CN113073064B

CN113073064B - 一组高效降解纤维素的菌株、青贮菌剂及其应用

Info

Publication number: CN113073064B
Application number: CN202110406795.6A
Authority: CN
Inventors: 袁洁; 张文洁; 许能祥; 丁成龙; 顾洪如; 宦海琳
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-04-15
Filing date: 2021-04-15
Publication date: 2022-06-03
Anticipated expiration: 2041-04-15
Also published as: CN113073064A

Abstract

本发明涉及青贮饲料加工领域，特别是涉及一组高效降解纤维素的菌株、青贮菌剂及其应用。本发明提供了一组高效降解纤维素的菌株，所述菌株包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)RS_LAB_2和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cly_29；所述植物乳杆菌RS_LAB_2的保藏编号为CCTCCNO:M2021166；所述枯草芽孢杆菌Cly_29的保藏编号为CCTCCNO:M2021106。采用本发明所述菌株能够获得品质更好的秸秆青贮饲料，且所述菌株更适用于秸秆青贮发酵过程。

Description

一组高效降解纤维素的菌株、青贮菌剂及其应用

技术领域

本发明涉及青贮饲料加工领域，特别是涉及一组高效降解纤维素的菌株、青贮菌剂及其应用。

背景技术

稻秸纤维素含量高，不能被乳酸菌发酵所降解，反刍动物也不能很好地消化利用。同时，稻秸可溶性碳水化合物含量低，茎叶附着乳酸菌数量少且发酵不稳定，因此，常规青贮难以调制出优质的稻秸青贮饲料，严重影响饲料营养品质和动物消化率。目前，联合添加乳酸菌和纤维素酶虽能有效提升稻秸青贮品质和瘤胃消化率，但由于酶制剂价格高且处理效果不稳定，生产上实际应用很少。

微生物种类多，每个菌种都会有很多成百上千的菌株。纤维素分解菌是一类能够产生纤维素酶的微生物。而这些菌株有着不同的环境耐受性，在不同材料青贮环境中也有着不同的适应力，发挥的作用也不尽相同。诸多研究也表明，为了获得更好的秸秆青贮饲料，研究和评价适用于秸秆青贮发酵过程的新菌株非常有必要。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一组高效降解纤维素的菌株、青贮菌剂及其应用。采用本发明所述菌株能够获得品种更好的秸秆青贮饲料，且所述菌株更适用于秸秆青贮发酵过程。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一组高效降解纤维素的菌株，所述菌株包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)RS_LAB_2和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cly_29；所述植物乳杆菌RS_LAB_2的保藏编号为CCTCC NO:M2021166；所述枯草芽孢杆菌Cly_29的保藏编号为CCTCC NO:M2021106。

本发明提供了一种高效降解纤维素的青贮菌剂，所述青贮菌剂的有效成分包括上述菌株。

优选的，青贮菌剂中植物乳杆菌RS_LAB_2与枯草芽孢杆菌Cly_29的活菌数量比为1:1。

优选的，所述青贮菌剂的总活菌数为10⁸～10¹⁰CFU/mL。

优选的，所述植物乳杆菌RS_LAB_2的16S rDNA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述枯草芽孢杆菌Cly_29的16S rDNA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明提供了上述青贮菌剂在高效降解纤维素中的应用。

本发明提供了上述青贮菌剂在提高秸秆青贮品质中的应用。

本发明提供了一种高效降解纤维素和/或提高秸秆青贮品质的方法，包括以下步骤：

将上述青贮菌剂喷施于秸秆上，进行发酵处理。

优选的，所述菌剂的喷施量为(5×10⁵)～(2×10⁶)CFU/g秸秆。

优选的，所述发酵处理的温度为15～25℃，时间为60d。

有益效果：一组具有高效降解纤维素作用的菌株，包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)RS_LAB_2和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cly_29本发明所述菌株能够获得品种更好的秸秆青贮饲料，且所述菌株更适用于秸秆青贮发酵过程。

另外，本发明所述青贮菌剂具有高效降解纤维素、提升秸秆青贮品质、提高干物质回收率等优点，可应用于秸秆青贮调制领域。

生物保藏信息

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)RS_LAB_2，于2021年1月27日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2021166。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cly_29，于2021年1月19日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2021106。

附图说明

图1为菌株枯草芽孢杆菌Cly_29的菌落形态，1为在CMC-Na平板的透明圈，2为在LB培养基上的菌落形态图；

图2为枯草芽孢杆菌Cly_29在48h内的产酶活性分析，其中Cly_29为枯草芽孢杆菌Cly_29，Growith time为生长时间，Cellulase activity为纤维素酶活性；

图3为不同初始pH下枯草芽孢杆菌Cly_29的产纤维素酶能力，其中Cly_29为枯草芽孢杆菌Cly_29，Initial pH为初始pH值，Cellulase activity为纤维素酶活性；

图4为不同发酵温度下枯草芽孢杆菌Cly_29的产纤维素酶能力，其中Cly_29为枯草芽孢杆菌Cly_29，Temperature为温度，Cellulase activity为纤维素酶活性。

