KR101380516B1 - 바실러스 섭틸리스 ｉｎ-55, 락토바실러스 플란타룸 ｂｔ-77 및 이를 이용한 사일리지 제조방법 - Google Patents

바실러스 섭틸리스 ｉｎ-55, 락토바실러스 플란타룸 ｂｔ-77 및 이를 이용한 사일리지 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101380516B1
KR101380516B1 KR1020110045050A KR20110045050A KR101380516B1 KR 101380516 B1 KR101380516 B1 KR 101380516B1 KR 1020110045050 A KR1020110045050 A KR 1020110045050A KR 20110045050 A KR20110045050 A KR 20110045050A KR 101380516 B1 KR101380516 B1 KR 101380516B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
bacillus subtilis
lactobacillus plantarum
silage
kctc
plant
Prior art date
Application number
KR1020110045050A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20120126917A (ko
Inventor
김민수
박찬선
윤병대
김보연
안종석
양희종
홍재화
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
Priority to KR1020110045050A priority Critical patent/KR101380516B1/ko
Publication of KR20120126917A publication Critical patent/KR20120126917A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101380516B1 publication Critical patent/KR101380516B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F11/00—Other organic fertilisers
    • C05F11/08—Organic fertilisers containing added bacterial cultures, mycelia or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/25—Lactobacillus plantarum

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 신규한 바실러스 섭틸리스 IN-55, 락토바실러스 플란타룸 BT-77 및 이를 이용한 식물체 사일리지 제조방법에 관한 것이다..
본 발명에 따른 바실러스 섭틸리스 IN-55 및 락토바실러스 플란타룸 BT-77를 식물체 사일리지 발효용 첨가제로 이용함으로써, 식물체 사일리지의 소화율 개선, 항균 효과 및 기호성 향상을 통해 가축의 품질을 높일 수 있으며 나아가 가축 사육 시 발생하는 환경오염을 방지하는 등의 효과를 수반하게 된다.

