KR101477228B1 - 감마-아미노부티르산 생산능이 있는 신규한 락토바실러스 플랜타룸 ｋ154 균주 - Google Patents

감마-아미노부티르산 생산능이 있는 신규한 락토바실러스 플랜타룸 ｋ154 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA) 생산능력이 우수한 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154(KACC91727P) 균주에 관한 것이다. 종래에 발견된 젖산균보다 내담즙성, pH 내성 및 GABA 생성 능력이 뛰어나므로, 상기 균주를 배양하여 이용하면 고함량의 GABA가 포함된 발효식물 추출물 등의 기능성 식품을 제조할 수 있다.

Description

감마-아미노부티르산 생산능이 있는 신규한 락토바실러스 플랜타룸 Ｋ154 균주{Novel strains Lactobacillus plantarum K154 with high gamma-aminobutyric acid activity}
본 발명은 감마-아미노부티르산 생산능이 있는 신규한 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154 균주에 관한 것이다.
감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA)은 미생물, 식물 및 동물 등 자연계에 분포하는 비단백질 아미노산의 일종이다. GABA는 글루탐산(glutamic acid)의 탈탄산반응(decarboxylation)에 의해 생산되는 식물 및 미생물의 대사산물로서, 뇌에서 억제성 신경전달물질로서 작용하여 스트레스로 인한 불안감, 초조감을 진정시키는 기능을 한다. 미생물 발효를 통해 만들어지는 전통음식에는 GABA를 함유하고 있는데, GABA는 안전하고, 친환경적인 성분으로서 이를 포함한 새로운 건강기능식품으로의 개발 가능성이 있다.
GABA의 합성은 글루타메이트 디카르복실라아제(glutamate decarboxylase)에 의해 일어나는데, 최적 발효조건은 주로 상기 효소의 생화학적 특성을 기초로 하게 된다. GABA를 주로 생산하는 미생물은 젖산균(lactic acid bacteria)인데, 이는 음식 부패 병원균을 자라지 못하게 하고, 장내에서 프로바이오틱스(probiotics)로 작용하는 균주이다. 미생물 발효를 통한 GABA의 생산에 있어서 주로 영향을 미치는 인자는 온도, pH, 발효 시간 및 배지조성물이다. 따라서 다양한 미생물의 배양시, 이러한 인자들을 최적화하여 GABA를 대량생산하려는 연구들이 활발히 진행되고 있다. 현재 GABA는 현미, 녹차, 맥아, 배추 등에 자연적으로 약간 함유되어 있으나, 그 함량이 낮아 자연 식품으로 섭취하는 양으로는 생리활성을 기대하기 어려운 실정이다.
GABA를 생산하는 젖산균에 관한 연구(Nomura et al. International Journal of Systematic Bacteriology. 49, 163, 1999)로 Lactococcus lactis가 GABA를 생산하는 능력이 있음을 밝힌 바 있으나 높은 GABA 생성 젖산균으로 발효식물추출물에 이용된 사례는 없다.
한편, 한국출원번호 제10-2010-0068711호, 한국등록특허 제0549094호, 한국등록특허 제0631857호, 한국등록특허 제0755508호 등에서 GABA 생산 균주 및 이를 이용한 감마-아미노부티르산의 생산방법에 대해 개시하고 있으나, 본 발명자들이 분리한 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154 균주에 대해서는 언급이 없다. 따라서, 본 발명자들은 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154 균주를 김치에서 분리하고 상기 균주가 GABA 생성능이 우수하다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 GABA 생성능이 우수한 신규한 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154(KACC91727P) 균주를 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA) 생산능력이 우수한 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154(KACC91727P) 균주를 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154(KACC91727P) 균주는 김치에서 분리되었으며, 후술하는 실시예의 방법에 따라 스크리닝 및 동정하였다. 미생물의 동정은 그의 형태학적, 생리학적 및 생화학적 특성을 기초로 하여 이루어졌다.