图5为植物乳杆菌RS_LAB_2的生长曲线和产酸曲线，其中RS_LAB_2为植物乳杆菌RS_LAB_2，Time为时间。

图6为不同添加量菌剂对青贮稻秸纤维降低率的影响，NDF为中性洗涤纤维，ADF为酸性洗涤纤维，ADL为酸性洗涤木质素，HECL为半纤维素，CEL为纤维素。

具体实施方式

如无特殊要求，本发明所用原料均为本领域技术人员常规购买所得即可。

本发明提供了一组高效降解纤维素的菌株，所述菌株包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)RS_LAB_2(L.plantarum RS_LAB_2)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cly_29；所述植物乳杆菌RS_LAB_2的保藏编号为CCTCC NO:M2021166；所述枯草芽孢杆菌Cly_29的保藏编号为CCTCC NO:M2021106。本发明所述植物乳杆菌RS_LAB_2具有出生长速率快、产酸速度快、耐酸性良好的优势，有利于青贮中乳酸的产生；所述枯草芽孢杆菌Cly_29具有纤维素酶活性高、酸度和温度耐受性较好的优势，能够促进青贮中纤维分解；将两种菌株配合使用能够显著降低中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量，提高可溶性碳水化合物含量和干物质含量，提高了青贮稻秸营养品质；显著提高乳酸含量，降低pH值，提高了稻秸青贮发酵品质。因此，本发明所述菌株能够用于制备高效降解纤维素的青贮菌剂。

本发明提供了一种高效降解纤维素的青贮菌剂，所述青贮菌剂的有效成分包括上述菌剂，即包括植物乳杆菌RS_LAB_2和枯草芽孢杆菌Cly_29。在本发明中，所述青贮菌剂中植物乳杆菌RS_LAB_2与枯草芽孢杆菌Cly_29的活菌数量比优选为1:1；所述植物乳杆菌RS_LAB_2和枯草芽孢杆菌Cly_29的活菌数均优选为10⁸～10¹⁰CFU/mL，更优选为10⁹CFU/mL；所述青贮菌剂的总活菌数优选为10⁸～10¹⁰CFU/mL，更优选为10⁹CFU/mL。

在本发明中，所述植物乳杆菌RS_LAB_2的16S rDNA的核苷酸序列优选如SEQ IDNo.1所示：CGATACCTTAGGCGGCTGGTTCCTAAAGGTTACCCCACCGACTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTACTCTCGCGAGTTCGCAACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACCAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTGATAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTATCCATGTCCCCGAAGGGAACGTCTAATCTCTTAGATTTGCATAGTATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCATTCATCGTTTACGGTATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACCCATACTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCACTTCTTCGGTTGAGCCGAAGGTTTCACTTCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCAATACCTGAACAGTTACTCTCAGATATGTTCTTCTTTAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCATGGTGAGCCGTTACCCCACCATCTAGCTAATACGCCGCGGGACCATCCAAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTCAAGCTCGGACCATGCGGTCCAAGTTGTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAGGTGTTATCCCCCGCTTCTGGGCAGGTTTCCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCACTCAAATGTAAATCATGATGCAAGCACCAATCAATACCAGAGTTCGTTCGACTGCATTATAGAGACCATGC。本发明所述植物乳杆菌RS_LAB_2能够在12h内快速繁殖和产酸(如图5所示)，具有较强的生长及产酸性能，在NaCl浓度3.0％、15～35℃、pH 3.5～7.0之间的MRS液体培养基中良好生长；在NaCl浓度6.5％、pH 3.0的MRS培养基中一般生长；在NaCl浓度10.0％、5℃或45℃的MRS培养基中微弱生长；在NaCl浓度20.0％、pH 2.5的MRS液体培养基中不能生长。

在本发明中，所述枯草芽孢杆菌Cly_29的16S rDNA的核苷酸序列优选如SEQ IDNo.2所示：TCACCGACTTCGGGTGTTAAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATC。本发明所述枯草芽孢杆菌Cly_29在40℃、pH为6.0时，24h时酶活性最高，所产纤维素酶具有较好的酸度和温度耐受性。

申请号为CN202010824185.3的专利中公开的解淀粉芽孢杆菌SN-C菌株(保藏编号为CCTCCNO：M2020137)能显著提高玉米青贮饲料中纤维素降解率该菌株与对照组相比能降低3.10％的纤维素和1.75％半纤维素含量，而本申请枯草芽孢杆菌Cly_29与对照组相比能降低6.08％的纤维素和6.97％半纤维素含量。可见本发明所述枯草芽孢杆菌Cly_29在降解纤维素方面是优于现有技术所述菌株的。

