CN102676417A - 一种高地芽胞杆菌及其在烤烟上部烟叶人工陈化中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业微生物技术领域，也涉及烟叶的陈化技术领域。本发明公开了一株适用于烤烟上部陈化的微生物高地芽胞杆菌(Bacillus altitudinis)D2菌株，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2011056，本发明还公开了该高地芽胞杆菌(Bacillus altitudinis)D2菌株在烤烟上部烟叶人工陈化中的应用。本发明的高地芽胞杆菌是一种分离于烟叶表面的增香提质优势细菌，能够人工陈化烤烟上部烟叶，缩短上部烤烟烟叶的陈化时间，提高烤烟上部烟叶的吸食品质，增加香气质量和香气量，减少刺激性。

Description

一种高地芽胞杆菌及其在烤烟上部烟叶人工陈化中的应用

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域和烟草陈化技术领域，具体地说，本发明涉及利用一种人工分离的微生物菌株，该微生物适用于烤烟上部烟叶陈化。所述的的微生物是高地芽胞杆菌(Bacillus altitudinis)D2。本发明还包括该微生物在烤烟上部进行烟叶人工陈化中的应用。

背景技术

烟叶陈化是烟草初加工过程中的一个重要加工过程，同时陈化也是烟叶吸食品质形成过程中的一个重要环节。由于当年收获的烟叶(原烟)在品质上尚存在着不同程度的缺陷，如香气不突出，青腥杂气较重，刺激性大，吸味辛辣，余味不干净，烟气不够细腻，烟叶色泽及燃烧性也不符合加工要求等缺点，必须经过陈化以促使烟叶内在化学成分的转化(杨虹琦等，2003)。烟叶陈化是一个与物理变化相伴随的复杂的生理生化和化学反应过程，在这个过程中，烟叶内大分子有机物质和化学成分在氧化反应、酶促反应以及微生物作用下不断分解、转化和消耗，小分子有机物香气成分不断形成，促进烟叶主要化学成分发生变化，青杂气、刺激性和异味大大减轻，香气质和香气量变佳，吸味醇和。烟叶陈化包括自然陈化和人工陈化，自然发酵主要是借助自然气候的变化进行发酵，也称为季节性发酵，主要特点是在烟叶储存期间，利用一年一度的春季温度上升，促进烟叶内酶的活动，使烟叶经过缓慢的发酵过程，以达到改善烟叶品质的目的。优点是工艺简单、操作方便、发酵后烟叶色泽鲜明，比较均匀。缺点是：时间长，一般为1～2年，占用仓库面积大，烟叶周转慢，不够经济(黄嘉礽，1999)。国内烟草研究者在微生物人工陈化烤烟上做了大量工作，从陈化烟叶表面筛选出大量的芽胞杆菌菌株，并制备成各种烟草陈化菌剂人工陈化烤烟烟叶，促进了烟叶内部有机物质的分解与转化，加速了烟叶发酵过程、缩短了发酵周期，然而生物制剂在烟草发酵工艺上应用的时间并不长，应用的范围也不广，大部分应用在烟叶等级相对较高的中部烟上，效果不显著，能够成熟应用并加以扩大的就更少，本发明旨在寻找一种能够显著提高烤烟上部烟叶品质的优势菌株。

烟草植株的上部烟叶占整株烟叶的三分之一，占产量30-40％左右。目前我国的烟叶质量与国际优质烟叶相比，仍然存在着一定的差距，主要表现在上部烟叶叶片偏厚、颜色较深、组织结构紧密、烟碱含量偏高、还原糖及糖碱比低，内在化学成分不协调，在感官评吸方面表现为劲头大，刺激性大，杂气重，余味不干净，上部烟叶的质量和可用性差的问题尤为突出。由于植株上部烟叶的可用性较低，造成了全国性的上部烟叶大量积压。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，针对烤烟上部烟叶质量次、可用性差，特别是烤烟上部烟叶陈化问题，提供一株适用于烤烟上部烟叶陈化的微生物即高地芽胞杆菌的新菌株，利用该微生物提高对烤烟植株上部烟叶进行人工陈化，从而达到提高烟叶的质量。

申请人从烤烟烟叶表面分离得到一株高地芽胞杆菌(Bacillus altitudinis)D2菌株，经培养基富集后通过淀粉分解透明圈试验和酶活测定试验筛选获得，试验表明该菌株是一种优良的烤烟上部烟叶陈化增香提质菌，对烤烟上部烟叶的人工陈化有促进作用，申请人将该菌株于2011年3月3日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC NO：M2011056。

高地芽胞杆菌(CCTCC NO：M2011056)菌株的细胞形态特征：

革兰氏染色呈阳性，杆状，大小为0.5μm～1.0μm×3.0μm～6.0μm，芽胞端生或次端生，周生鞭毛，能运动，高地芽胞杆菌CCTCC M2011056的生理生化特征：生长温度27～45℃，pH4～9，NaCl耐受性2％～6％；明胶液化、硝酸盐还原酶试验、淀粉水解试验、甲基红试验、V.P试验、均为阳性，氧化酶试验、柠檬酸盐利用试验为阴性，能够利用甘露糖和蔗糖产酸，不能利用木糖、麦芽糖、鼠李糖产酸。

