CN110846252B - 一种高地芽孢杆菌j45及其获取方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高地芽孢杆菌J45及其获取方法与应用，所述的高地芽孢杆菌为高地芽胞杆菌（Bacillus altitudinis）J45，已在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC No.M2019666。获取方法包括分离、筛选、纯化工序，首先从烟株组织中分离能降解尼古丁的菌株，再用以尼古丁为唯一碳源的NIM培养基筛选，最后在培养基平板上纯化即得。菌株的应用包括发酵、接种、降解工序，首先将菌株在30℃下培养48~72h得发酵菌剂，于烟叶调制或制丝过程中，将发酵菌剂按烟草重量的3~5%喷施，保持4~7天的降解时间即可。所述菌株能实现烟草特有亚硝胺的高效定向降解，且抗逆性好，简便易得，使用方便，具有较高的推广应用价值。

Description

一种高地芽孢杆菌J45及其获取方法与应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高地芽孢杆菌J45及其获取方法与应用。
背景技术
烟草特有的N-亚硝基类化合物（TSNAs）是一类重要的胺类化合物，其中NNN、NNK、NAB、NAT是烟草和烟气中主要的TSNAs，而NNK和NNN对啮齿动物具有强烈的癌物性。减害技术作为国际烟草的研究重点已取得了很多突破，其中主要包括农业技术中的品种选育与栽培技术、烘烤调制技术、生物技术和物理技术等，这些技术的应用可以调控TSNAs的形成量。微生物在TSNAs的形成中起着重要作用，在调制过程中改变微生物活性和数量，也必然会影响TSNAs的累积。在TSNA的两条形成途径中都有微生物在起调节作用。因此，针对烟叶调制过程或烟叶制丝过程中，烟叶或烟丝内的水、热交换特点，分离、选育一株能实现烟草特有亚硝胺碱定向降解且抗逆性好的菌株，同时结合烟叶调制过程或烟叶制丝过程中环境温、湿度变化的阶段性特征，采取适宜的施用方法，对于生产优质低害的烟叶，提高烟叶安全性和综合品质，降低烟草特有亚硝胺对人体健康及生活环境带来的危害都具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一株高地芽孢杆菌J45；第二目的在于提供所述的高地芽孢杆菌J45的获取方法；第三目的在于提供所述的高地芽孢杆菌J45的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，一株高地芽胞杆菌（Bacillus altitudinis），命名为J45，经鉴定为高地芽胞杆菌（Bacillus altitudinis）的一个株系，是从烟株组织中分离得到，已于2019年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址为：中国，武汉，中国武汉大学保藏中心，邮编430072），其保藏编号为CCTCC No. M2019666。
本发明的第二目的是这样实现的，包括分离、筛选及纯化与验证工序，具体包括：
A、分离：将烟株组织研磨后用无菌水清洗，进行表面消毒。用无菌剪刀将表面消毒的烟草叶片剪成小段，置于磷酸钾缓冲液中，用超声波处理，用纱布过滤除去烟草叶片。滤液经真空抽滤，将菌体收集滤膜上。将滤膜至于无菌水中，超声波洗脱菌体细胞。离心收集菌体，溶于无菌水中，将获得的悬浊液用稀释平板的方法分离能在分离培养基上生长的菌株；
培养条件为：25~30℃，时间40~55h；
分离培养基成分以g/L计为：琼脂12.0~18.0、K2HPO4 1.4~1.8、KH2PO4 0.3~0.5、NaCl 0.08~0.12、MgSO4•7H2O 0.1~0.3、CaCl2 0.04~0.06、MnSO4•H2O 0.001~0.003、CuSO4•5H2O 0.0001、ZnSO4•7H2O 0.0002、NaMoO4•2H2O 0.0002、尼古丁0.8~1.2，pH 6.5~7.5；
B、筛选：将分离出的菌株转均匀涂布于以尼古丁为唯一碳源的筛选培养基平板上，得到一菌落长势旺盛的细菌菌株；
培养条件为：30℃，时间48~72h；
筛选培养基成分以g/L计为：琼脂15.0、K2HPO4 6.0、KH2PO4 3.0、NaCl 0.5、MgSO40.12、CaCl2 0.1、nicotine 0.5；
C、纯化与验证：将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛的单菌落，将纯化的单菌落再次接种于NIM培养基验证其能够以尼古丁作为唯一碳源生长的特性，即高地芽胞杆菌（Bacillus altitudinis）J45；
培养条件为：25~30℃，时间48 h；
纯化培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0~12.0、牛肉浸膏2.0~4.0、NaCl4.0~6.0、琼脂15.0~19.0，pH7.0~7.5。