本发明所述青贮菌剂中所述植物乳杆菌RS_LAB_2和枯草芽孢杆菌Cly_29优选以菌液的形式存在；所述青贮菌剂的制备方法优选包括以下步骤：将活化的植物乳杆菌RS_LAB_2和活化的枯草芽孢杆菌Cly_29分别接种于培养基上，进行培养，得植物乳杆菌RS_LAB_2菌液和枯草芽孢杆菌Cly_29菌液；将植物乳杆菌RS_LAB_2菌液和枯草芽孢杆菌Cly_29菌液按照活菌数量比1:1混合，得青贮菌剂。本发明对所述活化的方式没有任何限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。

本发明所述活化的植物乳杆菌RS_LAB_2和活化的枯草芽孢杆菌Cly_29的接种量优选均为1％；所述培养的温度优选为37℃；所述培养的转速优选为180rpm。经过本发明所述培养得到的菌液，活菌数优选菌为10⁸～10¹⁰CFU/mL，更优选为10⁹CFU/mL。

本发明所述植物乳杆菌RS_LAB_2优选接种到MRS液体培养基上；所述MRS液体培养基优选包括以下浓度的组分：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏5.0g/L、酵母浸粉4.0g/L、葡萄糖、20.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、乙酸钠5.0g/L、柠檬酸三钠2.0g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L和吐温1ml/L；所述MRS液体培养基的pH为6.5；所述MRS液体培养基培养基优选灭菌后使用；所述灭菌的温度优选为121℃；所述灭菌的时间优选为15min。

本发明所述枯草芽孢杆菌Cly_29优选接种到LB培养基上；所述LB培养基优选包括以下浓度的组分：胰蛋白胨10.0g/L、酵母提取物5.0g/L和NaCl 5.0g/L；所述LB培养基的pH为7.2；所述LB培养基培养基优选灭菌后使用；所述灭菌的温度优选为121℃；所述灭菌的时间优选为15min。

本发明在所述培养后，优选还包括对培养所得菌液进行离心处理，得到菌体；所述离心的转速优选为8000rpm；所述离心的时间优选为5min。

本发明所述青贮菌剂能够高效降解纤维素，进而获得品种更好的秸秆青贮饲料，且所述青贮菌剂更适用于秸秆青贮发酵过程。因此本发明所述菌剂能够用于高效降解纤维素和提高秸秆青贮品种。

本发明提供了上述青贮菌剂在高效降解纤维素中的应用。采用本发明所述青贮菌剂获得的产品中，中性洗涤纤维含量最低为562.82g/kg DM，半纤维素含量最低为222.95g/kg DM，可溶性碳水化合物含量最高为22.25g/kg DM，可见本发明所述青贮菌剂能够有效将稻秸中的纤维分解，产生更多的可溶性碳水化合物。

本发明提供了上述青贮菌剂在提高秸秆青贮品质中的应用本发明所述青贮菌剂能够降低产品中NDF、ADF、ADL、HECL和CEL的含量，提高WSC、干物质和IVDMD的含量，干物质含量最高为352.08g/kg DM，因此，本发明所述青贮菌剂能够提升青贮发酵品质。

将上述青贮菌剂喷施于秸秆上，进行发酵处理。

在本发明中，所述青贮菌剂的喷施量优选为(5×10⁵)～(2×10⁶)CFU/g秸秆，更优选为(5.5×10⁵)～(1.5×10⁶)CFU/g秸秆，最优选为(6×10⁵)～(1×10⁶)CFU/g秸秆。本发明将所述青贮菌剂喷施于秸秆上后，优选进行60d密封发酵，所述密封发酵的温度优选为15～25℃。

在本发明中，所述秸秆优选为成熟期的秸秆；所述秸秆的含水量优选为65wt.％～70wt.％。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种高效降解纤维素的青贮菌剂及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cly_29的分离与鉴定

1、分离纯化

从青贮稻秸中分离纯化获得枯草芽孢杆菌Cly_29，具体如下：称取20g自然青贮30d的稻秸，置于含180mL无菌生理盐水的密封三角瓶内，120rpm室温振荡1h，单层无菌纱布过滤，获得悬浮液。再将此悬浮液稀释1000倍，取稀释液100μl，涂布于羧甲基纤维素钠固体培养基，于37℃倒置培养24h。

挑出生长较好的单菌落，划线分离纯化2次，获得纯化菌株，并进行编号。

将纯化的菌株点接种在羧甲基纤维素钠固体培养基上，每块培养基点3次重复，37℃培养48h，测量菌落直径(D)和透明圈直径(H)，根据水解圈直径/菌落直径(D/H)大小判断细菌菌株产纤维素酶活的强弱，获得D/H比值较大的细菌菌株，命名为枯草芽孢杆菌Cly_29，进行甘油保藏。菌株在CMC-Na固体培养基上37℃恒温培养48h的菌落及透明圈(如图1中的1所示)。菌落在LB固体培养基上37℃恒温培养24h，菌落形态不规则，呈灰白色，菌落表明粗糙、不透明(如图1中的2所示)。

羧甲基纤维素钠(CMC-Na)固体培养基(g/L)：羧甲基纤维素钠5.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钠2.5g/L，硫酸镁0.3g/L，氯化钙0.3g/L，刚果红0.2g/L，琼脂20.0g/L，pH为7.2，CMC-Na固体培养基用于纤维素分解细菌的定性筛选。