所述的高地芽胞杆菌D2菌株的16S rRNA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

本发明的高地芽胞杆菌D2菌株的应用方法是：发酵培养→收集菌体→制备菌悬液→喷洒上部烤烟→人工陈化→卷烟。

高地芽胞杆菌D2菌株的发酵培养基组成为(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl10，pH7.0-7.4。

高地芽胞杆菌D2菌株的发酵培养的条件为180rpm，37℃，12h。

高地芽胞杆菌D2菌株的发酵菌体的收集在发酵培养结束后，8000rpm 8min离心沉淀菌体。

高地芽胞杆菌D2菌株的发酵菌体通过麦云度法(见：赵斌和何绍江，2002)可制备成10⁸CFU/mL的菌悬液。

高地芽胞杆菌D2菌株10⁸CFU/mL的菌悬液在烤烟上部烟叶的喷洒用量为烟叶质量的10％，以烟叶喷洒后手捏不成团为宜。

高地芽胞杆菌菌株制备的10⁸CFU/mL菌悬液喷洒人工陈化烤烟上部烟叶的条件为处理温度37℃、相对湿度60％，处理时间15天。

本发明涉及的菌株分类地位的鉴定，参照经典的微生物学分类手册：George M.Garrity《Bergey’sMannual of Systematic Bacteriology》Vol.VIII，1974年版的内容。根据其形态特征和生理生化特征，以及16SrRNA基因序列比对结果，经多相分类鉴定本发明所分离的菌株是一株高地芽胞杆菌(Bacillus altitudinis)，申请人将其命名为高地芽胞杆菌(Bacillus altitudinis)D2。

本发明提供的高地芽胞杆菌(CCTCC NO：M2011056)，是一种优良的烤烟上部烟叶陈化增香提质菌，对烤烟上部烟叶的人工陈化有促进作用，特别是人工陈化后上部烟的刺激性和杂气减轻，香气质和香气量得到一定程度的改善，同时较自然陈化缩短烤烟上部烟叶的陈化周期。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是高地芽胞杆菌D2菌株的16S rRNA的核苷酸序列。

图1：是高地芽胞杆菌D2菌株的显微照片(100×)

图2：是高地芽胞杆菌D2菌株在淀粉-LB平板上的透明圈(水解圈)测定照片。

具体实施方式

下面结合实施例及其附图进一步说明本发明。

实施例1：高地芽胞杆菌D2的分离选育。

将来自于武汉卷烟厂仓库的不同产地(湖北省、云南省)自然存放2年的烟叶，未经过人工陈化处理的烤烟烟叶用已灭菌的剪刀剪碎，浸泡在100mL无菌水中，于200rpm摇床上震荡30min，震荡均匀后取0.1mL，稀释涂布于LB平板上(培养基组成(g/L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，用蒸馏水定容至1000mL；琼脂15-20g/L，调培养基的pH至7.0～7.4)，培养12h后，对各种不同菌落进行编号，并接种于LB液体培养基中，培养12h，并利用接种针穿刺接种于淀粉平板上(培养基组成(g/L)：可溶性淀粉2g，蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，用蒸馏水定容至1000mL，调培养基的pH至7.0～7.4)，培养24h后利用碘液测定淀粉平板上透明圈与菌落直径比(见表1)。通过淀粉平板透明圈法进行初筛，从烤烟烟叶表面获得11株降解淀粉效果较好的细菌(如表2)。

表1不同菌株淀粉水解透明圈直径与其菌落直径比

筛选的菌株的d-淀粉酶酶活如表2：

表2本发明筛选的不同菌株发酵液产a-淀粉酶能力

将这11株菌株接种于LB液体培养基中培养12h后收取菌体，用无菌水稀释到10⁸CFU/ml，将此菌悬液喷施到上部烤烟烟叶上，37℃陈化15天，切丝打样成卷烟，进行感官评吸评价，获得如图1所示的人工陈化上部烤烟烟叶效果最好的D2菌株。该D2经过微生物学鉴定和16S rRNA基因序列比对结果，证明本发明的菌株为高地芽胞杆菌(Bacillus altitudinis)D2，将该菌株于2011年3月3日保藏在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC NO：M2011056。

实施例2：高地芽胞杆菌(CCTCC NO：M2011056)D2菌株的形态特征和生理生化特征的鉴定。

参照George M.Garrity《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology》Vol.VIII(1974年版)的试验方法进行，检测其革兰氏染色，菌体大小和形态，有无鞭毛和芽胞，生长温度，pH范围，NaCl耐受性，触酶，H2S试验，淀粉水解，纤维素水解，MR试验，苯丙氨酸脱氨，脲酶试验，氧化酶，明胶液化，酪氨酸降解，V-P试验，以及利用甘露醇，阿拉伯糖，半乳糖，木糖，鼠李糖，蔗糖，肌糖和柠檬酸盐试验。