本发明的第三目的是这样实现的：一种所述高地芽胞杆菌在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用，包括发酵、接种及降解工序，具体包括：
a、发酵：首先将高地芽胞杆菌（Bacillus altitudinis）J45接种到斜面培养基上，得到发酵种子；
培养条件为：25~30℃，时间24~36 h；
斜面培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0~12.0、牛肉浸膏2.0~4.0、NaCl4.0~6.0、琼脂15.0~19.0，pH7.0~7.5。
然后将发酵种子接种到种子培养液中，接种量为3~5v/v%，摇瓶装液量为25~35v/v%，得到发酵菌剂；
培养条件为：25~30℃，时间24~36 h；
种子培养液成分以g/L计为：胰蛋白胨8.0~12.0、酵母浸膏4.0~6.0、NaCl4.0~6.0；
b、接种：在烟叶调制或制丝过程中，将发酵菌剂按照烟叶或烟丝重量的3~5%进行喷施；
c、降解：喷施过发酵菌剂的烟叶或烟丝需保持4~7天的降解时间，即可实现烟叶或烟丝中NNN、NNK、NAB和NAT的有效降解。
本发明所述短高地芽胞杆菌可应用于烟草特有亚硝胺的定向降解，具有以下优点：
1、本发明所述高地芽胞杆菌（Bacillus altitudinis）J45是一种烟草特有亚硝胺的高效降解菌，对调制或制丝过程烟叶或烟丝中NNN、NNK、NAB和NAT四种主要TSNAs的总降解率可达27.64~52.37%。
2、本发明所述短高地芽胞杆菌（Bacillus altitudinis）J45大量存在于烟株中，来源广泛，易于分离、培养。同时，生产工艺简单，成本低廉，使用便利，且对人体无害，有利于该菌株的工业化生产和应用普及。
3、本发明所述短高地芽胞杆菌（Bacillus altitudinis）J45能在pH4.0～9.0的培养基中生长，生长温度范围为25～45℃，NaCl耐受性<9％，具有较好的抗逆性，能充分适应烟叶调制和制丝过程中的温、湿度环境变化和水、热交换特点，定殖效果好，活性高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的一株高地芽胞杆菌（Bacillus altitudinis）J45，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC No.7418。
所述菌株为革兰氏阳性，杆状，大小为0.6 μm～1.0 μm×2.0μm～5.0μm，芽胞端生或次端生，周生鞭毛，能运动。明胶液化、硝酸盐还原酶试验、淀粉水解试验、甲基红试验、V.P试验、均为阳性，氧化酶试验、柠檬酸盐利用试验为阴性，能够利用肌醇、D-山梨醇、甘露糖和蔗糖产酸，不能利用木糖、D-棉籽糖、麦芽糖、鼠李糖产酸。所述菌株可在pH4.0～9.0的培养基中生长，生长温度范围为25～45℃，NaCl耐受性<9％。
所述菌株可在以尼古丁为唯一碳源的培养基中生长。
所述尼古丁化学结构为1-甲基-2-（3-吡啶基）-四氢吡咯烷
(1-METHYL-2- (3-PYRIDYL)-PYRROLIDINE)
所述菌株对调制或制丝过程烟叶或烟丝中NNN、NNK、NAB和NAT的总降解率为27.64~52.37%。
一种所述高地芽胞杆菌的获取方法，包括分离、筛选及纯化验证工序，具体包括：
A、分离：将烟株组织研磨后用无菌水清洗，进行表面消毒。用无菌剪刀将表面消毒的烟草叶片剪成小段，置于磷酸钾缓冲液中，用超声波处理，用纱布过滤除去烟草叶片。滤液经真空抽滤，将菌体收集滤膜上。将滤膜至于无菌水中，超声波洗脱菌体细胞。离心收集菌体，溶于无菌水中，将获得的悬浊液用稀释平板的方法分离能在分离培养基上生长的菌株；
培养条件为：25~30℃，时间40~55 h；
分离培养基成分以g/L计为：琼脂12.0~18.0、K2HPO4 1.4~1.8、KH2PO4 0.3~0.5、NaCl 0.08~0.12、MgSO4•7H2O 0.1~0.3、CaCl2 0.04~0.06、MnSO4•H2O 0.001~0.003、CuSO4•5H2O 0.0001、ZnSO4•7H2O 0.0002、NaMoO4•2H2O 0.0002、尼古丁0.8~1.2，pH 6.5~7.5；
B、筛选：将分离出的菌株转均匀涂布于以尼古丁为唯一碳源的筛选培养基平板上，得到一菌落长势旺盛的细菌菌株；
培养条件为：30℃，时间48~72 h；
筛选培养基成分以g/L计为：琼脂15.0、K2HPO4 6.0、KH2PO4 3.0、NaCl 0.5、MgSO40.12、CaCl2 0.1、nicotine 0.5；
C、纯化与验证：将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛的单菌落，将纯化的单菌落再次接种于NIM培养基验证其能够以尼古丁作为唯一碳源生长的特性，即高地芽胞杆菌（Bacillus altitudinis）J45；