LB固体培养基：胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，NaCl 5.0g/L，琼脂20.0g/L，pH为7.2，LB固体培养基用于菌株的形态特征观察。

2、菌株酶活测定

枯草芽孢杆菌Cly_29在LB培养基中活化获得种子液，活化菌株按1％的接种量接种到产酶发酵培养基，37℃，180rpm培养48h，8000rpm离心5min获得粗酶液，利用3，5-二硝基水杨酸(DNS)法测定粗酶液的纤维素酶酶活。

根据葡萄糖标准曲线计算待测酶液中的葡萄糖含量，以每1min内每1mL粗酶液水解底物生生1g葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位(1U/ml)，计算粗酶液的酶活，结果见表1～3和图2～4。

LB培养基：胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，NaCl 5.0g/L，pH为7.2，LB培养基用于菌株的保藏及活化。产酶发酵培养基：羧甲基纤维素钠15.0g/L，酵母提取物10.0g/L，NaCl 5.0g/L，KH₂PO₄1.0g/L，MgSO₄0.2g/L，pH为6.0，产酶发酵培养基用于纤维素分解细菌的产纤维素酶活分析。

表1枯草芽孢杆菌Cly_29在48h内的产酶活性分析

生长时间	6h	12h	24h	36h	48h
						纤维素酶活	17.84±0.14	33.50±0.26	41.03±0.26	36.81±0.29	32.20±0.26

表2不同初始pH下枯草芽孢杆菌Cly_29的产纤维素酶能力

表3不同发酵温度下枯草芽孢杆菌Cly_29的产纤维素酶能力

由表1～3和图2～4记载的可知枯草芽孢杆菌Cly_29在24h时酶活性最高，进一步分析枯草芽孢杆菌Cly_29在不同初始pH和不同发酵温度下培养24h时的纤维素酶活，表明枯草芽孢杆菌Cly_29所产纤维素酶具有较好的酸度和温度耐受性，由上述可知，枯草芽孢杆菌Cly_29在40℃、pH为6.0时，24h时酶活性最高。

3、枯草芽孢杆菌Cly_29的16S rDNA分子鉴定

提取枯草芽孢杆菌Cly_29的基因组DNA，采用原核生物16S rRNA基因扩增的通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID No.3)和1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT(SEQ IDNo.4)进行PCR扩增。

PCR体系建立(50μL)：Template DNA 1μL、ForwardPrimer(10uM)1μL、ReversePrimer(10uM)1μL、Taq-Plus 1μL、Taq-Plus Buffer 5μL、dNTPs(2mM)5μL、无菌水36μL。

PCR反应参数为：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性45s，72℃延伸90s，共30个循环，最后再72℃延伸10min。

PCR结束后，取5μL PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段大小约1.5kb。将PCR产物回收后送至北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。所测序列长度为1376bp，结果为SEQ ID No.1所示。

将所测得序列在NCBI上进行BLAST比对，结果见表4。

表4菌株Cly_29的16S rRNA序列的NCBI比对结果

菌株	相似菌株	同源性
			枯草芽孢杆菌Cly_29	Bacillus subtilis MT613628.1	99.93％

结果如表4所示，相似菌株的序列与枯草芽孢杆菌Cly_29相似性达99％的均为枯草芽孢杆菌。

实施例2

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)RS_LAB_2的分离与鉴定

1、分离纯化

从自然青贮稻秸中分离筛选获得植物乳杆菌RS_LAB_2，为同型发酵乳酸菌，具体如下：取10g青贮稻秸，置于含90mL无菌生理盐水的密封三角瓶内，120rpm室温振荡1h，单层无菌纱布过滤，获得滤液。再将此滤液稀释10000倍，取稀释液100μL，涂布于MRS培养基，于37℃倒置培养48h。

挑出MRS固体培养基上直径较大、生长较好的单菌落，划线分离纯化2次，将菌株在MRS固体培养基上划线分离，37℃培养48h，观察平板上的菌落形态，取典型菌落经革兰氏染色镜检为单一紫色细胞和过氧化氢酶反应阴性确认其为乳酸菌，对分离的菌株在MRS固体培养基上纯化2次。菌株命名为植物乳杆菌RS_LAB_2，进行甘油保藏。

MRS固体培养基：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏5.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸三钠2.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，琼脂20.0g/L，吐温1mlg/L，pH为6.5。

2、生理生化检测

对植物乳杆菌RS_LAB_2进行生理生化检测，结果见表5和图5。

表5植物乳杆菌RS LAB 2的生理生化特性

由表5和图5记载的可知，植物乳杆菌RS_LAB_2能够在NaCl浓度3.0％、15～35℃、pH 3.5～7.0之间的MRS液体培养基中良好生长(+++)；在NaCl浓度6.5％、pH 3.0的MRS培养基中一般生长(++)；在NaCl浓度10.0％、5℃和45℃的MRS培养基中微弱生长(+)；在NaCl浓度20.0％、pH 2.5的MRS液体培养基中不能生长(-)，革兰氏染色为阳性，菌株为杆状，过氧化氢酶为阴性，葡萄糖产气为阴性，发酵类型为阴性。而且植物乳杆菌RS_LAB_2能够在2～4h开始快速生长，在4～12h生长速率达到最大，大约在12h生长速度变缓，进入稳定期，随后菌液OD₆₀₀nm变化较小，在32h没有出现菌体生长衰退现象，植物乳杆菌RS_LAB_2在0～8h的产酸速率较快，8～16h产酸速率逐渐下降，16～32h产酸速率保持平稳，最终pH保持在3.8左右。