본 발명자들은 각각 지역과 종류가 다른 김치를 수거하여 사용하였으며, 펩톤 희석액으로 희석하여 NaN3를 첨가한 변형 MRS배지(표 1)에 0.1ml씩 평면도말법으로 접종한 후 37℃에서 48시간 배양하고, 각 균락을 변형 MRS 배지에서 순수분리한 다음 노란색으로 변한 균락을 잠정적 젖산균으로 선발하였다. 선발된 균주는 전기 변형 MRS 배지에 도말한 후, 호기 배양하여 순수분리 하였다. 순수 분리된 균주를 동정한 결과, 균주는 그람양성 간균이며, 산소 유무와 상관없이 잘 생장하고 카탈라아제와 운동성에 대해서는 음성으로 밝혀졌다. 또한, 15℃와 45℃에서 생장하였으며, 글루코스(glucose)로부터 가스와 알긴산으로부터 암모니아를 생성하지 않아 락토바실러스(Lactobacillus)에 속하는 것으로 확인하였다.
한편, 종명을 확인하기 위하여 49종의 당 발효 시험을 실시한 결과, 글루코스 등 25종으로부터 산을 생성하였고, ATB 동정시스템에 입력하여 조사한 결과와 16S rRNA 유전자 염기서열(Gene Sequence)을 이용하여 얻어진 결과가 일치되어 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum)으로 판명되었다.
따라서 본 발명자들은 김치에서 분리한 GABA 생성능력이 우수한 균주를 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154로 명명하였다.
또한, 상기 균주는 담즙내성 및 내산성을 가진 것을 특징으로 하는데, 담즙내성을 MRS 배지에서의 젖산균 성장을 시험함으로써 측정하였는바, 7시간 배양 후 담즙을 첨가하지 않을 때와 첨가할 때와는 0.5 log의 차이로 약간 억제를 받기는 하나 담즙에 대한 내성이 있는 것으로 나타났다. 또한, pH 내성을 시험한 결과, 대조구 pH인 6.4에 비해 강산인 pH 2에서 조차도 거의 영향이 없음을 나타냄으로써 내산성이 있음을 보였다.
본 발명자들이 김치에서 분리한 젖산균인 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154(KACC91727P) 균주는 종래에 발견된 젖산균보다 내담즙성, pH 내성 및 GABA 생성 능력이 뛰어나므로, 상기 균주를 배양하여 이용하면 고함량의 GABA가 포함된 발효식물 추출물 등의 기능성 식품을 제조할 수 있다.
도 1은 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154를 MRS 배지에 접종하였을 때의 성장을 나타낸 그래프이다.
도 2는 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154를 MRS 배지에 접종하였을 때의 pH변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 담즙첨가 유무에 따라 MRS 배지에서의 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154의 성장을 나타낸 그래프이다.
이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1 > 미생물의 분리
시료로 사용된 김치는 각각 지역과 종류가 다른 가정에서 수거하여 브롬크레졸 퍼플(Bromcresol purple)과 소듐아자이드(sodium azide)를 첨가한 변형 MRS배지(표 1)에 0.3㎖씩 평면도말법으로 접종한 후 37℃에서 48시간 배양하였다. 그런 다음, 각각의 균락을 전기 변형 MRS 배지에서 순수분리하고, 노란색으로 변한 균락을 잠정적 젖산균으로 선발하였다. 선발된 균주는 전기 변형 MRS 배지에 3회 백금이로 도말한 후 호기배양 하여 순수분리 하였다.
본 발명에서 미생물 분리에 사용된 변형 MRS 배지의 조성
성 분 성분비(그람/리터)
프로테오스 펩톤 #3 10.0
쇠고기 추출물 10.0
효모 추출물 5.0
락토오스 20.0
트윈 80 1.0
암모늄 시트레이트 2.0
소디움 아세테이트 5.0
마그네슘 설페이트 0.1
망간 설페이트 0.05
디포타시움 포스페이트 2.0
소듐 아자이드 0.25
브롬크레졸 퍼플 0.04
< 실시예 2 > GABA 생성 식물성 젖산균주 선발
GABA함량이 500ug/ml 이상인 균주 75종을 3 반복하여 정량하였고, 이중 900ug/ml 이상인 균주 7종에 대해 수준별로 MSG를 MRS배지에 첨가한 후 37℃에서 18시간 배양 후 pH와 GABA 생성량을 측정한 결과는 다음 표 2와 같다.