培养条件为：25~30℃，时间48 h；
纯化培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0~12.0、牛肉浸膏2.0~4.0、NaCl 4.0~6.0、琼脂15.0~19.0，pH7.0~7.5。
步骤A所述的烟株组织为烟株的叶片或茎。
步骤A所述的烟株组织优选为烤烟K326的叶片或茎。
步骤A所述的分离优选将烟叶0.8~1.2g进行组织研磨后。
步骤A所述的表面消毒包括75%酒精中浸泡1 min，再用2%的次氯酸钠溶液浸泡3min，然后在75%酒精中浸泡30 s，最后用无菌水冲洗3次。
步骤A所述的剪成的烟草叶片小段为2~3cm。
步骤A所述的磷酸钾缓冲液浓度0.1 M，pH 7.2，体积45 mL。
步骤A所述的超声波处理时间为30 min。
步骤A所述的纱布过滤为4层纱布。
步骤A所述的滤膜为孔径0.2 μm的滤膜（Whatman, Germany）。
步骤A所述的无菌水体积为10 mL。
步骤A所述的离心条件为13000 rpm，20 min。
步骤A所述的溶解至无菌水体积为1 mL。
步骤B及步骤C所述的NNK指的是4-甲基亚硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮。
步骤B所述的培养条件优选为28℃，时间48 h。
步骤B所述的筛选培养基优选由不加葡萄糖的M9培养基加入0.1%NNK制成。
步骤C所述的培养条件优选为28℃，时间48 h。
本发明所述的高地芽胞杆菌在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用，包括发酵、接种及降解工序，具体包括：
a、发酵：首先将高地芽胞杆菌（Bacillus altitudinis）J45接种到斜面培养基上，得到发酵种子；
培养条件为：25~30℃，时间24~36 h；
斜面培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0~12.0、牛肉浸膏2.0~4.0、NaCl4.0~6.0、琼脂15.0~19.0，pH7.0~7.5；
然后将发酵种子接种到种子培养液中，接种量为3~5v/v%，摇瓶装液量为25~35v/v%，得到发酵菌剂；
培养条件为：25~30℃，时间24~36 h；
种子培养液成分以g/L计为：胰蛋白胨8.0~12.0、酵母浸膏4.0~6.0、NaCl4.0~6.0；
b、接种：在烟叶调制或制丝过程中，将发酵菌剂按照烟叶或烟丝重量的3~5%进行喷施；
c、降解：喷施过发酵菌剂的烟叶或烟丝需保持4~7天的降解时间，即可实现烟叶或烟丝中NNN、NNK、NAB和NAT的有效降解。
步骤a所述的发酵，摇瓶转速为140~160 rpm。
步骤a所述的培养条件优选为28℃，时间30 h。
步骤a所述的发酵菌剂的有效活菌数为1×109~1×1010个/mL。
步骤b所述的接种也可以在烟叶调制前进行。
步骤b及步骤c所述的烟叶包括白肋烟、烤烟或晒烟中的任一种。
步骤b及步骤c所述的烟叶优选白肋烟。
步骤b所述的调制指的是由鲜烟叶到干烟叶的过程，具体为烤烟的烘烤过程和晾晒烟的晾晒过程。
步骤b所述的制丝指的是将烟叶原料加工成适合烟支卷制工艺要求的烟丝的加工过程。
步骤c所述的降解，对于在调制前接种的烟叶，无需设定特殊降解条件，对于在制丝过程中接种的烟丝，需调节烟丝的水分含量为30~40%，并于25~35℃的条件下保持5天的降解时间。
步骤c所述的降解，喷施过发酵菌剂的烟叶或烟丝保持4~7天的降解时间后，烟叶或烟丝中NNN、NNK、NAB和NAT的总降解率为27.64~52.37%。
下面通过实施例加以说明：
实施例1
——高地芽胞杆菌（Bacillus altitudinis）J45的获取与鉴定
（1）高地芽胞杆菌（Bacillus altitudinis）J45的获取
A、分离：烤烟K326的叶片样品采自云南省玉溪市。将采集烟草组织用无菌水清洗，于75%酒精中浸泡1 min，再用2%的次氯酸钠溶液浸泡3 min，然后在75%酒精中浸泡30 sec，最后用无菌水冲洗3次。用无菌剪刀将表面消毒的烟草叶片剪成2~3 cm的小段，置于45 ml磷酸钾缓冲液中（0.1 M，pH 7.2），用超声波处理30 min，用4层纱布过滤除去烟草叶片。滤液经真空抽滤，将菌体收集至孔径0.2 μm滤膜上（Whatman, Germany）。将滤膜至于10 mL无菌水中，超声波洗脱菌体细胞。13000 rpm离心20 min收集菌体，溶于1 mL无菌水中，将获得的悬浊液用稀释平板的方法分离能在分离培养基上生长的菌株；
培养条件为28℃，时间48h；
