CN114921375B - 一株高产纤维素酶的芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株高产纤维素酶的芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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    • Y02P60/87—Re-use of by-products of food processing for fodder production

Abstract

本发明公开了一株高产纤维素酶的芽孢杆菌及其应用。该产纤维素酶芽孢杆菌的名称为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)GST‑24，保藏于位于州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:62124，保藏日期为2021年12月13日。该高地芽孢杆菌为革兰氏染色阳性杆菌，抗逆性强，可在pH4.5～9.0生长，耐盐，耐高温，对水溶性碳水化合物含量低的牧草能显著提高其青贮发酵品质，并降低纤维含量。因此可在我国各地使用，特别对于纤维含量高的青贮原料效果独特，克服了因水溶性碳水化合物含量低造成的青贮饲料发酵不佳的问题。

Description

一株高产纤维素酶的芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物应用和饲料调制加工技术领域，具体涉及一株高产纤维素酶的芽孢杆菌及其应用。
背景技术
青贮饲料由于气味香甜、柔软多汁、营养保存好、适口性佳等特点，已成为畜牧业不可或缺的基础性饲料。青贮饲料不仅能提高肉、奶的品质，而且能充分利用不可直接饲用的植物材料，以及减少农产品加工副产物的浪费。因此，青贮饲料已被世界各国所重视，特别是畜牧业发达国家。青贮饲料是依靠原料上附着的乳酸菌在厌氧条件下将原材料中的水溶性碳水化合物转化成以乳酸为主的有机酸，使pH下降，从而抑制有害菌的生长和繁殖，使饲料得以长期保存。因此，水溶性碳水化合物和乳酸菌对青贮发酵品质起关键作用。在生产实践中，对于青贮原材料水溶性碳水化合物不足时，难以得到优质的青贮饲料。针对这一问题，大多采用添加糖源或产糖物质，如糖类、含糖物质多的副产物或纤维素酶等，但需要人力物力和成本相对较高。纤维素分解菌是一种可产生纤维素酶的微生物，其中芽孢杆菌具产纤维素酶的能力。因此，在青贮过程中如有产纤维素酶能力强的芽孢杆菌存在与作用，可将纤维成分降解为单糖，从而为乳酸菌生长提供营养，同时也可减少青贮饲料中的纤维含量，既改善发酵品质，又提高消化利用率，将会成为极为有效的青贮饲料添加剂。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株高产纤维素酶的芽孢杆菌。
本发明的另一目的在于提供上述高产纤维素酶的芽孢杆菌在青贮调制中的应用。
为实现上述目的，本发明通过以下述技术方案实现：
一株高产纤维素酶的芽孢杆菌，名称为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)GST-24，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地点为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏号为GDMCC No:62124，保藏日期为2021年12月13日。
上述高地芽孢杆菌GST-24的生物学特性为革兰氏染色阳性杆菌，抗逆性强，在pH4.5～9.0的范围均可生长，耐盐(在7％NaCl可旺盛生长)，耐高温(50℃可生长)，在厌氧条件下也可正常生长。
本发明通过测定纤维素酶活力筛选出一株来源于土壤的高产纤维素酶高地芽孢杆菌GST-24。提取高地芽孢杆菌GST-24全长基因，然后运用PCR扩增引物25F(SEQ ID NO:1)和1492R(SEQ ID NO:2)，扩增出16S rDNA基因，在NCBI上对比相关序列，确定其相似菌种。最后，将筛选出的菌株、对照菌植物乳杆菌(实验室已有菌株)及其混合分别添加到象草中进行青贮，开封后分析青贮发酵品质及纤维含量，并与对照菌进行对比，确认高地芽孢杆菌GST-24可显著提高牧草青贮发酵品质，并降低粗纤维含量。
上述高产纤维素酶的芽孢杆菌在青贮调制中的应用，优选包括如下步骤：
(1)将待发酵饲料切短；
(2)将切短处理后的待发酵饲料和上述高产纤维素酶的芽孢杆菌混合均匀；
(3)将步骤(2)最终得到的饲料脱气、密封后贮藏。
作为一种优选方案，步骤(1)中所述的切短的规格优选为切短至2～3cm。
步骤(2)中所述的高产纤维素酶的芽孢杆菌的添加量优选按每kg待发酵饲料配比1.0×108个以上所述的高产纤维酶芽孢杆菌计算。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供了一株高产纤维素酶的高地芽孢杆菌GST-24，菌株可在我国各地使用，特别对于纤维含量高的青贮原料效果独特，克服了因水溶性碳水化合物含量低造成的青贮饲料发酵品质差的问题。
(2)本发明利用高地芽孢杆菌GST-24改善青贮饲料发酵品质，成本低，安全，可靠，易于利用。
(3)本发明使用的高地芽孢杆菌GST-24青贮效果比乳酸菌添加剂效果更佳，且可以降低粗纤维含量。
附图说明
图1为本发明提供的芽孢杆菌和乳酸菌对象草青贮料粗纤维的影响图；其中，标不同字母表示差异显著，P<0.05；GST-24为高地芽孢杆菌；混合菌为高地芽孢杆菌和植物乳杆菌混合。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实例1：芽孢杆菌的分离、筛选以及生理生化测定