MSG 첨가수준별 pH 및 GABA 생산
균주들 MSG 1% 첨가 MSG 2% 첨가 MSG 3% 첨가
GABA(ug/ml) pH GABA(ug/ml) pH GABA(ug/ml) pH
K4 703.91±81.28 4.09 1061.36±28.28 4.16 1501.69±46.93 4.37
K66 1141.91±71.86 4.04 1224.65±48.99 4.23 1830.18±46.93 4.43
K154 1548.61±81.28 4.04 1704.28±28.66 4.19 2017.89±0.00 4.42
K174 328.49±66.36 4.42 821.23±99.54 4.3 1689.40±66.36 4.6
K177 782.13±27.09 4.13 1042.42±49.64 4.45 2096.11±270.94 4.47
K200 398.88±33.18 4.04 821.23±33.18 4.21 1814.54±27.09 4.42
K256 625.70±71.68 4.06 821.23±99.54 4.25 1384.37±99.54 4.48
상기 표 2에서 보는 바와 같이 분리된 젖산균 K154 균주는 GABA 생성량이 다른 균주에 비해 가장 안정적으로 수준별로 증가하는 경향을 보임에 따라 GABA 생산능력이 우수한 균주로 선발되었다.
< 실시예 3 > 미생물의 동정
미생물의 분류학적 동정은 Hammes 등[The prokaryotes, 1563-1578, 2nd Edition, Springer-Verlag Co.(1992)]의 방법에 따라 수행하였으며, 그 결과는 표 3에서 보는 바와 같다. 이들 균주는 공히 그람 양성, 간균이며, 산소유무와 상관없이 잘 생장하였고, 카탈라제와 운동성은 음성이었다. 또한, 15℃와 45℃에서는 생장하였으며 포도당(glucose)으로부터 가스(gas)와, 아르기닌(arginine)으로부터 암모니아를 생성하지 않아 락토바실러스(Lactobacillus) 속(genus)에 속하였다. 종(species)을 정하기 위하여 API 50CHL kit(API bioMerieux, France)를 이용하여 49종의 당발효 시험을 실시하였을 때 글루코스 등 25종으로부터 산을 생성하였고, ATB 동정시스템에 입력하여 조사한 결과와 16S rRNA Gene Sequence를 이용하여 얻어진 결과가 일치되어 락토바실러스 플랜타룸으로 판명되었다. 김치에서 분리한 GABA 생성능력이 우수한 균주를 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154로 명명하고, 2012년 7월 6일 농업생명공학연구원 한국농업미생물자원센터(KACC)에 기탁번호 KACC 91727P로 기탁하였다.
본 발명의 신규 미생물 락토바실러스 플랜타룸 K154의 생리적 및 생화학적 특성
그램 반응
세포 형태
포자 형성
운동성
호기적 성장
혐기적 성장
카탈라제 반응
15℃에서 성장
45℃에서 성장
포도당으로 부터 가스생성
알기닌으로 부터 암모니아 생성 		+
간균
-
-
+
+
-
+
+
-
-
당이용 능력
글리세롤
에리티톨
D-아라비노스
L-아라비노스
리보스
글루코스
프락토스
만노스
소르보스
람노스
둘시톨
이노시톨
만니톨
솔비톨
a-메칠-D-만노사이드
a-메칠-D-글루코사이드
N 아세칠 글루코스아민
아미그달린
아르부틴
에스쿨린
살리신
셀로비오스
말토스
락토스
멜리비오스 		-
-
-
+
+
+
+
+
-
+
-
-
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+		 D-사이로스
L-사이로스
아도니톨
β-메칠-D-사이로사이드
갈락토스
수크로스
트레할로스
이눌린
멜레지토스
라피노스
스타치
글리코겐
실리톨
겐티오비오스
D-투라노스
D-라이소스
D-타가토스
D-후코스
L-후코스
D-아라비톨
L-아라비톨
글루코네이트
2-케토-글루코네이트
5-케토-글루코네이트
-
-
-
-
+
+
+
-
+
-
-
-
-
+
+
-
-
-
-
-
-
+
-
-
GABA가 증진된 발효 식물추출물 스타터로서 적합한지 여부를 확인하기 위하여 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154를 총명탕에 배양하면서 시험에 사용하였다.