Description

바실러스 섭틸리스 ＩＮ-55, 락토바실러스 플란타룸 ＢＴ-77 및 이를 이용한 사일리지 제조방법 {Bacillus subtilis IN-55, Lactobacillus plantarum BT-77 and Method for Manufacturing Silage Using the Same}
본 발명은 신규한 바실러스 섭틸리스 IN-55, 락토바실러스 플란타룸 BT-77 및 이를 이용한 식물체 사일리지 제조방법에 관한 것이다.
조사료는 일시에 다량 생산되므로 연중 안정적인 급여를 위해서는 저장을 해야 하는데, 수분을 제거한 저장이 건초인 반면 수분이 있는 상태에서 저장을 하는 것이 사일리지(silage, 담근먹이)이다.
사일리지는 식물체 또는 토양 중에 있는 젖산균이 혐기 상태에서 정상 젖산 발효(homolactic acid fermentation)를 일으켜 젖산을 생성함으로써 산도를 급격히 저하시켜, 발효 초기 단계에서 다른 호기성 균의 번식을 억제하고 계속해서 일어나는 혐기화 초기의 부티르산 발효를 억제함으로써 사료의 저장성, 영양성 및 기호성을 증진시키게 된다. 하지만 사일리지 제조시의 작물의 생육상태, 기상상태 등에 따라 균일한 품질의 사일리지를 얻기가 힘들다. 따라서 이런 단점을 해결하기 위해서 이용하는 것이 이노큐란트(inoculant, 사일리지용 첨가제)이며, 이노큐란트를 첨가함으로써 사일리지의 품질을 개선시키고 가축의 생산성(유 및 육의 생산성)을 향상시킬 수 있다.
그 동안 사일리지용 첨가제인 이노큐란트는 전량 수입에 의존하여 외국의 제품들이 대부분 이용되어 왔으며, 최근 사일리지의 조제 및 사용이 증가하면서 사일리지의 품질 향상을 위한 첨가제의 필요성에 대한 인식이 확산되면서 국내산 사일리지용 첨가제를 개발하기 위한 연구가 이루어지고 있다. 특히 사일리지 발효시 초기 pH를 효과적으로 저하시켜 정상 젖산 발효를 촉진함으로써 발효 효율 및 사료 저장성을 증진시킬 뿐만 아니라 사료의 영양성, 기호성 및 소화율도 향상시킬 수 있는 첨가제의 개발이 필요하다.
본 발명은 식물체 사일리지를 제조함에 있어서 저비용으로 풍미로운 기호성 향상 효과, 병원성 균에 대한 항균 효과 및 효소산물로 인한 소화율 개선 효과를 갖는 우수한 사료를 제조하기 위한 새로운 사일리지 발효용 미생물 및 이를 이용한 식물체 사일리지의 제조방법을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) IN-55 (KCTC 11914BP) 균주 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) BT-77 (KCTC 11915BP) 균주를 제공한다.
또한 본 발명은 바실러스 섭틸리스 IN-55 (KCTC 11914BP) 및 락토바실러스 플란타룸 BT-77 (KCTC 11915BP) 중 적어도 하나를 포함하는 식물체 사일리지 발효용 미생물 첨가제를 제공한다.
또한 본 발명은 식물체에 바실러스 섭틸리스 IN-55 (KCTC 11914BP) 및 락토바실러스 플란타룸 BT-77 (KCTC 11915BP) 중 적어도 하나를 첨가하는 것을 특징으로 하는 식물체 사일리지 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 바실러스 섭틸리스 IN-55 및 락토바실러스 플란타룸 BT-77를 식물체 사일리지 발효용 첨가제로 이용함으로써, 식물체 사일리지의 소화율 개선, 항균 효과 및 기호성 향상을 통해 가축의 품질을 높일 수 있으며 나아가 가축 사육 시 발생하는 환경오염을 방지하는 등의 효과를 수반하게 된다.
도 1은 바실러스 섭틸리스 IN-55 균주 동정을 위해 분석한 16S rRNA 염기서열 중 2192 bp를 나타낸 그림이다.
도 2는 락토바실러스 플란타룸 BT-77 균주 동정을 위해 분석한 16S rRNA 염기서열 중 601 bp를 나타낸 그림이다.
도 3은 바실러스 섭틸리스 IN-55의 프로테아제(Protease), 셀룰라제(Cellulase) 및 아밀라제(Amylase) 효소 활성을 나타낸 그림이다.
도 4는 락토바실러스 플란타룸 BT-77의 셀룰라제 효소 활성을 나타낸 그림이다.
도 5는 바실러스 섭틸리스 IN-55 배양 상등액의 Listeria monocytogenes에 대한 항균 활성을 나타낸 그림이다.
도 6은 락토바실러스 플란타룸 BT-77 배양 상등액의 다양한 병원성 균에 대한 항균 활성을 나타낸 그림이다.
도 7은 바실러스 섭틸리스 IN-55 및 락토바실러스 플란타룸 BT-77을 이용한 사일리지 제조 후 볏짚 표면의 전자현미경 사진을 나타낸 그림이다.
도 8은 바실러스 섭틸리스 IN-55 및 락토바실러스 플란타룸 BT-77을 이용한 사일리지 제조 후 상기 균주에 의해 볏짚의 분해를 전자현미경으로 관찰한 사진이다.
본 발명은 식물체 사일리지 발효에 적합한 신규 미생물인 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) IN-55 (KCTC 11914BP) 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) BT-77 (KCTC 11915BP)을 제공한다.
본 발명자들은 강한 셀룰라아제 효소 활성을 보이는 신규한 바실러스 섭틸리스 및 락토바실러스 플란타룸 균주를 식품 및 토양으로부터 분리하는 단계; 상기 분리한 바실러스 섭틸리스 및 락토바실러스 플란타룸 균주의 효소 활성능을 검정하는 단계; 상기 분리한 신규 미생물인 바실러스 섭틸리스 및 락토바실러스 플란타룸 균주의 동정 단계; 상기 분리된 바실러스 섭틸리스 및 락토바실러스 플란타룸 균주를 이용한 식물체 사일리지 발효를 검정하는 단계; 상기 분리된 사일리지 발효용 바실러스 섭틸리스 및 락토바실러스 플란타룸을 이용한 포트 실험 및 전자현미경 사진을 통한 검정 단계; 및 상기 분리된 바실러스 섭틸리스 및 락토바실러스 플란타룸 균주의 대량 배양 단계를 거쳐, 식물체 사일리지 발효에 적합한 신규 미생물인 락토바실러스 플란타룸 BT-77 (기탁번호 KCTC 11915BP)과 바실러스 섭틸리스 IN-55 (기탁번호 KCTC 11914BP)를 얻었다.