将采集自广东的土壤、枯枝落叶及腐败植物秸秆等样品，分别称取10g，倒入90mL无菌水，放置200～250rpm摇床中震荡30min，吸取1mL到9mL无菌水中，依次稀释至10-2～10-6浓度，分别取0.02mL涂至LB固体培养基，37℃有氧培养24～48h，用接种针挑取菌落不一的单菌落，再分别将单菌落接种到5mL LB液体培养基中，37℃厌氧培养24～48h；在LB固体培养基上反复划线分离，通过液-固-液3代以上的步骤分离纯化菌株，将纯化的菌株接种在羧甲基纤维素钠固体培养基上，每块培养基点三次重复，37℃培养2d～4d。菌落长出后，使用0.2％wt的刚果红进行染色，再用1mol/L的NaCl进行脱色，菌落周围形成染色圈证明此菌分泌纤维素酶，测量透明圈直径(D)和菌落直径(d)，根据透明圈直径和菌落直径的比值(D/d)初步判断该菌株产纤维素酶能力的大小，将比值较大的菌落标记，进行复筛。将初筛比值较大的菌株接种于种子培养基中，37℃培养12h，然后以2％v/v的接种量接种于发酵培养基中，取发酵液1mL离心，收集上清液为待测粗酶液。以CMC-Na为底物，采用DNS法测定还原糖计算纤维素酶活力。筛选出纤维素酶活力最高的芽孢杆菌。
从表1数据看出，菌株GST-24产纤维素酶能力最高，因此选用此菌株进行进一步生理生化测定。
表1菌株透明圈与菌落直径比和酶活
芽孢杆菌GST-24的分离、生理生化试验、培养基及其配制的方法如下：
1)革兰氏染色、芽孢染色及形状观察参照东秀珠主编的《常见细菌系统鉴定手册》。
2)芽孢杆菌生长pH调节使用浓度为4mol/L的NaOH溶液和浓度为4mol/L的HCl溶液。
3)产纤维素酶芽孢杆菌的筛选使用羧甲基纤维素钠培养基和发酵培养基培养；明胶液化、淀粉水解、柠檬酸盐利用、硝酸盐还原试验、MR试验和V.P试验分别采用明胶培养基、淀粉培养基、柠檬酸盐培养基、硝酸盐培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基培养。
4)培养基
LB培养基：液体培养基为蛋白胨10.0g、酵母提取物5.0g、葡萄糖1.0g、氯化钠5.0g，固体培养基是在液体培养基中加15g/L琼脂，蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min。
羧甲基纤维素钠培养基：羧甲基纤维素纳10.0g、硫酸铵4.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁)0.5g、蛋白胨10.0g、琼脂15.0g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，121℃灭菌20min。
发酵培养基：羧甲基纤维素纳10.0g、蛋白胨10.0g、酵母提取物5.0g、磷酸二氢钾2.0g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)1.0g、氯化钠5.0g、蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，121℃灭菌20min。
硝酸盐培养基：蛋白胨10.0g、硝酸钾2.0g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.4，121℃灭菌20min。
柠檬酸盐培养基：氯化钠5.0g、硫酸镁0.2g、磷酸二氢铵1.0g、磷酸氢二钾1.0g、柠檬酸钠5.0g、琼脂(Agar)20.0g、0.2％wt溴麝香草酚蓝溶液40mL，蒸馏水定容至1000mL，pH6.8，121℃灭菌20min。
葡萄糖蛋白胨水培养基：蛋白胨0.5g、葡萄糖0.5g、磷酸氢二钾0.2g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.2～7.4，121℃灭菌20min。
淀粉培养基：蛋白胨10.0g、牛肉膏粉5.0g、氯化钠5.0g、可溶性淀粉10.0g、琼脂15.0g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min。
明胶培养基：蛋白胨10.0g、牛肉膏粉3.0g、氯化钠5.0g、明胶120g、蒸馏水定容至1000mL，pH 7.2～7.4，121℃灭菌20min。
检测结果如表2所示：
表2菌株GST-24的生理生化特性
+++：生长旺盛；++：生长良好；+：生长；-：不生长。
实例2：芽孢杆菌的鉴定
实施例1所得菌株在5mL的LB培养基中37℃于250rpm的转速振荡培养过夜，菌液移入1.5mL的离心管中，10000rpm离心3min～5min收集菌，用TE(10mmol/L Tris–HCl、0.1mmol/L EDTA，pH 8.0)清洗两次，提取菌株全长基因，然后运用PCR扩增引物25F(5`-AACTGAAGAGTTTGATCCTGGCTC-3`)和1492R(5`-TACGGCTACCTTGTTACGACT-3`)，扩增出16SrDNA基因，送至华大基因(中国)测序，在NCBI基因库上对比相关序列，序列如下所示，确定GST-24为高地芽孢杆菌。
AGCTTGCTCCCGGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCAAGAGTAACTGCTTGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCTGCGAGACCGCAAGGTTTAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACC。
实例3：添加到青贮饲料中的效果
以象草(表3)为材料进行了青贮添加试验。将材料切短至2-3cm，混合均匀，处理分别为对照、添加高地芽孢杆菌(GST-24)、添加植物乳杆菌CCZZ1(已在国家发明专利“一株耐低温乳酸菌Lactobacillus plantarum CCZZ1及其应用-201210192285.4”中公开)和添加混合菌液(高地芽孢杆菌和植物乳杆菌CCZZ1按菌数1：1配比混合得到)，对照添加等量无菌水。每kg新鲜材料分别加入菌数约1.0×108cfu的菌液，每个处理3个重复。采用容积为1L的青贮发酵罐青贮，青贮45d后测定其发酵品质和粗纤维含量。