分离培养基成分以g/L计为：琼脂15.0、K2HPO4 1.6、KH2PO4 0.4、NaCl 0.1、MgSO4•7H2O 0.2、CaCl2 0.05、MnSO4•H2O 0.002、CuSO4•5H2O 0.0001、ZnSO4•7H2O 0.0002、NaMoO4•2H2O 0.0002、尼古丁1.0，pH 7.0。
B、筛选：将分离出的菌株转接到筛选培养基平板上，得到一菌落长势旺盛的细菌菌株；
培养条件为：28℃，时间48 h；
筛选培养基成分以g/L计为：琼脂15.0、K2HPO4 6.0、KH2PO4 3.0、NaCl 0.5、MgSO40.12、CaCl2 0.1、nicotine 0.5。
C、纯化与验证：将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛的单菌落，将纯化的单菌落再次接种于NIM培养基验证其能够以尼古丁作为唯一碳源生长的特性，定名为J45菌株；
培养条件为：28℃，时间48h；
纯化培养基成分以g/L计为：蛋白胨10.0、牛肉浸膏3.0、NaCl 5.0、琼脂17.0，pH7.2。
（2）高地芽胞杆菌（Bacillus altitudinis）J45的鉴定
对上述选育的菌株J45，通过常规方法进行生物学和生理生化特性检测与分子生物学方法鉴定。分子鉴定方法如下：细菌基因组DNA的提取用TaKaRa MiniBEST BacterialGenomic DNA Extraction Kit Ver.2.0，方法参见试剂盒说明书。PCR扩增选用引物F27/R1492，常规条件扩增，扩增产物经TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0回收后，连接于载体pMD18-T Vector，转化入感受态细胞E.coli DH5α，挑取白色菌落以M13F/M13R为引物进行菌落PCR鉴定。阳性克隆委托上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。
以上实验结果记录如下：
1、形态特征：该菌株于26℃培养，在显微镜下，芽胞端生或次端生，周生鞭毛，能运动。菌体杆状，平均大小为0.6~1.0 μm ×2.0~5.0 μm，革兰氏染色为阳性。
2、培养特征：该菌株于28℃在LB 平板培养基上培养24h，菌落呈圆形，白色，直径1.5～3.5mm，边缘不规则，厚实较湿润，易挑取，为好氧菌。
3、生理生化特征：该菌株生理生化反应呈阳性的是：过氧化氢酶实验、硝酸盐还原酶试验、淀粉水解试验、甲基红试验、V.P试验；生理生化反应呈阴性的反应为：氧化酶试验、柠檬酸盐利用试验。能够利用肌醇、D-山梨醇、甘露糖和蔗糖产酸，不能利用木糖、D-棉籽糖、麦芽糖、鼠李糖产酸。
4、稳定性特征：该菌株可在pH4.0～9.0的培养基中生长，生长温度范围为25～45℃，NaCl耐受性<9％，最适宜生长温度为28~35℃，最适宜pH值为7.2~7.4。
5、16S rDNA序列分析：通过序列比对和生理生化特性将J45菌株鉴定为高地芽胞杆菌（Bacillus altitudinis）。
本发明所述的J45菌株其16S rDNA序列见序列表。
（3）高地芽胞杆菌（Bacillus altitudinis）J45的保藏
通过上述鉴定结果，确认菌株J45为高地芽胞杆菌（Bacillus altitudinis）的一个株系，命名为J45。于2019年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址为：中国，武汉，中国武汉大学保藏中心，邮编430072），其保藏编号为CCTCC No. M2019666。
实施例2
——高地芽胞杆菌（Bacillus altitudinis）J45液体培养的烟碱降解实验
实验方法：将J45菌株用烟碱含量为0.2％的M9培养液（10 mL 10倍M9培养液（磷酸氢二纳60 g ， 磷酸氢二钾30 g ，氯化钠5 g ，氯化铵10 g，氯化钙1.1 g/10 mL，硫酸镁2.5 g/10 mL，烟碱），90mL去离子水，1.5～2.0 g琼脂，高压灭菌，50～60℃加入灭菌好的氯化钙 、硫酸镁各100 ul，50 uL烟碱）振荡培养3天（150 rpm，30℃），两次重复，用750U紫外/可见分光光度计比色，测定OD值。用台式离心机离心5 min（1000 rpm），取0.5 mL上清液加入3.5 ml 5％的乙酸，混合均匀，送到分析测试中心，用自动化学分析仪检测烟碱含量。
实验结果：由表1数据可知，菌株J45培养液对烟碱的降解效果良好。液体培养基中烟碱含量较对照降低了96.37%。
表1 菌株J45液体培养液降解烟碱效果
Figure 318478DEST_PATH_IMAGE001
实施例3
——高地芽胞杆菌（Bacillus altitudinis）J45对调制期烟叶中TSNAs的降解实验
实验方法：
a、发酵：首先将高地芽胞杆菌（Bacillus altitudinis）J45接种到斜面培养基上，得到发酵种子；
培养条件为：26℃，时间24 h；