하기 실시예를 통하여 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 바실러스 섭틸리스 IN-55 (KCTC 11914BP) 및 락토바실러스 플란타룸 BT-77 (KCTC 11915BP)은 식물체 사일리지 발효용 첨가제로 사용시 pH 저하 효과가 우수하며, 이에 따른 발효 효율의 증가로 인해 다른 병원성 균의 번식을 효과적으로 억제함으로써 사료 저장성을 증진시킬 수 있고, 병원성 균의 성장을 억제하여 단백질 분해를 감소시켜 암모니아태 질소 등의 생성을 억제함으로써 가축의 기호성을 향상시키며, 효소 활성이 우수하여 가축의 소화율을 효과적으로 개선하는 효과가 있다. 그리고 이러한 효과는 특히 상기 바실러스 섭틸리스 IN-55 (KCTC 11914BP) 및 락토바실러스 플란타룸 BT-77 (KCTC 11915BP)을 함께 사용하는 경우 더욱 증대됨을 확인하였다.
따라서 본 발명은 바실러스 섭틸리스 IN-55 (KCTC 11914BP) 및 락토바실러스 플란타룸 BT-77 (KCTC 11915BP) 중 적어도 하나를 포함하는 식물체 사일리지 발효용 미생물 첨가제를 제공한다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 식물체 사일리지 발효용 미생물 첨가제를 첨가하는 대상이 되는 식물체는, 예를 들어 볏짚, 라이그라스(ryegrass), 총체보리, 총체벼, 호밀 또는 옥수수일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 필요에 따라 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
상기 식물체 사일리지 발효용 미생물 첨가제는 바실러스 섭틸리스 IN-55 (KCTC 11914BP) 또는 락토바실러스 플란타룸 BT-77 (KCTC 11915BP) 균주 자체, 상기 균주를 포함하는 배양원액, 또는 상기 배양원액의 희석액의 형태로 첨가할 수 있다.
또한 본 발명은 식물체에 바실러스 섭틸리스 IN-55 (KCTC 11914BP) 및 락토바실러스 플란타룸 BT-77 (KCTC 11915BP) 중 적어도 하나를 첨가하는 것을 특징으로 하는 식물체 사일리지 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 식물체 사일리지 제조방법은 당업계에서 사용되는 일반적인 방법으로서, 예를 들어 식물체의 발효를 위한 복수의 발효 단계들을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 복수의 발효 단계들은, 예를 들어 혐기성균인 초산균의 발효 단계 및 이후 젖산균의 발효 단계 등을 포함할 수 있으며, 당업자에 의해 적절한 조건으로 수행될 수 있다.
따라서 본 발명의 한 구체예에 따르면, 본 발명은 식물체의 발효를 위한 복수의 발효 단계들을 포함하고, 상기 복수의 발효 단계 중 적어도 하나의 발효 단계에서 식물체에 바실러스 섭틸리스 IN-55 (KCTC 11914BP) 및 락토바실러스 플란타룸 BT-77 (KCTC 11915BP) 중 적어도 하나를 첨가하는 것을 특징으로 하는 식물체 사일리지 제조방법을 제공한다.
이 때 사일리지 제조에 사용되는 식물체는, 전술한 바와 같이 예를 들어 볏짚, 라이그라스(ryegrass), 총체보리, 총체벼, 호밀 또는 옥수수일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 필요에 따라 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
이하, 본 발명의 구성을 하기 실시예에 의하여 좀 더 자세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예의 기재범위에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 균주의 분리 및 동정
1-1. 균주의 분리
본 실시예에서는 셀룰라아제를 시험 균주로 하여 이에 효소활성이 있는 미생물을 분리하기 위하여 전국 각지에서 전통 발효 식품 및 토양으로부터 시료를 채취하였다. 채취한 시료 1g에 멸균수 10㎖을 혼합하여 30℃에서 30분간 진탕한 후, 희석 한천평판법으로 104배까지 희석하여 희석액 0.14㎖를 LB 배지(표 1의 조성)에 분주하여 배지 전면에 골고루 편 다음, 30℃ 항온기에서 3일간 배양한 후 진균의 단일 콜로니(single colony)를 순수 분리하여 사면 배지에 옮겨 4℃에서 보관하였다.
배지 성분 농도(g/L)
효모추출물 5
트립톤 10
염화나트륨 10
또한, 락토바실러스 플란타룸 균주의 선별을 위하여 채취한 시료 1g에 멸균수 10㎖을 혼합하여 30℃에서 30분간 진탕한 후, 희석 한천평판법으로 104배까지 희석하여 희석액 0.14㎖를 MRS 배지(Difco Co.)에 분주하여 배지 전면에 골고루 편 다음, 36℃ 항온기에서 2일간 배양 후 균의 단일 콜로니(single colony)를 순수 분리하여 사면 배지에 옮겨 4℃에서 보관하였다.
각각의 선별 균주는 셀룰라아제를 사용하여 이에 강한 항균력을 나타내는 가장 우수한 바실러스 섭틸리스 및 락토바실러스 플란타룸 균주를 하나씩 선별하였다. 이렇게 선별한 균주에 대한 동정을 다음과 같이 실시하였다.
1-2: 형태적, 생리학적 특성
선별한 균주 바실러스 섭틸리스 IN-55 및 락토바실러스 플란타룸 BT-77을 영양 배지에 접종하여 30℃에서 3일간 배양한 후 형태학적 및 생리학적 특성을 관찰하였다. 그 결과 선별한 균주들은 단일 콜로니로 생성되며 콜로니의 표면은 매끈한 형태였고 현미경으로 관찰한 결과, 간균의 모양을 하였다. 또한 바실러스 섭틸리스 IN-55 및 락토바실러스 플란타룸 BT-77의 생리적인 특성을 조사한 결과, 운동성이 있는 그램 양성균이었다. 바실러스 섭틸리스 IN-55 및 락토바실러스 플란타룸 BT-77의 자세한 특성은 하기 표 2 및 표 3에 나타내었다.
바실러스 섭틸리스
IN-55		 바실러스 섭틸리스
표준
그램(Gram)/형태(Shape) +/R +/R
포자 (Spore) + +
운동성 (Motility) + D
호기조건에서의 성장
(Growth in air)		 + +
혐기조건에서의 성장
(Growth anaerobically)		 + D
카탈라제(Catalase) 활성 + +
옥시다제(Oxidase) 활성 + d
포도당 (Glucose(acid)) + D
O/F/- -/- O/F/-
포자 형태 (Spore shape) X X
포자 위치 (Spore position) U U
45℃에서의 성장 + +
65℃에서의 성장 - -
pH 5.7에서의 성장 + +
7% NaCl에서의 성장 + +
구연산 이용
(Utilization of citrate)		 + +
포도당 브로쓰에서의 혐기적 성장
(Anaerobic growth in glucose broth)		 - -
탄수화물
(Carbohydrates, acid from:)
포도당 (Glucose)

