CN108531413B - 一株防治植物根癌病的肠杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株防治植物根癌病的肠杆菌及其应用。本发明所提供的肠杆菌具体为肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2‑2，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.13535。该菌株为桃树内生细菌，而且生长迅速，可在植物组织内快速大量定殖，具有生态位优势；且菌株10DI2‑2能产生抗生素，可对抵抗根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)的侵入产生一定作用；另外，该菌株可强烈抑制根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)侵染易感植物向日葵形成根癌瘤，该菌株能够替代或减少农药的使用，保护植物减少来自环境和病害的压力，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于农、林和园艺作物保护技术领域，涉及一株防治植物根癌病的肠杆菌及其应用。
背景技术
根癌病是由根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)引起的一种常见细菌性病害。根癌土壤杆菌的寄主范围很广，能侵染93科、331属643种的植物。在欧洲、北美、南非及亚洲等一些国家普遍发生。在我国桃树栽培区均有不同程度发生，发病率在20％～90％(马德钦,王慧敏.果树根癌病及其生物防治[J].中国果树,1995年02期)。较为严重的根癌病发生区域为河北、山东、辽宁、河南、湖北、江苏等省区。桃树幼苗受害后早衰，植株矮化，甚至死亡；成龄树感染此病后会生长不良、树势变弱、果实小、产量低、树龄缩短，造成了重大的经济损失。我国果树根癌病的发生相当普遍，但此病的明显危害发生在根部，因此很多果农对该病缺乏认识，对及时防治及苗木外调和引进时的检疫措施未予重视，造成病菌的传播和病情逐年加重，防治工作任务艰巨。目前对根癌病最有效的防治措施是轮作和生物防治。但许多果园或苗圃无法实行常年轮作。采用生物防治的方法，提前使用生物菌剂是降低病原菌进入植物体内并干扰其代谢的有效措施。本技术投入低、效率高，是一项农民认可的、可操作强的农产品生产技术。
关于根癌病的生物防治，虽然国内外曾经报道菌根真菌、放线菌、土壤杆菌、假单孢菌、产碱杆菌、芽孢杆菌提取物对根癌病菌有一定的拮抗作用，但除K84及其遗传工程菌株K1026(商品名为Nogall)外，均没有商业化。
针对在果树和其他植物上发生普遍的由A.tumefaciens引起的根癌病，目前我国未见登记注册的生防菌制剂。获得适合我国土壤类型且具有我国自主知识产权的生防菌及其无细胞制剂对根癌病的防控具有重要的实际意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株防治植物根癌病的肠杆菌及其应用。
本发明所提供的肠杆菌具体为肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2，该菌株已于2017年1月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.13535。
本发明还保护活性成分为所述肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2的菌剂。
在所述菌剂中，所述肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2的活菌数可为5～200亿/g(如10亿/g)所述菌剂。
所述菌剂中还可包括吸附载体；所述吸附载体可为硅藻土、草炭、蛭石、珍珠岩和碳酸钙中的至少一种。
更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述吸附载体由草炭和蛭石按照体积比1:1的配比混和而成。
进一步，所述菌剂由所述肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2的发酵液和所述吸附载体按照1L:2Kg至1L:4Kg(如1L：2Kg)的配比混和而成。
在本发明的一个实施例中，制备所述肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2的发酵液时采用营养肉汤，所述肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2的发酵液中，所述肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2的活菌数为50～80亿/ml(如50亿/ml)所述发酵液。相应的，在制备得到的所述菌剂中，所述肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2的活菌数为5～15亿/g(如10亿/g)所述菌剂：所述菌剂的含水量在3％以内。
所述菌剂的制备方法也属于本发明的保护范围。
所述菌剂的制备方法，具体可包括如下步骤：
(1)培养所述肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2，得到所述肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2的发酵液；
(2)将步骤(1)所得发酵液和所述吸附载体按照1L:2Kg至1L:4Kg(如1L：2Kg)的配比混和，得到所述菌剂。
在步骤(1)的所述发酵液中，所述肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2的活菌数可为50～80亿/ml(如50亿/ml)。