< 실시예 4 > 미생물의 생장시험
젖산균의 생장은 생균수, pH를 측정하여 시험하였다. 생균수는 MRS 액체배지 150㎖에 젖산균을 1㎖용 피펫으로 1방울 접종한 후 34, 37, 40℃에서 3시간 간격으로 24시간까지 배양한 각 시료를 0.1% 펩톤용액에 희석하여 BCP plate count agar 평판에서 부어 굳힌 후 35℃에서 48시간 배양하여 계수하였고, 온도 및 시간별로 pH 변화를 측정하고 결과를 도 1과 도 2에 나타내었다. 도 1과 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이 최적온도는 37℃이며, 발효제품의 최적 pH 조건인 pH 4.3-4.4에 도달하는데 13시간 소요되었다.
< 실시예 5 > 항생제 내성시험
항생제 내성시험은 트립틱 소이 브로스(tryptic soy broth, Difco, USA)를 사용하여 2배 희석방법에 의해 생장여부를 관찰하여 최저억제농도(MIC) 값을 정하였으며, 측정한 결과는 표 4에 나타내었다.
락토바실러스 플랜타룸 K154의 항생제 감수성
항생제 최저억제농도(㎍/㎖)
아미노글리코사이드계
아미카신 Amikacin 160
겐타마이신 80
가나마이신 200
네오마이신 200
스트렙토마이신* 200
β-락탐계
페니실린-G* 160
메치실린 320
옥사실린 60
암피실린 160
그램-양성 스펙트럼
바시트라신* 30
리팜피신 480
노보바이오신 7.5
린코마이신 50
그램-음성 스펙트럼
폴리마이신B* 2,400
광범위 스펙트럼
클로람페니콜 40
반코마이신* 3,200
* : units/㎖
상기 표 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 플랜타룸 K154는 타 계열의 항생제에 비해 반코마이신과 폴리마이신 B에 대해 내성이 있는 반면 노보바이오신과 바시트라신에 감수성이 높았다.
< 실시예 6 > 효소활성 시험
효소활성 시험은 MRS 액체배지에서 37℃, 18시간 동안 배양한 균주를 생리식염수로 희석하여 105 - 106 cfu/㎖ 수준의 시료를 조제한 후, API ZYM kit(API bioMerieux, France)를 이용하여 37℃에서 5시간 동안 배양한 다음 효소반응을 시켰다. 효소활성은 표준색상표를 비교하여 0-5의 수치로 표시한 결과는 표 5에 나타내었다.
락토바실러스 플랜타룸 K154의 효소활성 비교
효 소 효소활성
알칼라인 포스파타제
에스테라제(C4)
에스테라제 리파제(C8)
리파제(C14)
류신 아릴아미다제
발린 아릴아미다제
시스틴 아릴아미다제
트립신
카이모트립신
산 포스파타제
나프톨-AS-BI-포스포하이드로라제
α-갈락토시다제
β-갈락토시다제
β-글루크로니다제
α-글루코시다제
β-글루코시다제
N-아세칠-β-글루코스아민니다제
α-만노시다제
β-푸코시다제		 0
0
0
0
5
4
1
0
0
1
3
0
5
0
4
5
3
0
0
* : 0 에서 5까지 단계별로 표준색이 명시되어 있으며, 0은 음성이고 5는 최대의 강도를 나타낸다. 1은 5나노몰(nanomoles), 2는 10나노몰, 3은 20나노몰, 4는 30나노몰, 5는 40나노몰 이상의 효소활성을 나타낸다.
