus sp .) 균주를 가축 생균제, 환경 개선제, 기능성 식품 및 영양제 및 각종 효소제제 등으로 사용하는 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 새로운 페디오코커스 속(Pediococcus sp .) 균주를 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 토양으로부터 분리한 페디오코커스 속 균주, 바람직 하게는 미네랄 토양으로부터 분리한 페디오코커스 속(Pediococcus sp .) 균주를 제공한다.
본 발명의 페디오코커스 속(Pediococcus sp.) 균주는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)인 것이 바람직하고, 페디오코커스 펜토사세우스(pediococcus pentosaceus) ST-01 균주인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스 균주는 Pediococcus pentosaceus ST-01 라고 명명하고, 국제기탁기관인 한국 미생물 보존 센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 2006년 04월 07일자로 기탁하고(기탁 번호: KFCC - 11369P), 동균주 ST-01(Pediococcus pentosaceus)를 동센터에 2006년 05월 04일 기탁번호 KCCM-10748P로 기탁하였다.
또한, 본 발명은 토양으로부터 페디오코커스 펜토사세우스 ST-01를 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스 ST-01은 미생물의 오염을 방지하는 용도를 제공한다. 본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스 ST-01은 대장균(Escherichia coli)을 포함하는 미생물의 2차적 오염을 효과적으로 방지한다. 이 때 미생물로는 대장균 이외에도 병원성을 가지는 모든 미생물을 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 페디오코커스 펜토사세우스 ST-01를 유효 성분으로 하는 가축 생균제를 제공한다. 상기 가축 생균제는 가축 사료 첨가제로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 페디오코커스 펜토사세우스 ST-01를 유효 성분으로 하는 환경 개선제를 제공한다. 상기 페디오코커스 펜토사세우스 ST-01은 기능성 화장지에 사용될 수 있다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 토양으로부터 페디오코커스 속 균주의 분리 및 동정
본 발명은 토양으로부터 페디오코커스 속(Pediococcus sp.) 미생물을 분리하기 위하여, 토양 시료를 0.02% NaN3 가 포함되어 있는 MRS 아가 배지에 뿌리고, 37℃에서 24시간 동안 배양하여 5개의 균주를 1차적으로 선발하였다.
상기에서 선발된 균주를 이용하여 다시 콜로니(colony) 형태 및 그램 양성 등을 기준으로 하여 2차적으로 5개의 균주를 분리하였다. 이들 중 생육이 뛰어난 1개 균주를 선택한 다음 API 50 CHL 키트 (바이오메리우, 프랑스)를 사용하여 당 발효 실험을 수행하고 페디오코커스 속 균주로 동정하였다. 이와 같이 선택한 페 디오코커스 속 균주는 다시 3 ~ 4회 걸친 계대 배양으로 활성화시켰다. 상기 균주는 MRS 배지를 사용하여 배양하였고, 37℃에서 24시간 동안 배양하여 다음 실험을 위하여 글리세롤 저장법 (glycerol stock)으로 보존하였다.
구체적으로, 본 발명에서 분리한 페디오코커스 속 균주는 통상의 혐기성 균주이면서 그램 양성 구균인 것으로 확인되었다. 또한, 이 페디오코커스 속 균주 중에서도 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) (99.9%)인 것으로 확인되었다 (표 1 참조).
또한 상기 페디오코커스 속 균주의 16S rRNA 서열을 분석한 결과, 페디오코 커스 속 균주의 1,501개의 염기 서열로부터 페디오코커스 펜토사세우스 균주인 것으로 다시 확인되었다 (서열목록 참조). 따라서, 본 발명의 페디오코커스 속 균주는 미생물 제제로서 사용할 수 있는 안전성이 탁월한 젖산균인 것을 알 수 있었다.