3、植物乳杆菌RS_LAB_2的16S rDNA分子鉴定

提取植物乳杆菌RS_LAB_2的基因组DNA，采用原核生物16S rRNA基因扩增的通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID No.3)和1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT(SEQ IDNo.4)进行PCR扩增。

PCR体系建立(50μL)：Template DNA 1μL、Forward Primer(10uM)1μL、ReversePrimer(10uM)1μL、Taq-Plus 1μL、Taq-Plus Buffer 5μL、dNTPs(2mM)5μL、无菌水36μL。

PCR结束后，取5μL PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段大小约1.5kb。将PCR产物回收后送至北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。所测序列长度为1458bp，结果为序列表中SEQ ID No.2所示。

将所测得序列在NCBI上进行BLAST比对，结果如6所示。

表6植物乳杆菌RS_LAB_2的16S rRNA序列的NCBI比对结果

菌株	相似菌株	同源性
			植物乳杆菌RS_LAB_2	Lactobacillus plantarum MG754568.1	99.79％

结果如表6所示，相似菌株的序列与植物乳杆菌RS_LAB_2相似性达99％的均为植物乳杆菌。

实施例3

不同菌株在稻秸青贮中的应用

原料准备：在成熟期刈割稻秸，含水量为65wt.％，去穗，用铡刀切至2～3cm，手工混合均匀。

菌剂准备：将枯草芽孢杆菌Cly_29活化获得种子液，活化菌株按1％的接种量接种到LB培养基，37℃，180rpm培养至活菌数达到10⁸～10¹⁰CFU/mL，8000rpm离心5min获得菌体，用生理盐水稀释至10⁸～10¹⁰CFU/mL；将植物乳杆菌RS_LAB_2活化获得种子液，活化菌株按1％的接种量接种到MRS培养基，37℃，180rpm培养至活菌数达到10⁸～10¹⁰CFU/mL，8000rpm离心5min获得菌体，用生理盐水稀释至10⁸～10¹⁰CFU/mL。

小组设置：对照组：无菌水；试验组1：100％植物乳杆菌RS_LAB_2；试验组2：100％枯草芽孢杆菌Cly_29；试验组3：67％植物乳杆菌RS_LAB_2、33％枯草芽孢杆菌Cly_29(2:1)；试验组4：50％植物乳杆菌RS_LAB_2、50％枯草芽孢杆菌Cly_29(1:1)；试验组5：33％植物乳杆菌RS_LAB_2、67％枯草芽孢杆菌Cly_29(1:2)。

稻秸青贮调制：将五组菌剂分别按照10⁶CFU/g秸秆的喷施量，用喷壶均匀喷洒于切碎的稻秸上，对照组添加相应体积的水(30mL/kg)。称取300g装入40cm×30cm的聚乙烯袋内，真空封口机封口，室温避光发酵。所述发酵的条件为：发酵温度为15～25℃，发酵时间为60d，分析青贮稻秸发酵品质和营养品质。

青贮稻秸品质检测：青贮发酵60d后，取出部分青贮饲草进行发酵品质和营养品质分析。

称取20g青贮饲料，加入180ml灭菌水，充分震荡，使用Mettler Toledo型pH计测定滤液pH值。

滤液经0.22μm水相滤膜过滤后，利用高效液相色谱分析滤液中有机酸含量。

取100g左右青贮饲料置于65℃烘箱中风干至恒重，测定干物质含量。样品粉碎后过0.38mm筛子，采用蒽酮-硫酸比色法测定可溶性碳水化合物含量。

采用范氏洗涤纤维法测定中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和酸性洗涤木质素含量，计算获得纤维素和半纤维素含量。

采用胃蛋白酶-纤维素酶两步法测定干物质体外消化率。

检测结果见表7～表9。

表7添加不同菌剂对青贮稻秸发酵品质的影响

注:同列数据上标不同字母表示差异显著(P<0.05)。

表8添加不同菌剂对青贮稻秸营养品质的影响

注:同列数据上标不同字母表示差异显著(P<0.05)，其中NDF为中性洗涤纤维，ADF为酸性洗涤纤维，ADL为酸性洗涤木质素，HECL为半纤维素，CEL为纤维素，WSC为可溶性碳水化合物，IVDMD为干物质体外消化率。