상기 표 5에서 볼 수 있는 바와 같이 락토바실러스 플랜타룸 K154는 류신 아릴아미다제, β-갈락토시다제, β-글루코시다제에서 효소 활성이 높게 나타났다. 벤조피렌(Benzopyrene)을 발암성 물질로 전환시키는 발암효소인 β-글루크로니다제(glucuronidase)의 경우에는 효소활성이 없는 것으로 나타나 안전성을 확인할 수 있었다.
< 실시예 7 > 담즙내성 시험
담즙내성시험은 길리랜드와 월커의 방법(Gilliland & Walker, J. Dairy Sci., 73, 905, 1990)에 따라 측정한 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이 7시간 배양 후 담즙을 첨가하지 않을 때와 첨가할 때와는 0.5 log의 차이로 약간 억제를 받기는 하나 담즙에 대한 내성이 있는 것으로 나타났다.
< 실시예 8 > pH 내성 시험
pH 내성시험은 클라크 등의 방법(Clark et al., Cultured Dairy Products J., 28(4), 11, 1993)에 따라 측정한 결과는 표 6에 나타내었다.
염산용액에서 3시간 후의 락토바실러스 플랜타룸 K154 내성 비교[단위 : CFU per ㎖(Log number)]
배양시간(hr) pH 2 pH 3 pH 4 pH 6.4
0 8.16 8.22 8.20 8.29
1 8.21 8.22 8.21 8.30
2 8.22 8.26 8.21 8.32
3 8.20 8.25 8.22 8.30
상기 표 6에서 볼 수 있는 바와 같이 대조구 pH인 6.4에 비해 강산인 pH 2에서 조차도 거의 영향이 없음에 따라 내산성이 있음을 보였다.
< 실시예 9 > 항균력 시험
항균력 시험은 길리랜드와 스펙(Gilliland & Speck, J. Food Prot., 40(12), 820, 1977)에 따라 측정한 결과는 표 7에 나타내었다.
MRS 배지에서 락토바실러스 플랜타룸 K154의 식중독균 억제(*)
식중독균 생 장
식중독균a 락토바실러스 플랜타룸 K154a 억제율(%)
CFU/㎖ CFU/㎖
대장균
(Escherichia coli)		 5.8×104 4.7×104 19.0
살모넬라 타이피머리움
(Salmonella typhimurium)		 3.7×105 3.0×105 18.9
스테피로코커스 오레우스
(Staphyloccous aureus)		 2.2×106 1.9×106 13.6
* 락토바실러스 플랜타룸 K154의 초기 수 : 2.4×106CFU/㎖
a 37℃에서 6시간 배양 후 측정
상기 표 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 플랜타룸 K154가 대장균(Escherichia coli)에 대해 19%의 억제력을 보였고 살모넬라 타이피머리움(Salmonella typhimurium)에 대해 18.9%로서 비슷한 억제력을 나타내었다. 스테피로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus)에 대해 13.6%로서 다른 식중독균에 비해 약간 억제력이 낮았다.
< 실시예 10 > 총명탕 발효에 따른 GABA 함량 변화
총명탕과 총명탕에 글루코즈 0.5%, 효모 추출액(Yeast Extract) 2.5%, 스타터(Starter) 10%, MSG 2% 탈지유 및 MSG 함량별로 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154를 10% 접종하고 37℃에서 24시간과 72시간 배양한 후 GABA 함량을 측정한 결과는 다음 표 8과 같다.
조건 GABA 함량 (ug/mL)
총명탕 31.40
총명탕+glucose 0.5%+Y.E. 2.5%+
Starter 10% (MSG 2%), 24시간 배양		 1356.57
총명탕+glucose 0.5%+Y.E. 2.5%+
Starter 10% (MSG 2%) 72시간 배양		 1942.84
총명탕에 비해 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154로 발효시켰을 때와 발효시간이 길수록 GABA 함량이 증가하였다.
농업생명공학연구원 KACC91727P 20120706

Claims (2)

  1. 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA) 생산능력이 우수하고, 담즙내성 및 내산성을 가진 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154(KACC91727P) 균주.
  2. 삭제
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