在步骤(1)中，培养所述肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2的培养基可为营养肉汤。所述营养肉汤的组成如下：葡萄糖10g：蛋白胨10g：牛肉膏3g：酵母膏1g：蒸馏水1000ml；所述营养肉汤的pH为7.0～7.2。
在步骤(1)中，培养所述肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2的培养条件可为：将所述肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2的种子液接种到所述营养肉汤中，接种量为0.5～5％(如0.8％)(体积比)，培养温度28～30℃，转速180rpm，初始pH 6.0～7.0，培养时间24h。
所述肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2的发酵液也属于本发明的保护范围。
所述肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2或所述菌剂或所述发酵液在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
1)抑制根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)；
2)制备用于抑制根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的产品；
3)预防和/或治疗植物根癌病；
4)制备用于预防和/或治疗植物根癌病的产品。
所述预防和/或治疗植物根癌病的方法包括且不限于：直接施用如拌种、蘸根、浇灌、涂抹等，与化学肥料、有机肥料以及有机无机复混肥料的混和使用，与抗生素、化学杀菌剂、无机盐或铜离子制剂以及熏蒸剂使用的配合使用。
其中，所述根癌病具体为由根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)引起的根癌病。所述植物具体可为因A.tumefaciens感染引起根癌病的果树、林木、园艺作物或作物，如：向日葵、桃、番茄、樱桃、杨树、牡丹、玫瑰等。
本发明所提供的肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2 CGMCC No.13535具有如下优势：
1、分离于富营养培养基TSA，其生长迅速，可在植物根际快速大量定殖，具有生态位优势。
2、产生抗生素，可对根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)有一定的抑制作用，该菌株是一株有潜力的拮抗菌。
3、可强烈抑制根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)侵染易感植物向日葵而形成根癌瘤，防效可达到89.89％。
本发明所提供的肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2 CGMCC No.13535是从郑州具有根癌病获得抗性(SAR)的桃单株“西北13-1”枝条中分离到的一株内生细菌。该菌株的特点是：在营养培养基平板上培养时，菌落圆形中凸，有粘液，菌落扩展速度很快，这是生防菌可大规模生产和应用的前提条件之一。用其菌悬液与根癌土壤杆菌菌悬液混合接种向日葵，可明显控制癌瘤的形成，经鉴定为肠杆菌(Enterobacter cowanii)，定名为10DI2-2。内生细菌10DI2-2能够在长期定殖生存于寄主植物，由于该菌株能产生抗生素，还可对抵抗根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)的侵入产生一定作用。10DI2-2菌株能够替代或减少农药的使用，保护植物减少来自环境和病害的压力，因此10DI2-2是一株非常有潜力的果树或其他植物根癌病生防菌
保藏说明
菌种名称：肠杆菌
拉丁名：Enterobacter cowanii
菌株编号：10DI2-2
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2017年1月6日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.13535
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
根癌土壤杆菌TA-AT-2：由中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)提供，ACCC编号为19185。
根癌土壤杆菌ATCC 23308T：由中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)提供。
实施例1、肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2的分离与鉴定
一、肠杆菌(Enterobacter cowanii)菌株10DI2-2的筛选
本发明的肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2是于中国农业科学院郑州果树研究所基地从桃树枝条中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：
(1)肠杆菌的分离
将根癌土壤杆菌TA-AT-2接种于YEB培养基中，28℃、200rpm培养16h，调整菌液浓度至109cfu/mL。将根癌土壤杆菌菌悬液接种到根癌病桃抗性品种“西北13-1”(HAO etal.,Systemic Acquired Resistance Induced by Agrobacterium tumefaciens inPeach and Differential Expression of PR1Genes.HortScience[J],2015,50(5):666-672.)新发嫩枝条上，共选取5棵树，每棵树选左、中、右6个不同方向的枝条进行接种，每枝条接种5个点，接种点之间相距5cm。接种方法如下(Bliss et al.,Crown gall resistancein accessions of 20Prunus species.Hortscience[J],1999,34:326-330.)：用75％酒精将1年生枝条中段(枝条前后10cm不接种)进行表面消毒，选取5个点用解剖刀划伤茎表皮，去掉1cm×0.5cm的一条树皮，深至形成层部位。每点接种50μL菌液，并用封口膜包裹保湿。用无菌水接种做为对照。