表9添加不同菌剂对青贮稻秸纤维降低率的影响

处理	试验组1	试验组2	试验组3	试验组4	试验组5
						NDF(％)	1.17	6.33	3.81	7.04	6.67
ADF(％)	-0.15	5.87	1.29	3.77	4.79
						ADL(％)	3.24	3.63	4.73	6.41	5.57
HECL(％)	3.02	6.97	7.34	11.61	9.31
						CEL(％)	-0.47	6.08	0.97	3.53	4.71

由表7～表9可知，试验组1单独喷施植物乳杆菌RS_LAB_2，乳酸含量较高，pH含量较低，表明筛选的植物乳杆菌RS_LAB_2能迅速将稻秸酸化，但是其降低中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、木质素、半纤维素和纤维素的效果不显著，不能够促进稻秸纤维素的分解；试验组2单独添加枯草芽孢杆菌Cly_29，中性洗涤纤维含量较低、酸性洗涤纤维含量最低、半纤维素含量较低、纤维素含量最低，与对照组相比，试验组2中性洗涤纤维含量降低6.33％，酸性洗涤纤维含量降低5.87％，半纤维素含量降低6.97％，纤维素含量降低6.08％，表明筛选的枯草芽孢杆菌Cly_29能够有效促进青贮稻秸纤维的分解，增加可溶性碳水化合物的含量，但是其pH较高，不利于青贮pH的快速降低。因此，单独添加植物乳杆菌RS_LAB_2或者枯草芽孢杆菌Cly_29不能够满足结构性碳水化合物分解和青贮发酵品质提升的技术要求。

因此，将植物乳杆菌RS_LAB_2和枯草芽孢杆菌Cly_29进行不同比例的复配，筛选两株菌的添加比例；试验组3、4、5的结果表明，试验组3和4的pH值没有差异，显著低于试验组5；试验组3和4的乳酸含量、乙酸含量、乳酸/乙酸没有显著差异，显著高于试验组5。因此，试验组3和4均能够快速将青贮稻秸中的可溶性糖转化为乳酸和乙酸，降低pH，提高青贮发酵品质；4组的中性洗涤纤维含量最低为562.82g/kg DM，半纤维素含量最低为222.95g/kgDM，且酸性洗涤纤维、酸性洗涤木质素、纤维素含量没有显著性差异，可溶性碳水化合物含量最高为352.08g/kg DM。与对照组相比，试验组4中性洗涤纤维含量降低7.04％，酸性洗涤纤维含量降低3.77％，半纤维素含量降低11.61％，纤维素含量降低3.52％。因此，试验组4能够有效将稻秸中的纤维分解，产生更多的可溶性碳水化合物，为乳酸菌繁殖提高底物。同时，试验组4干物质含量最高为352.08g/kg DM，意味着试验组4干物质回收率最高。

综合表7～表9，试验组4即50％植物乳杆菌RS_LAB_2、50％枯草芽孢杆菌Cly_29(1:1)的添加比例组合，不仅能够有效地将稻秸中的纤维素转化为可溶性碳水化合物，还能够快速将黑麦草中的可溶性碳水化合物转化为乳酸，降低pH，从而提高青贮营养品质和发酵品质；同时试验组4能够提高青贮稻秸干物质回收率和干物质体外消化率。

实施例4

不同喷施量的菌剂在稻秸青贮中的应用

原料准备、菌剂准备、稻秸青贮调制等实施步骤参照实施例3。在菌剂准备中，按照实施例3的结果将L.plantarum RS_LAB_2和枯草芽孢杆菌Cly_29按照1:1的比例混合，使得菌剂中的活菌数达到10⁸～10¹⁰CFU/mL。将制备的菌剂分别按照10⁵CFU/g秸秆(试验组1)、2×10⁵CFU/g秸秆(试验组2)、5×10⁵CFU/g秸秆(试验组3)、10⁶CFU/g秸秆(试验组4)、2×10⁶CFU/g秸秆(试验组5)的喷施量，用喷壶均匀喷洒于切碎的稻秸上，对照组喷施相应体积的水，喷施量为30mL/Kg。称取300g装入40cm×30cm的聚乙烯袋内，真空封口机封口，室温避光发酵。所述发酵的条件为：发酵温度为15～25℃，发酵时间为60d，分析青贮稻秸发酵品质和营养品质。

青贮稻秸品质检测：青贮发酵60d后，取出部分青贮饲草进行发酵品质和营养品质，检测方法同实施例3，检测结果见表10～表12和图6。

表10不同添加量菌剂对青贮稻秸发酵品质的影响

注:同列数据上标不同字母表示差异显著(P<0.05)。

表11不同添加量菌剂对青贮稻秸营养品质的影响

注:同列数据上标不同字母表示差异显著(P<0.05)。

表12添加不同菌剂对青贮稻秸纤维降低率的影响

处理	试验组1	试验组2	试验组3	试验组4	试验组5
						NDF(％)	1.06	2.97	5.01	7.04	6.77
ADF(％)	0.18	1.07	2.43	3.77	2.86
						ADL(％)	-1.19	0.86	3.86	6.41	5.70
HECL(％)	2.29	5.62	8.62	11.61	12.23
						CEL(％)	0.31	1.09	2.29	3.53	2.60