斜面培养基成分以g/L计为：蛋白胨10.0、牛肉浸膏3.0、NaCl 5.0、琼脂17.0，pH7.2；
然后将发酵种子接种到种子培养液中，接种量为4 v/v%，摇瓶装液量为30 v/v%，摇瓶转速为150 rpm，得到发酵菌剂；
培养条件为：28℃，时间36 h；
种子培养液成分以g/L计为：胰蛋白胨10.0、酵母浸膏5.0、NaCl 5.0。
所得发酵菌剂的有效活菌数为1.2×109个/mL。
b、接种：在烟叶调制前进行接种，选取盆栽烤烟烟叶，采用半叶法进行烟叶调制实验。一半叶片为菌剂喷施处理，另一半采用无菌水喷施作为对照（CK）。在调制前，将发酵菌剂按照烟叶重量的4%进行喷施。
c、降解：将喷施过发酵菌剂的烟叶和对照烟叶置于培养箱内，在30℃，相对湿度为80%的条件下，调制7天至干。
TSNAs含量检测：将烟叶在65℃烘干研磨后过100目筛，检测TSNAs含量。称取烟末1. 0g（精确到 0.1 mg），置于100mL的锥形瓶中，加入20 mL 100 mmol/L的乙酸铵水溶液，超声萃取60 min。静置后取2ml上层清液经0.2 μm水相滤膜过滤，进行UPLC-MS/MS分析（范多青等，中国烟草学报，2012，18（6）：10-16）。
实验结果：由表2数据可知，菌株J45能使烟叶中的TSNAs含量明显下降，总体下降幅度为23.05%，对四种TSNAs均有降解效果。其中，NNK和NAT的含量分别降低了22.15%和26.27%。
表2菌株J45对调制期烟叶中TSNAs的降解效果
Figure DEST_PATH_IMAGE002
实施例4
——高地芽胞杆菌（Bacillus altitudinis）J45对烟丝中TSNAs的降解实验
实验方法：
a、发酵：培养条件为28℃，时间48 h，其余同实施例3。所得发酵菌剂的有效活菌数为1.0×1010个/mL。
b、接种：取制丝线上的烟丝，充分混合均匀后分成处理和对照（CK）两组，处理组将发酵菌剂按照烟丝重量的4%进行喷施，对照组喷施等量的无菌水。
c、降解：将喷施过发酵菌剂的烟丝和对照烟丝的水分含量调整到30%，放置于培养箱内在30℃，相对湿度为80％的条件下，降解5天。
TSNAs含量检测：同实施例3。
实验结果：由表3数据可知，菌株J45能使烟丝中的TSNAs含量明显下降，总体下降幅度为41.20%，对四种TSNAs均有降解效果。其中，NNN、NAB和NAT的含量分别降低了52.37%、36.44%和36.05%。
表3菌株J45对烟丝中TSNAs的降解效果
Figure 173301DEST_PATH_IMAGE003
SEQUENCE LISTING
<110> 云南省烟草农业科学研究院
<120> 一种高地芽孢杆菌J45及其获取方法与应用
<130> 2019
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1511
<212> DNA
<213> 高地芽胞杆菌（Bacillus altitudinis）J45
<400> 1
agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60
ggacagaagg gagcttgctc ccggatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120
cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggagct aataccggat agttccttga 180
accgcatgat tcaaggatga aagacggttt cggctgtcac ttacagatgg acccgcggcg 240
cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 300
ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360
gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420
cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgcaa gagtaactgc ttgcaccttg 480
acggtaccta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 540
tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagggctcg caggcggttt cttaagtctg 600
atgtgaaagc ccccggctca accggggagg gtcattggaa actgggaaac ttgagtgcag 660
aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca 720