分别于接种前和接种后10天和60天时收集枝条，每棵树每个时期选3个方向不同的枝条用无菌修枝剪剪下。桃枝条表面消毒后，用无菌剪刀将枝条剪切成0.5cm小段，同一棵桃树同一处理的不同枝条小段混和为一个样品。将枝条样品于无菌研钵中加入10倍重量的PBS溶液，研磨得到茎组织悬浮液。采用TSA和D1M培养基对细菌进行分离。根据不同形态特征挑取菌株，划线纯化。
其中，所述YEB培养基组分及配比为：蛋白胨5g，酵母膏1g，牛肉膏5g，MgSO4 0.5g，蔗糖5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0。
所述D1M培养基组分及配比为：纤维二糖5.0g，NH4Cl 1.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，K2HPO4 3.0g，NaH2PO4·H2O 1.0g，孔雀绿0.01g，琼脂15g，蒸馏水1000mL；pH调至7.0。
所述TSA固体培养基组分及配比为：胰蛋白胨15.0g，大豆胨5.0g，NaCl 5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0。
所述PBS溶液组分及配比为：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.24g，Na2HPO4·12H2O3.628g，蒸馏水1000mL，pH调至7.4。121℃高压灭菌30分钟。
(2)桃树根癌病高效拮抗菌的筛选
①平板拮抗测定：测定对根癌土壤杆菌ATCC 23308T和TA-AT-2混和液的抑菌活性，具体方法参照实施例2。
②生物测定：以易感病植物向日葵进行盆栽防病试验。具体方法参照实施例3。
经过以上筛选，最终获得一株肠杆菌(Enterobacter cowanii)，将该菌株记为10DI2-2。
二、菌株鉴定
1、微生物学特性鉴定
在营养琼脂NA培养基上形成的菌落形态为圆形中凸，淡黄色，表面光滑粘稠，有粘液，边缘整齐，正反面颜色一致。菌体细胞呈杆状，能运动。细胞单一存在或成对存在，大小约为0.6～1.0μm×1.2-3.0μm。革兰氏染色阴性，无芽孢。10DI2-2菌株在pH 7.0-7.4，温度26-29℃生长良好，可利用多种碳源生长。
其中，所述NA固体培养基组分及配比为：葡萄糖10g，蛋白胨10g，牛肉膏3g，酵母膏1g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0，121℃高压灭菌30分钟。
2、分子生物学特性
利用细菌16S rDNA通用引物27f和1492r进行16S rDNA序列扩增，将该序列测序。
27f：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'；
1492r：5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'。
其中，细菌16S rDNA的扩增体系(总体积50.0μL)为：2×pfu Mix 25μL；上下游引物各2μL(10pmol)，ddH2O 17μL；菌液4μL。
PCR扩增条件：95℃预变性5min；94℃变性1min；55℃退火1min；72℃延伸2min；35个循环；72℃延伸10min。
PCR产物回收：PCR产物经1.2％的琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下快速切胶、回收。回收步骤参照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(康宁生命科学有限公司)说明书进行。
克隆：参照零背景pTOPO-Blunt平末端克隆试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)说明说进行。PCR产物经胶回收后连接到pTOPO-Blunt载体上，并转化DH5α感受态细胞，37℃过夜培养，挑选单克隆后进行菌液PCR鉴定，并把阳性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
菌株10DI2-2的16S rDNA的序列详见序列表中序列1。
鉴于上述微生物学特性鉴定和分子生物学特性鉴定结果，将步骤一分离并纯化得到的菌株10DI2-2鉴定为肠杆菌(Enterobacter cowanii)。该肠杆菌(Enterobactercowanii)10DI2-2已于2017年1月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.13535。
实施例2、肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2的抑菌活性测定及菌剂的制备
一、肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2的抑菌活性测定
将根癌土壤杆菌ATCC 23308和TA-AT-2分别接种于NA(配方见前文)斜面，28℃培养24h。然后将适量无菌水加入到斜面中，制备病原菌菌悬液(ATCC 23308T和TA-AT-2按1:1体积混和)。取1ml菌悬液(108cfu/ml)置于已灭菌的培养皿内，倒入40～50℃融化的YEB(配方见前文)培养基，并摇匀，制成带菌的拮抗测定平板。挑取培养24h的实施例1获得的肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2 CGMCC No.13535，点接于拮抗测定平板上。28℃培养1-2d后，观察菌落形态以及抑菌圈的形成情况，游标卡尺测量抑菌圈直径(mm)。