API 50 CHL 키트를 사용한 페디오코커스 속 균주의 당 발효 실험 결과
당 기질 결과 당 기질 결과
대조군 - 에스큘린 +
글리세롤 - 살리신 +
에리트리톨 - 셀로바이오스 +
D-아라비노스 - 말토스 +
L-아라비노스 + 락토스 +
리보스 + 멜리바이오스 -
D-자일로스 + 슈크로스 -
L-자일로스 - 트레할로스 +
아도니톨 - 인린 -
β-메틸-D-자이로스 - 멜레지토스 -
갈락토스 + 라피노스 -
글루코스 + 스타치 -
과당 + 글리코겐 -
만노스 + 자일리톨 -
소보스 - 젠티오바이오스 +
람노스 + D-튜라노스 -
둘시톨 - D-라이조스 -
이노시톨 - D-타가토스 +
만니톨 - D-퓨코스 -
소비톨 - L-퓨코스 -
α-메틸-D-만노사이드 - D-아라비톨 -
α-메틸-D-글루코사이드 - L-아라비톨 -
N-아세틸-글루코사민 + 글루코네이트 -
아미그달린 + 2-케토-글루코네이트 +
아부틴 + 5-케토-글루코네이트 -
실시예 2. 페디오코커스 속 균주의 성장 특성 조사
본 발명은 상기 페디오코커스 속(Pediococcus sp .) 균주의 성장 곡선을 조사하기 위하여, MRS 배지를 사용하여 발효기 (jar fermenter)에서 pH 를 조절하지 않고 37℃에서 6시간 가격으로 시료를 모아 (sampling) 48시간 동안 배양하였다.
또한 상기 페디오코커스 속 균주의 총 생균수를 측정하기 위하여, 시간별로 배양액을 0.85% NaCl 용액을 사용하여 10배 연속적으로 희석시킨 다음 MRS 아가 플레이트에 0.1 mL씩 분주하여 도말하였다. 그 다음 상기 균주의 배양 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 배양하고 이로부터 콜로니 형성 단위 (colony forming unit)를 측정하였다.
상기 페디오코커스 속 균주의 최적의 성장 조건을 조사한 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이 24시간 동안 배양하면 최고점, 즉 4.3 × 109 CFU/ml 농도에 이르는 것으로 조사되었다. 그러나, 최대 성장기인 6시간부터 12시간 사이에 균주를 사용하는 것이 여러 가지 활성의 측면에서 바람직할 것으로 판단되었다.
실시예 3. 페디오코커스 속 균주의 효소 생성 조사
본 발명은 페디오코커스 속(Pediococcus sp .) 균주의 효소 생성 여부를 조사하기 위하여, 상기 균체를 하기 표 1 및 표 2 에서 제시한 바와 같이 검색 배지를 이용하여 나타나는 투명환(clear zone)의 유무로 특정 효소의 분비 여부를 검사하였다.
구체적으로, 프로테아제(protease), 자일라나아제(xylanase) 및 파이타아제(phytase)는 상기 균체 배양 직후 바로 투명환의 유무를 확인할 수 있었고, 셀룰라아제(cellulase)의 경우는 0.2%(w/v) 콩고 레드(congo red)액으로 염색하고 1 M NaCl 로 씻어내어 투명환을 확인하였다. 또한, α-아밀라제(α-amylase)의 경우는 0.2%(w/v) I2 와 4%(w/v) KI 를 포함하는 용액으로 염색하여 투명환의 생성 여부를 확인하였다.
그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 각 효소의 기질로 첨가한 검색 배지 상의 투명환의 크기로 볼 때 본 발명의 페디오코커스 속 균주는 아밀라아제, 셀룰라아제, 프로테아제, 자일라나아제 및 파이타아제의 활성을 포함하고 있는 것으로 나타났다. 특히 프로테아제 및 아밀라아제 그리고 인을 분해하는 파이타제의 활성이 탁월하여 상업적으로 이용이 가능할 것으로 판단되었다.
효소 생성 여부를 조사하기 위한 검색 배지 및 염색약
효소 기질 (기초 배지: PDA) 염색약 확인법
프로테아제 2%(w/v) 스킴 밀크 투명환
셀룰라아제 1%(w/v) CM 셀룰로스 0.2%(w/v) 콩고 레드 투명환
아밀라아제 1%(w/v) 수용성 전분 0.2%(w/v) I2 + 4%(w/v) KI 투명환
자일라나아제 1%(w/v) 오트 스펠트 자일란 투명환
검색 배지의 조성
성분 함량 (g/L)
포도당 15
파이틱산, 칼슘 염 5
NH4NO3 5
MgSO4 · 7H2O 0.5
KCl 0.5
FeSO4 · 7H2O 0.01
MnSO4 · 4H2O 0.01
아가 15
실시예 4. 페디오코커스 속 균주의 내산성 , 내열성 및 내담즙산성 특성 조사
본 발명은 페디오코커스 속(Pediococcus sp .) 균주의 다양한 특성을 조사하기 위하여, 먼저 상기 균체를 MRS 배지에 1% 되도록 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 0.1 N HCl 을 사용하여 pH 5.0, 4.0, 3.0 및 2.0 에서 30분 동안 정치시키고 잔존한 미생물 수를 측정하여 내산성 여부를 조사하였다.