结果表明，该菌为革兰氏阳性，杆状，大小为0.5μm～1.0μm×3.0μm～6.0μm，芽胞端生或次端生，周生鞭毛，能运动；生长温度27～45℃，pH4～9，NaCl耐受性2％～6％；明胶液化、硝酸盐还原酶试验、淀粉水解试验、甲基红试验、V.P.试验、均为阳性，氧化酶试验、柠檬酸盐利用试验为阴性，能够利用甘露糖和蔗糖产酸，不能利用木糖、麦芽糖、鼠李糖产酸。

实施例3：高地芽胞杆菌D2菌株的16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定。

具体步骤是：

将高地芽胞杆菌(保藏号CCTCC NO：M2011056)D2菌株接种于LB培养基，200rpm，37℃震荡培养12小时，离心收集菌体，悬浮后加入溶菌酶，采用CTAB法和SDS法破壁，采用苯酚-氯仿-异戊醇提取基因组DNA，用16S rRNA通用引物正向引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和反向引物1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，对其16S rRNA基因进行PCR扩增，将扩增的产物交深圳华大基因研究院进行测序。PCR条件为：94℃，5min；95℃，40s，55(-1℃/循环)℃，30s，72℃，25s，6循环；95℃，40s，55℃，45s，72℃，1.5min，30循环；72℃，5min，10℃，5min。PCR产物长度为1465bp，与文献报道的Bacillus aititudinis strain AP-MSU(HM582688.1)相似性为97％，其核苷酸序列表见序列表SEQID NO：1所示。

实施例4：D2菌株的发酵培养。

将本发明的高地芽胞杆菌D2菌株接种在LB固体平板上，于37℃活化12小时，然后将活化的高地芽胞杆菌D2菌株转接到LB培养基中进行摇瓶发酵，温度为30～39℃，摇床转速为200rpm，发酵时间为12小时。

实施例5：高地芽胞杆菌D2菌株对2008年云南省曲靖市上部烤烟烟叶进行人工陈化的试验。

取保藏号为CCTCC NO：M2011056的高地芽胞杆菌D2菌株的发酵液，离心，取沉淀菌体，将其稀释至10⁸的菌悬液，设置蒸馏水作对照，将高地芽胞杆菌D2菌株菌悬液喷施到云南曲靖上部烤烟烟叶上，在室内温度为37℃，相对湿度60％，人工陈化15天。陈化结束后进行专家感官评吸，评吸结果见表3，从表中可以看出经本发明分离的菌株人工陈化云南曲靖上部烤烟烟叶后，其烟叶评吸劲头减轻，杂气下降，香气量有所改善。见表3。和表4。

表3本发明的高地芽胞杆菌D2菌株对云南曲靖产的上部烤烟烟叶人工陈化感官评吸结果(2008年)

表4本发明的高地芽胞杆菌D2菌株对云南曲靖产的上部烤烟烟叶人工陈化感官评吸描述2008年

实施例6：高地芽胞杆菌D2株对2008年湖北恩施产的上部烤烟烟叶人工陈化的促进

具体步骤如下：

取保藏号为CCTCC NO：M2011056的高地芽胞杆菌D2菌株的发酵液离心，取沉淀菌体，将其稀释至10⁸的菌悬液，设蒸馏水作对照，将本发明的高地芽胞杆菌D2的菌悬液喷施到曲靖上部烤烟烟叶上，温度37℃，湿度60％，人工陈化15天。陈化结束后进行专家感官评吸，评吸结果见表5，从表5中可以看出经高地芽胞杆菌D2菌株人工陈化云南曲靖产的上部烤烟烟叶后，其烟叶评吸刺激性、劲头、杂气减轻，香气质和口感有所改善。

表5本发明的高地芽胞杆菌D2对湖北恩施产的上部烤烟烟叶人工陈化感官评吸结果(2008年)

表6本发明的高地芽胞杆菌D2对湖北恩施产的上部烤烟烟叶人工陈化感官评吸描述结果(2008年)

参考文献

1.杨虹琦，周冀衡，罗泽民，等.微生物和酶在烟叶发酵中的应用.湖南农业科学，2003(6)：63～66。

2.黄嘉礽.烟草工业手册.北京：中国轻工业出版社，1999，102～104。

3.赵斌，何绍江.微生物学实验.北京：科学出版社，2002，28。

Claims (2)

1.一种适用于烤烟上部烟叶陈化的高地芽胞杆菌(Bacillus altitudinis)D2，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2011056，它的16S rRNA的核苷酸如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的高地芽胞杆菌在促进烤烟上部烟叶陈化中的应用。

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