+

+
아라비노스 (Arabinose) - +
만니톨 (Mannitol) + +
자일로스 (Xylose) w +
VP test + +
전분 가수분해
(Starch hydrolysis)		 + +
질산 환원 (Nitrate reduction) - +
인돌 (Indole) - -
젤라틴 가수분해
(Gelatin hydrolysis)		 + +
카제인 가수분해
(Casein hydrolysis)		 + +
우레아제 (Urease) - d
LV d -
라이소자임 민감성
(Lysozyme sensitivity)		 r d
D-동속이종마다 다른 반응, d-균주마다 다른 반응
O-산화(Oxidation), F-발효(Fermentation)
T-terminal spore, X-spore oval
V-subterminal spore, U-central spore
r-저항성(resistant), s-민감성(sensitive)
R-막대모양(Rod-shaped)(Bacillus)
w-약한 반응(Weak reaction)
락토바실러스 플란타룸
(BT-77)		 락토바실러스 플란타룸
표준
그램(Gram)/형태(Shape) +/R +/R
포자 (Spore) - -
운동성 (Motility) - -
호기조건에서의 성장
(Growth in air)		 + +
혐기조건에서의 성장
(Growth anaerobically)		 + +
카탈라제(Catalase) 활성 - -
옥시다제(Oxidase) 활성 - -
포도당 (Glucose(acid)) + +
O/F/- F F
포자 형태 (Spore shape) - -
가스 생성도 (Gas from glucose) - -
15에서의 생장 + +
45에서의 생장 - -
VP test - -
질산 환원 (Nitrate reduction) - -
젤라틴 가수분해
(Gelatin hydrolysis)		 - -
에스쿨린 가수분해
(Aesculin hydrolysis)		 + +
아르기닌 가수분해
(Arginine hydrolysis)		 - -
탄수화물
(Carbohydrates, acid from:)
아미그달린 (Amygdalin)