또한, 상기 균체를 배양하고 그 배양액을 각각 30℃, 40℃, 50℃ 및 60℃에서 10분 동안 정치시킨 다음 생존한 미생물 수를 측정하여 내열성을 분석하였다. 또한, 담즙 염 (bile salt)을 각각 0, 0.1, 0.3, 0.5 및 1%(w/v) 농도로 첨가한 MRS 배지에 상기 균주를 접종하고 37℃에서 6시간 동안 방치한 다음 각 배지 0.1 mL 을 MRS 아가 플레이트에 도말하여 나타난 미생물 수를 측정하여 내담즙산성을 조사하였다.
그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 페디오코커스 속 균주는 pH 2에서는 사멸하지만, pH 3 에서도 3.38 × 106 CFU/ml의 균수가 측정되었으므로 활용 가능성이 있다고 판단되었다. 또한, 도 4 에 나타난 바와 같이 60℃에서도 2.67 × 104 CFU/ml의 균수가 측정되어 내열성에 있는 것으로 확인되었다. 또한, 도 5에 나타난 바와 같이 담즙 염 1% 에서도 높은 균수를 나타내어 내담즙산성이 우수한 것으로 조사되었다.
실시예 5. 페디오코커스 속 균주의 대장균 생육 억제 효과 조사
본 발명은 페디오코커스 속 균주의 대장균 생육 억제 효과를 조사하기 위하여, 대장균 생육억제 효과를 측정하기 위해 사용할 균주인 페디오코커스 속(Pediococcus sp .) 및 대장균(Escherichia coli)를 각각 해당되는 배지를 사용하여 24시간 동안 배양하다. 이 때 영양 배지(nutrient broth)에는 대조군인 대장균만 접종하고, MRS 배지에는 페디오코커스 속 균주 및 대장균을 각각 1% 씩 혼합 접종하였다. 접종된 액상 배지를 37℃에서 150 rpm으로 진탕 배양하면서 3시간 간격으로 배양액을 채취하였고, 이렇게 얻은 채취액은 다시 멸균 생리식염수로 희석하여 영양 아가 배지에 도말하였다. 이 배지를 37℃에서 24시간 동안 배양하여 나타난 균락으로부터 대장균 수를 측정하여 대장균 생육 억제 정도를 조사하였다.
그 결과 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 페디오코커스 속 균주를 12시간 동안 배양하는 경우 대장균은 완전히 사멸되었으며, 따라서, 본 발명의 페디 오코커스 속 균주는 대장균의 생육 억제 효과가 우수한 것으로 판단되었다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 새로운 페디오코커스 속(Pediococcus sp .) 균주, 이를 토양으로부터 분리하는 방법 및 이를 미생물의 오염을 방지하는 데 사용 하는 용도에 관한 것으로서, 상기 방법으로 분리한 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) 균주 등은 미생물의 발효 과정에서 일어날 수 있는 미생물의 오염을 효과적으로 방지하여 2차적인 부패 및 악취 등을 제거하며 병원균 발생 등을 억제할 수 있으므로, 가축 생균제를 비롯하여 기능성 화장지, 기능성 식품 및 영양제, 기능성 사료 첨가제, 환경 개선제 및 각종 효소제제 등으로 널리 사용될 수 있다.

Claims (7)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 토양으로부터 분리하여 미생물의 오염을 방지하는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) ST-01 (기탁번호: KFCC-11369P, KCCM-10748P).
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 3항의 페디오코커스 펜토사세우스 ST-01를 유효 성분으로 하는 환경 개선제.
  7. 제 6항에 있어서, 기능성 화장지에 사용되는 것을 특징으로 하는 환경 개선제.
KR1020060042136A 2006-05-10 2006-05-10 미생물 오염을 방지하는 페디오코커스 펜토사세우스 st-01 및 그의 제조방법 KR100627428B1 (ko)

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