由表10～表12和图6记载的可知可知，相比于低喷施量的试验组1(10⁵CFU/g秸秆)和试验组2(2×10⁵CFU/g秸秆)，试验组3(5×10⁵CFU/g秸秆)、试验组4(10⁶CFU/g秸秆)和试验组5(2×10⁶CFU/g秸秆)能够有效提升乳酸含量，降低pH；试验组4(10⁶CFU/g秸秆)和试验组5(2×10⁶CFU/g秸秆)能够有效降低青贮稻秸中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、半纤维素和纤维素含量，提升可溶性碳水化合物和干物质含量，提高干物质体外消化率。与对照组相比，试验组4(10⁶CFU/g秸秆)中性洗涤纤维含量降低7.04％，酸性洗涤纤维含量降低3.77％，半纤维素含量降低11.61％，纤维素含量降低3.52％。综合表10～表12和图6，试验组4(2×10⁶CFU/g秸秆)效果最好，能够高效降解青贮稻秸纤维素和提升秸秆青贮品质。

实施例5

不同菌剂在稻秸青贮中的应用

原料准备、菌剂准备、稻秸青贮调制等实施步骤参照实施例3。在稻秸青贮调制中设置八个处理，分别是对照组(无菌水)，试验组1(商品菌剂，秸秆发酵剂(混合型饲料添加剂嗜酸乳杆菌和酿酒酵母秸秆发酵剂)，购自于淘宝，店名为南华千牧旗舰店，添加量为0.1mg/g)，试验组2(植物乳杆菌RS_LAB_2，喷施量10⁶CFU/g秸秆)，试验组3(50％植物乳杆菌RS_LAB_2和50％枯草芽孢杆菌Cly_29，活菌数量比为1:1，喷施量为10⁶CFU/g秸秆)，试验组4(布氏乳杆菌，喷施量为10⁶CFU/g秸秆)，试验组5(50％布氏乳杆菌和50％枯草芽孢杆菌Cly_29，喷施量为10⁶CFU/g秸秆)。商品菌剂可用于秸秆、牧草等青贮，产品标示为秸秆发酵剂。布氏乳杆菌购自中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016280。发酵方法与实施例4相同。青贮发酵60天后分析青贮稻秸发酵品质、营养品质。

青贮稻秸品质分析方法与实施例3相同，结果如13～表15所示。

表13不同添加量菌剂对青贮稻秸发酵品质的影响

注:同列数据上标不同字母表示差异显著(P<0.05)。

表14不同添加量菌剂对青贮稻秸营养品质的影响

注:同列数据上标不同字母表示差异显著(P<0.05)

表15添加不同菌剂对青贮稻秸纤维降低率的影响

处理	试验组1	试验组2	试验组3	试验组4	试验组5
						NDF(％)	0.56	1.17	7.04	0.32	1.96
ADF(％)	-0.97	-0.15	3.77	0.45	0.34
						ADL(％)	6.32	3.24	6.41	0.48	1.27
HECL(％)	2.70	3.02	11.61	0.15	4.23
						CEL(％)	-1.64	-0.47	3.53	0.45	0.26

由表13～表15可知，与对照组、试验组4、试验组5相比，试验组1、试验组2、试验组3能够有效提升乳酸含量、降低pH，提高青贮发酵品质。与对照组、试验组1、试验组2、试验组4、试验组5相比，试验组3能够有效降低中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、半纤维素和纤维素含量、提高可溶性碳水化合物含量、提高干物质体外消化率、提高干物质含量，提高青贮稻秸营养价值。因此，通过在青贮稻秸中添加本发明所述的青贮菌剂能够达到高效降解纤维素、提升秸秆青贮品质、提高干物质回收率的效果，对秸秆饲料化的高效利用具有重要意义。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一组高效降解纤维素的菌株、青贮菌剂及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1458

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgatacctta ggcggctggt tcctaaaggt taccccaccg actttgggtg ttacaaactc 60

tcatggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg gcatgctgat 120

ccgcgattac tagcgattcc gacttcatgt aggcgagttg cagcctacaa tccgaactga 180

gaatggcttt aagagattag cttactctcg cgagttcgca actcgttgta ccatccattg 240

tagcacgtgt gtagcccagg tcataagggg catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc 300

tccggtttgt caccggcagt ctcaccagag tgcccaactt aatgctggca actgataata 360

agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacaacca 420

tgcaccacct gtatccatgt ccccgaaggg aacgtctaat ctcttagatt tgcatagtat 480

gtcaagacct ggtaaggttc ttcgcgtagc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg 540

tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttc agccttgcgg ccgtactccc caggcggaat 600