+

+
아라비노스 (L-Arabinose) + d
셀로비오스 (Cellobiose) + +
에스쿨린 (Esculin) + +
프록토오스 (Fructose) + +
갈락토오스 (Galactose) + +
포도당 (Glucose) + +
글루코네이트 (Gluconate) - +
락토오즈 (Lactose) + +
말토오즈 (Maltose) + +
만니톨 (Mannitol) + +
만노오즈 (Mannose) + +
멜레치토스 (Melezitose) + d
멜리비오스 (Melibiose) + +
라피노오스 (Raffinose) + +
람노오즈 (Ramnose) - -
리보오즈 (Ribose) + +
살리신 (Salicin) + +
솔비톨 (Solbitol) + +
수크로오스 (Sucrose) + +
트레할로스 (Trehalose) + +
자일로스 (Xylose) - d
d-균주마다 다른 반응
O-산화(Oxidation), F-발효(Fermentation)
1-3: 16S rRNA 염기서열 분석
선별한 균주의 계통분류학적인 위치를 확인하기 위하여 rRNA 염기서열을 분석하였다. 바실러스 섭틸리스 IN-55의 경우 2192 bp의 염기서열을 분석하였고(도 1), 락토바실러스 플란타룸 BT-77의 경우 전체 16S rRNA 염기서열의 30% 이상의 염기서열에 해당되는 601bp의 염기서열을 분석하였다(도 2). 선별한 균주로부터 16S rRNA 분절을 프라이머 세트로 PCR하여 증폭시킨 후, 증폭산물을 정제하여 TOPO TA Cloning 키트(Invitrogen)에 삽입(ligation)하고, 이를 대장균에 형질전환 하였다. 형질전환 된 대장균으로부터 플라스미드를 추출한 후 자동염기서열 분석장치(Applied Biosystems model 373A automatic sequencer)와 키트(BigDye Terminator Cycle Sequencing kit, Perkin-Elmer Applied Biosystems)를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 선별한 균주의 16S rDNA는 유전자은행의 블라스트 프로그램를 이용하여 상동성을 분석하였다.
그 결과 선별된 균주는 각각 바실러스 섭틸리스 및 락토바실러스 플란타룸과 99%의 상동성을 나타내었고, 본 발명의 균주는 각각 바실러스 섭틸리스 및 락토바실러스 플란타룸으로 최종 확인되었다. 따라서 이를 2011년 4월 8일자로 한국생명공학연구원 내 유전자원센타에 특허균주로 기탁하고 기탁번호 KCTC 11914BP(바실러스 섭틸리스 IN-55)와 제 KCTC 11915BP(락토바실러스 플란타룸 BT-77)를 부여받았다.
실시예 2: 효소 활성능 및 활성범위 검정
각종 유기물 분해능의 검정을 위하여 프로테아제, 셀룰라아제, 아밀라제를 대상으로 검정하였다. 각각의 스킴밀크, CMC(carboxymethyl cellulose), 녹말(starch) 배지를 살균한 후, 배지가 완전히 굳은 다음 바실러스 섭틸러스 IN-55 및 락토바실러스 플란타룸 BT-77을 배양한 배양액을 페이퍼디스크(직경 8mm)에 묻혀서 효소 활성능을 확인하기 위한 페트리디쉬에 올려놓았다. 각종 효소의 활성이 검증되는 25℃에서 12시간 활성화한 후, 스킴밀크, CMC, 녹말의 분해능을 저지원(clear zone)의 직경으로 조사하고, 이를 하기 표 4에 나타내었다.
표 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 바실러스 섭틸리스 IN-55 균주는 프로테아제, 셀룰라제, 아밀라아제 효소 활성능이 모두 우수하였으며, 락토바실러스 플란타룸 BT-77 균주는 셀룰라제 효소 활성만 강하게 나타났다. 특히 두 균주 모두 사일리지 제조에 큰 영향을 미치는 셀룰라제 효소 활성능이 우수함을 확인하였다.
검정 효소 활성 활성정도
(바실러스 섭틸리스
IN-55)		 활성정도
(락토바실러스 플란타룸 BT-77)
프로테아제 (protease) ++++ -
셀룰라아제 (cellulase) +++ +++
아밀라제 (amylase) +++ -
++++ : 저지원(clear zone)의 크기 15 ~ 20 mm, +++ : 10 ~ 15 mm
도 3은 바실러스 섭틸리스 IN-55의 프로테아제, 셀룰라아제 효소 활성을 나타낸 결과로서, 매우 우수한 효소활성을 나타내는 것을 알 수 있다.
도 4는 락토바실러스 플란타룸 BT-77의 셀룰라아제 효소 활성을 나타낸 결과로서, 매우 우수한 효소활성을 나타내는 것을 알 수 있다.
실시예 3: 항균 활성능 및 활성 범위 검정
스타필로콕쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus, 한국생명공학연구원 생물자원센터, KCTC 1928), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus, 한국생명공학연구원 생물자원센터 KCTC 3624) 등 표 5에 개시된 병원성 균이 접종된 준비해 놓은 고체 배지의 페이퍼디스크 위에 상기 바실러스 섭틸리스 IN-55 및 락토바실러스 플란타룸 BT-77의 배양 상등액을 100㎛씩 분주하여 지시균주(Bacillus cereus)의 최적 배양 온도에서 배양하여 NB 플레이트 상에 억제환 생성 여부를 관찰함으로써 항균 활성을 확인하였다.
지시균주 바실러스 섭틸리스 IN-55
(억제환 지름, mm)		 락토바실러스 플란타룸 BT-77
(억제환 지름, mm)
Eschericlria coli
ATCC 700928		 - 18
Salmonella typhimurium
KCTC 2057		 - 18
Salmonella choleraesuis
KCTC 2929		 - 18
Streptococcus suis