gtggcgatgg cgactctctg gtctgtaact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga 780
acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt 840
ttccgcccct tagtgctgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacggtcgca 900
agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 960
tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaaccc tagagatagg 1020
gctttccctt cggggacaga gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga 1080
gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca gcattcagtt 1140
gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca 1200
tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gacagaacaa agggctgcga 1260
gaccgcaagg tttagccaat cccacaaatc tgttctcagt tcggatcgca gtctgcaact 1320
cgactgcgtg aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt 1380
cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgcaacaccc gaagtcggtg 1440
aggtaacctt tatggagcca gccgccgaag gtggggcaga tgattggggt gaagtcgtaa 1500
caaggtaacc g 1511

Claims (6)

1.一株高地芽孢杆菌J45，其特征在于，所述的高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）J45，已在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC No.M2019666。
2.一种权利要求1所述的高地芽孢杆菌J45的应用，其特征在于，所述高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）J45在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用包括发酵、接种和降解步骤，具体包括：
A、发酵：将高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）J45接种到斜面培养基上于温度25~30℃下培养24~36h得到发酵种子；将发酵种子接种到种子培养液中于温度25~30℃下培养24~36h得到发酵菌剂，接种量为3~5v/v%，摇瓶装液量为25~35v/v%；
所述的斜面培养基以g/L计为：蛋白胨8.0~12.0、牛肉浸膏2.0~4.0、NaCl4.0~6.0、琼脂15.0~19.0，pH7.0~7.5；
所述的种子培养液成分以g/L计为：胰蛋白胨8.0~12.0、酵母浸膏4.0~6.0、NaCl4.0~6.0；
B、接种：在烟叶调制或制丝过程中，将发酵菌剂按照烟叶或烟丝重量的3~5%进行喷施；
C、降解：喷施过发酵菌剂的烟叶或烟丝需保持4~7天的降解时间，即可实现烟叶或烟丝中NNN、NNK、NAB和NAT的有效降解。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵菌剂的有效活菌数为1×109~1×1010个/mL。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，C步骤所述降解对于在调制前接种的烟叶，无需设定特殊降解条件，对于在制丝过程中接种的烟丝，需调节烟丝的水分含量为30~40%，并于25~35℃的条件下保持5天的降解时间。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，C步骤所述降解在喷施过发酵菌剂的烟叶或烟丝保持4~7天的降解时间后，烟叶或烟丝中NNN、NNK、NAB和NAT的总降解率为27.64~52.37%。
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