gcttaatgcg ttagctgcag cactgaaggg cggaaaccct ccaacactta gcattcatcg 660

tttacggtat ggactaccag ggtatctaat cctgtttgct acccatactt tcgagcctca 720

gcgtcagtta cagaccagac agccgccttc gccactggtg ttcttccata tatctacgca 780

tttcaccgct acacatggag ttccactgtc ctcttctgca ctcaagtttc ccagtttccg 840

atgcacttct tcggttgagc cgaaggtttc acttcagact taaaaaaccg cctgcgctcg 900

ctttacgccc aataaatccg gacaacgctt gccacctacg tattaccgcg gctgctggca 960

cgtagttagc cgtggctttc tggttaaata ccgtcaatac ctgaacagtt actctcagat 1020

atgttcttct ttaacaacag agttttacga gccgaaaccc ttcttcactc acgcggcgtt 1080

gctccatcag actttcgtcc attgtggaag attccctact gctgcctccc gtaggagttt 1140

gggccgtgtc tcagtcccaa tgtggccgat taccctctca ggtcggctac gtatcattgc 1200

catggtgagc cgttacccca ccatctagct aatacgccgc gggaccatcc aaaagtgata 1260

gccgaagcca tctttcaagc tcggaccatg cggtccaagt tgttatgcgg tattagcatc 1320

tgtttccagg tgttatcccc cgcttctggg caggtttccc acgtgttact caccagttcg 1380

ccactcactc aaatgtaaat catgatgcaa gcaccaatca ataccagagt tcgttcgact 1440

gcattataga gaccatgc 1458

<210> 2

<211> 1376

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcaccgactt cgggtgttaa aactctcgtg gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg 60

aacgtattca ccgcggcatg ctgatccgcg attactagcg attccagctt cacgcagtcg 120

agttgcagac tgcgatccga actgagaaca gatttgtggg attggcttaa cctcgcggtt 180

tcgctgccct ttgttctgtc cattgtagca cgtgtgtagc ccaggtcata aggggcatga 240

tgatttgacg tcatccccac cttcctccgg tttgtcaccg gcagtcacct tagagtgccc 300

aactgaatgc tggcaactaa gatcaagggt tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc 360

tcacgacacg agctgacgac aaccatgcac cacctgtcac tctgcccccg aaggggacgt 420

cctatctcta ggattgtcag aggatgtcaa gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga 480

attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca attcctttga gtttcagtct 540

tgcgaccgta ctccccaggc ggagtgctta atgcgttagc tgcagcacta aggggcggaa 600

accccctaac acttagcact catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt 660

tcgctcccca cgctttcgct cctcagcgtc agttacagac cagagagtcg ccttcgccac 720

tggtgttcct ccacatctct acgcatttca ccgctacacg tggaattcca ctctcctctt 780

ctgcactcaa gttccccagt ttccaatgac cctccccggt tgagccgggg gctttcacat 840

cagacttaag aaaccgcctg cgagcccttt acgcccaata attccggaca acgcttgcca 900

cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccgtg gctttctggt taggtaccgt 960

caaggtaccg ccctattcga acggtacttg ttcttcccta acaacagagc tttacgatcc 1020

gaaaaccttc atcactcacg cggcgttgct ccgtcagact ttcgtccatt gcggaagatt 1080

ccctactgct gcctcccgta ggagtctggg ccgtgtctca gtcccagtgt ggccgatcac 1140

cctctcaggt cggctacgca tcgttgcctt ggtgagccgt tacctcacca actagctaat 1200

gcgccgcggg tccatctgta agtggtagcc gaagccacct tttatgtttg aaccatgcgg 1260

ttcaaacaac catccggtat tagccccggt ttcccggagt tatcccagtc ttacaggcag 1320

gttacccacg tgttactcac ccgtccgccg ctaacatcag ggagcaagct cccatc 1376

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims

1.一组高效降解纤维素的菌株，其特征在于，所述菌株包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)RS_LAB_2和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cly_29；所述植物乳杆菌RS_LAB_2的保藏编号为CCTCC NO:M2021166；所述枯草芽孢杆菌Cly_29的保藏编号为CCTCC NO:M2021106。

2.一种高效降解纤维素的青贮菌剂，其特征在于，所述青贮菌剂的有效成分包括权利要求1所述菌株。

3.根据权利要求2所述青贮菌剂，其特征在于，青贮菌剂中植物乳杆菌RS_LAB_2与枯草芽孢杆菌Cly_29的活菌数量比为1:1。

4.根据权利要求3所述青贮菌剂，其特征在于，所述青贮菌剂的总活菌数为10⁸～10¹⁰CFU/mL。

5.根据权利要求3所述青贮菌剂，其特征在于，所述植物乳杆菌RS_LAB_2的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述枯草芽孢杆菌Cly_29的16S rDNA的核苷酸序列如SEQID No.2所示。

6.权利要求2～5任一项所述青贮菌剂在高效降解纤维素中的应用。

7.权利要求2～5任一项所述青贮菌剂在提高秸秆青贮品质中的应用。

8.一种高效降解纤维素和/或提高秸秆青贮品质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将权利要求2～5任一项所述青贮菌剂喷施于秸秆上，进行发酵处理。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述菌剂的喷施量为(5×10⁵)～(2×10⁶)CFU/g秸秆。

10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述发酵处理的温度为15～25℃，时间为60d。