KCTC 3557		 - 18
Bacillus cereus
KCTC 3624		 - 20
Listeria monocytogenes
KCTC 3710		 14 -
그 결과 표 5에 나타난 바와 같이, 바실러스 섭틸리스 IN-55의 경우 Listeria monocytogenes에만 항균 활성을 나타냄을 확인하였으며(도 5), 락토바실러스 플란타룸 BT-77의 경우 Listeria monocytogenes을 제외한 나머지 병원성 균에 대해 모두 강한 항균 활성을 보여(도 6), 상기 두 균주들을 함께 사용하는 경우 상호 보완적으로 활용성이 높은 항균 활성을 지님을 확인하였다.
실시예 4: 신균주를 이용한 사일리지 제조시 미생물 검정
바실러스 섭틸리스 IN-55 및 락토바실러스 플란타룸 BT-77을 이용한 사일리지 제조능을 검정하기 위하여, 볏짚을 2.5cm으로 절단하여 500㎖ 플라스크에 20g씩 넣은 후 바실러스 섭틸리스와 락토바실러스 플란타룸 두 균주의 생장에 유용한 TGY 배지(표 6 조성)를 넣고 살균하였다.
배지 성분 농도(g/L)
효모 추출물 3
트립톤 5
글루코오스 15
탄산칼슘 2
pH 5.5
그 후 대조군, 바실러스 섭틸리스 IN-55만을 첨가한 실험군, 락토바실러스 플란타룸 BT-77만을 첨가한 실험군, 두 균주 모두를 첨가한 실험군을 이용해 사일리지 제조를 실시하였다. 30℃에서 36시간을 배양하여 각각의 샘플을 수득한 후 시료 10g을 취하여 증류수 100㎖에 넣고 4℃에서 24시간 보관 후 4중 가아제로 완전히 짜서 걸러낸 액을 pH meter를 이용하여 산도를 측정하였고, 그 결과는 표 7에 나타난 바와 같다.
또한 각각의 시료를 10배 희석하여 각각 시료에서 본 발명을 통한 신균주 락토바실러스 플란타룸과 바실러스 섭틸리스 균주의 균수를 확인하였고, 또한 시료에 진균 및 총균수를 측정하였으며, 그 결과는 표 7 에 나타난 바와 같다.
pH 총균수 IN-55 BT-77 곰팡이
짚 - 1.75×107 - - 4.2×106
짚+TGY배지 6.56 5.0×108 - - -
짚+TGY배지+IN-55 6.53 9.8×108 9.0×108 - -
짚+TGY배지+BT-77 4.12 2.65×107 - 2.65×107 -
짚+TGY배지
+IN-55+BT-77		 4.06 2.04×107 1.0×105 2.04×107 -
표 7을 통해 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 BT-77이 첨가된 실험군의 경우 pH는 약산성을 나타내었다. 총균수에 있어서 짚만을 이용한 기존의 사일리지 제조 실험군은 높은 곰팡이 수와 낮은 총균수를 보였고, 짚과 TGY 배지를 함께 처리한 실험군의 경우 짚만 처리한 실험군에 비하여 높은 수준의 균수를 확인할 수 있는데 이는 배지의 첨가로 인하여 기본 볏짚에 존재하는 미생물들의 생육이 활발히 이루어져 짚만 처리한 실험군보다 높은 총균수를 보였다. 본 발명에 따른 바실러스 섭틸리스 IN-55 또는 락토바실러스 플란타룸 BT-77이 첨가된 실험군에서는 처리균주 이외의 균은 확인되지 않았으며, 사일리지 제조에 유용한 미생물인 본 발명의 균주들만이 확인되었다. 이를 통하여 바실러스 섭틸리스 IN-55 또는 락토바실러스 플란타룸 BT-77의 처리가 사일리지 제조 시 다른 병원성 균의 성장을 효과적으로 억제함으로써 사료 저장성을 증진시키는데 상당히 유의함을 확인하였다.
실시예 5: 전자현미경 사진을 통한 사일리지 제조능 검정
바실러스 섭틸리스 IN-55 또는 락토바실러스 플란타룸 BT-77을 이용한 사일리지 제조능을 검정하기 위하여, 상기 실시예 4의 실험군들을 이용하여 전자현미경 사진을 촬영하였다. 전처리 후 실험군 별로 고정화 과정을 통하여 전자현미경 사진을 촬영하였다.
도 7은 실시예 4의 실험군 별로 볏짚 표면의 분해 정도를 전자현미경으로 관찰한 사진이고, 도 8은 실시예 4의 실험군 별로 처리 균주에 의해 분해되는 볏짚을 전자현미경으로 관찰한 사진이다. 이를 통하여 본 발명의 균주들을 처리하였을 때 볏짚의 분해 정도가 대조군에 비해 우수하며, 본 발명의 바실러스 섭틸리스 IN-55 및 락토바실러스 플란타룸 BT-77 균주를 함께 처리하였을 때 분해능이 더욱 우수함을 알 수 있다.
실시예 6: 신균주의 배양 조건
6-1: 바실러스 섭틸리스 IN -55의 배양 조건
사일리지 제조용 신균주인 바실러스 섭틸리스 IN-55 균주는 2.5ℓ 발효기를 사용하여 배양되었으며, 이때 사용한 배지는 표 1과 같은 조성으로 pH를 7.0으로 조절한 통상적인 액체 배지를 제조하여 사용하였다. 종배양은 500㎖ 삼각플라스크에 표 1과 같은 조성으로 pH를 7.0로 조절하여 100㎖의 액체 배지를 이용하여 배양하였다. 배양조건은 30℃, 200rpm으로 24시간 진탕 배양한 후 바실러스 섭틸리스가 포함된 종배양액 5%(v/v)를 1.5ℓ 생산 배지를 함유한 2.5ℓ 발효기에 접종하고 30℃에서 250rpm, 1vvm의 조건으로 72시간 동안 배양하였다.
6-2: 락토바실러스 플란타룸 BT -77의 배양 조건
사일리지 제조용 신균주인 락토바실러스 플란타룸 BT-77은 5ℓ 삼각플라스크를 사용하여 배양하였으며, 이때 사용한 배지는 MRS media(Difco Co.)를 구매하여 사용하였고, 종배양은 500㎖ 삼각플라스크에 표 2와 같은 조성으로 pH를 6.5로 조절하여 100ml의 액체 배지를 이용하여 배양하였다. 배양조건은 36℃에서 24시간 배양한 후 락토바실러스 플란타룸이 포함된 종배양액 5%(v/v)를 1.5ℓ 생산 배지를 함유한 5ℓ 삼각플라스크에 접종하고 36℃에서 48시간 동안 배양하였다.
한국생명공학연구원 KCTC11914BP 20110408 한국생명공학연구원 KCTC11915BP 20110408