结果如下：添加GST-24的青贮料的pH降至3.99，氨态氮降至3.95％TN，均显著低于对照和植物乳杆菌添加(表4)，乳酸含量显著高于对照和植物乳杆菌添加(表4)，且粗纤维含量显著低于对照和植物乳杆菌添加(图1)。两种菌混合添加，虽然比对照和植物乳杆菌添加的pH低、乳酸含量高，但效果不及GST-24单独添加。因此，添加GST-24显著提高了象草的青贮发酵品质，并降低了象草的粗纤维含量，添加效果优于常用的青贮添加菌植物乳杆菌。
表3象草化学特性及微生物数量
注：FM，青贮饲料鲜物质；DM，青贮饲料干物质。
表4添加芽孢杆菌和乳酸菌对象草青贮发酵品质的影响
注：DM，青贮饲料的干物质；TN，表示总氮；不同处理同列小写字母不同者为差异显著。
营养成分及青贮发酵指标测定方法：
1)牧草营养成分测定及微生物分析：干物质(DM)含量采用张丽英的饲料分析中70℃烘干法，粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定(定氮仪KN680，ALVA仪器有限公司)，粗纤维、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量采用滤袋法测定，粗脂肪含量采用乙醚提取法测定(SLF-06，杭州托普仪器有限公司)，粗灰分含量采用灼烧法测定。水溶性碳水化合物(Watersoluble-carbohydrates，WSC)含量采用蒽酮-硫酸法测定，氨态氮含量用凯氏定氮法测定，缓冲能采用盐酸、氢氧化钠滴定法测定，乳酸菌采用MRS(de-Man Rogosa Sharpe)琼脂培养基培养计数，细菌采用营养琼脂培养基(Nutrient ager，广东环凯微生物有限公司)培养计数，酵母菌和霉菌数量采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato-dextrose agar，广东环凯微生物有限公司)培养计数。乳酸菌用厌氧箱37℃培养1d～2d；细菌、酵母菌、霉菌用生化培养箱30℃培养2d～4d。
发酵品质分析：青贮袋开封后，取20g混匀的青贮料放入自封袋中，加入80mL蒸馏水，置于4℃冰箱浸泡18h后过滤，用pH计(Mettler Toledo FE28 pH计)测定浸提液pH。乳酸菌、细菌、酵母菌和霉菌数量测定同上，有机酸含量采用岛津LC-20AT型高效液相色谱仪测定：色谱条件：色谱柱(Eleven Organic Acids on Transgenomic COREGel 87H3)，检测器：RID-10A，流动相为0.1mmol/L的磷酸溶液，流速1mL/min，柱温40℃，检测波长210nm，进样量20μL。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一株高产纤维素酶的芽孢杆菌及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PCR扩增引物25F
<400> 1
aactgaagag tttgatcctg gctc 24
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PCR扩增引物1492R
<400> 2
tacggctacc ttgttacgac t 21
<210> 3
<211> 1377
<212> DNA
<213> Bacillus altitudinis
<220>
<223> GST-24
<400> 3
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cgaagaacct taccaggtct tgacatcctc tgacaaccct agagataggg ctttcccttc 960
ggggacagag tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1020
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agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg 1320
tacacaccgc ccgtcacacc acgagagttt gcaacacccg aagtcggtga ggtaacc 1377

Claims (5)

1.一株高产纤维素酶的芽孢杆菌，其特征在于：名称为高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）GST-24，保藏于位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No: 62124，保藏日期为2021年12月13日。
2.权利要求1所述的高产纤维素酶的芽孢杆菌在青贮调制中的应用。
3.根据权利要求2所述的高产纤维素酶的芽孢杆菌在青贮调制中的应用，其特征在于包括如下步骤：
（1）将待发酵饲料切短；
（2）将切短处理后的待发酵饲料和权利要求1所述的高产纤维素酶的芽孢杆菌混合均匀；
（3）将步骤（2）最终得到的饲料脱气、密封后贮藏。
4.根据权利要求3所述的高产纤维素酶的芽孢杆菌在青贮调制中的应用，其特征在于：步骤（1）中所述的切短的规格为切短至2～3 cm。
5.根据权利要求3所述的高产纤维素酶的芽孢杆菌在青贮调制中的应用，其特征在于：步骤（2）中所述的高产纤维素酶的芽孢杆菌的添加量按每kg待发酵饲料配比1.0×108个以上所述的高产纤维酶的芽孢杆菌计算。
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