Claims (6)

  1. 셀룰라제 활성을 갖는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) IN-55 (KCTC 11914BP) 또는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) BT-77 (KCTC 11915BP).
  2. 삭제
  3. 바실러스 섭틸리스 IN-55 (KCTC 11914BP) 및/또는 락토바실러스 플란타룸 BT-77 (KCTC 11915BP)을 포함하는 식물체 사일리지 발효용 미생물 첨가제.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 식물체는 볏짚, 라이그라스(ryegrass), 총체보리, 총체벼, 호밀 또는 옥수수인 식물체 사일리지 발효용 미생물 첨가제.
  5. 식물체에 바실러스 섭틸리스 IN-55 (KCTC 11914BP) 및/또는 락토바실러스 플란타룸 BT-77 (KCTC 11915BP)을 첨가하는 것을 특징으로 하는 식물체 사일리지 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 식물체는 볏짚, 라이그라스(ryegrass), 총체보리, 총체벼, 호밀 또는 옥수수인 식물체 사일리지 제조방법.
KR1020110045050A 2011-05-13 2011-05-13 바실러스 섭틸리스 ｉｎ-55, 락토바실러스 플란타룸 ｂｔ-77 및 이를 이용한 사일리지 제조방법 KR101380516B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110045050A KR101380516B1 (ko) 2011-05-13 2011-05-13 바실러스 섭틸리스 ｉｎ-55, 락토바실러스 플란타룸 ｂｔ-77 및 이를 이용한 사일리지 제조방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110045050A KR101380516B1 (ko) 2011-05-13 2011-05-13 바실러스 섭틸리스 ｉｎ-55, 락토바실러스 플란타룸 ｂｔ-77 및 이를 이용한 사일리지 제조방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20120126917A KR20120126917A (ko) 2012-11-21
KR101380516B1 true KR101380516B1 (ko) 2014-04-01

Family

ID=47512166

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110045050A KR101380516B1 (ko) 2011-05-13 2011-05-13 바실러스 섭틸리스 ｉｎ-55, 락토바실러스 플란타룸 ｂｔ-77 및 이를 이용한 사일리지 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101380516B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180056229A (ko) 2016-11-18 2018-05-28 전북대학교산학협력단 케나프 사일리지의 제조방법 및 이에 따른 케나프 사일리지
KR20210084874A (ko) 2019-12-30 2021-07-08 전북대학교산학협력단 진세노사이드 생물전환능을 갖는 균주 및 이를 포함하는 반추동물용 발효사료

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RS55497B1 (sr) 2013-09-23 2017-04-28 Aleksandra Ivetić Postupak i primena aditiva pri konzervisanju hrane
CN108522861A (zh) * 2018-02-26 2018-09-14 江西农业大学 一种复合微贮剂及制备微贮稻草的方法
CN109536416A (zh) * 2018-12-27 2019-03-29 南昌大学 一种降解构树叶单宁的青贮菌剂制备及其应用方法
CN110468062A (zh) * 2019-01-20 2019-11-19 河南中微生物科技研究院(有限合伙) 一种全株玉米青贮剂及其制备方法
CN113073064B (zh) * 2021-04-15 2022-06-03 江苏省农业科学院 一组高效降解纤维素的菌株、青贮菌剂及其应用
CN116574630B (zh) * 2023-01-31 2024-02-20 江苏省农业科学院 具有抑菌和抗氧化活性的乳杆菌、适用于秸秆青贮的复合微生物菌剂及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100287825B1 (ko) 1999-05-15 2001-04-16 이태일 가축용 복합 미생물 제제
JP2007082468A (ja) * 2005-09-22 2007-04-05 National Agriculture & Food Research Organization 飼料調製用微生物製剤とその利用
KR20070119825A (ko) * 2006-06-16 2007-12-21 대한민국(관리부서:농촌진흥청) 총체벼 사일리지 발효용 미생물 및 이를 이용한 총체벼사일리지의 제조 방법
KR101155158B1 (ko) 2009-09-30 2012-06-11 윤기홍 생존율이 우수한 신규 바실러스 서브틸리스 ５?ｂ 균주 및 이를 포함하는 사료용 첨가제 조성물

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100287825B1 (ko) 1999-05-15 2001-04-16 이태일 가축용 복합 미생물 제제
JP2007082468A (ja) * 2005-09-22 2007-04-05 National Agriculture & Food Research Organization 飼料調製用微生物製剤とその利用
KR20070119825A (ko) * 2006-06-16 2007-12-21 대한민국(관리부서:농촌진흥청) 총체벼 사일리지 발효용 미생물 및 이를 이용한 총체벼사일리지의 제조 방법
KR101155158B1 (ko) 2009-09-30 2012-06-11 윤기홍 생존율이 우수한 신규 바실러스 서브틸리스 ５?ｂ 균주 및 이를 포함하는 사료용 첨가제 조성물

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180056229A (ko) 2016-11-18 2018-05-28 전북대학교산학협력단 케나프 사일리지의 제조방법 및 이에 따른 케나프 사일리지
KR20210084874A (ko) 2019-12-30 2021-07-08 전북대학교산학협력단 진세노사이드 생물전환능을 갖는 균주 및 이를 포함하는 반추동물용 발효사료

Also Published As

Publication number Publication date
KR20120126917A (ko) 2012-11-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101380516B1 (ko) 바실러스 섭틸리스 ｉｎ-55, 락토바실러스 플란타룸 ｂｔ-77 및 이를 이용한 사일리지 제조방법
KR102004089B1 (ko) 음식물쓰레기 분해 혼합균주 및 이를 이용한 음식물쓰레기 분해 방법
KR102494770B1 (ko) 신규 페니바실러스 속 Daeji-L2 균주
KR101444196B1 (ko) 신규한 미생물 바실러스 코아귤란스 km-1, 및 이를 이용한 발효대두박 및 양어용 사료의 제조방법
KR101156161B1 (ko) 메밀 속성장으로부터 유래된 저영양성 바실러스 서브틸리스 에이치제이18-4 균주 및 이를 이용한 발효식품의 제조방법
KR101477228B1 (ko) 감마-아미노부티르산 생산능이 있는 신규한 락토바실러스 플랜타룸 ｋ154 균주
CN106591176B (zh) 一种戊糖乳杆菌及其应用
KR20110078609A (ko) 효소 활성 및 항균 활성을 갖는 저영양 바실러스 아밀로리큐파시엔스 ｂ4-4 균주
KR100627428B1 (ko) 미생물 오염을 방지하는 페디오코커스 펜토사세우스 st-01 및 그의 제조방법
KR20110076337A (ko) 섬유소 분해 활성을 가지는 신균주 바실러스 리체니포르미스 ｃｓ48 및 그의 배양액
KR101137401B1 (ko) 섬유소 분해 활성을 가지는 신균주 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 ｃｓ47 및 그의 배양액
KR101104178B1 (ko) 산성 셀룰라아제를 분비하는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 및 이의 용도
KR101062309B1 (ko) 셀룰라아제 및 자일라나아제를 분비하는 바실러스 리케니포르미스 및 이의 용도
KR100881720B1 (ko) 미생물을 나무토막에 배양하는 방법과 그 방법에 의해배양된 미생물배양목질칩
KR100265540B1 (ko) 신규한 바실러스 서브틸리스 에스와이8-24(케이에프씨씨-11027)와 대두박을 이용한 대량생산 방법
CN111601879A (zh) 微生物菌株布氏乳杆菌biocc 203 dsm 32650和布氏乳杆菌biocc 228 dsm 32651及其用途
KR101453000B1 (ko) 섬유소 분해 활성을 가지는 신균주 바실러스 서브틸리스 cs21 및 이의 배양액
CN113355265B (zh) 一种植物乳杆菌及其应用
Tampoebolon et al. Isolation and lignocellulolytic activities of fiber-digesting bacteria from digestive tract of termite (Cryptothermes sp.)
Sharma et al. Functional and genetic characterization of culturable bacteria associated with late phase of mushroom composting assessed by amplified rDNA restriction analysis
KR20130041530A (ko) 바실러스 섭틸리스 ｐｂｓ-5 및 이를 이용한 토양개량용 미생물 제제
KR20080033664A (ko) 고효율 청국장 발효 균주 바실러스 서브틸리스 지24의 선별및 동정
KR101231032B1 (ko) 자일란 분해활성이 우수한 신규한 균주 페니바실러스 일리노이센시스 ｓｋ2927
KR101231033B1 (ko) 자일란 분해활성이 우수한 신규한 균주 페니바실러스 자일란에스덴스 ｓｋ2925
CN117070406A (zh) 一株高温放线菌及其在平菇发酵料栽培中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170328

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180205

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190207

Year of fee payment: 6