结果显示，实施例1获得的肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2 CGMCCNo.13535对根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)能产生抑菌圈。该结果说明，肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2 CGMCC No.13535能产拮抗物质。
二、肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2菌剂的制备
1、将实施例1获得的肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2 CGMCC No.13535的菌苔移植到营养肉汤中，28～30℃摇床振荡培养24h得到种子液。
其中，营养肉汤的配方为：葡萄糖10g，蛋白胨10g，牛肉膏3g，酵母膏1g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0～7.2，121℃高压灭菌30分钟。
2、按0.8％比例(体积比)将步骤1获得的种子液接种到营养肉汤中，培养温度28～30℃，转速180rpm，初始pH 7.0，培养时间24h。发酵完成后得到发酵液，发酵液中肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2 CGMCC No.13535的活菌数可达50亿/mL。
3、将步骤2获得的肠杆菌10DI2-2发酵液与吸附载体——草炭和蛭石(体积比1:1)按照体积质量比为1:2(即1L：2Kg)的比例混和均匀，即得菌剂。所述菌剂中肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2 CGMCC No.13535的活菌数可达10亿/g，含水量在3％以内。
实施例3、肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2菌株对根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)侵染向日葵形成根癌瘤的抑制作用
将在营养肉汤(配方见前文)中培养至对数期的肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2 CGMCC No.13535和根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)菌悬液(ATCC 23308T和TA-AT-2按1:1体积混和)以体积比5:1(V/V)混和。混和液中，肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2 CGMCC No.13535和根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)的活菌数均为108个/ml。将混和液接种至出苗7d左右的向日葵子叶处，接种量为20μL。具体方法参考王红艳(参考文献：王红艳.樱桃和樱花根癌病病原及生物防治研究:[硕士论文]中国农业大学,1998，p7.)方法。
以等量无菌水代替肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2 CGMCC No.13535的菌悬液，与根癌土壤杆菌菌悬液(ATCC 23308T和TA-AT-2按1:1体积混和)混和作为对照(CK)。
每处理10株向日葵苗，共3个重复，定量结果取平均值±标准差。放置于28℃的培养室内，一周后观察是否出现瘤状物，游标卡尺测量瘤状物直径和向日葵茎粗。统计发病率和病情指数，计算拮抗菌的防病效果。病情级别划分(表1)参考陶铁男和明发源(参考文献：陶铁男,明发源.主要农作物灾害评估[M].北京:中国农业科学技术出版社,2010)方法。病情指数＝Σ(病级株数×代表数值)×100/调查总株数×最高级代表值。
表1向日葵茎上根癌病病情划分标准
结果表明，接种向日葵7d后，对照组(CK组)发病严重，病情指数为65.83(表2)。菌株10DI2-2与病原菌混和接种向日葵后形成的根癌瘤大小明显小于对照组，发病率降低了63.3％。10DI2-2菌株处理的病情指数明显降低，防效达到89.89％。
表2肠杆菌10DI2-2菌株对A.tumefaciens在向日葵上形成根癌瘤的抑制作用
防效(％)＝(CK组病情指数-10DI2-2组病情指数)/CK组病情指数×100％。
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 一株防治植物根癌病的肠杆菌及其应用
<130> GNCLN170458
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1506
<212> DNA
<213> 肠杆菌（Enterobacter cowanii）
<400> 1
agagtttgat cctggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgaac 60
ggtaacagga agcagcttgc tgctttgctg acgagtggcg gacgggtgag taatgtctgg 120
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cccttacgac cagggctaca cacgtgctac aatggcgcat acaaagagaa gcaatctcgc 1260
gagagctagc ggacctcata aagtgcgtcg tagtccggat tggagtctgc aactcgactc 1320
catgaagtcg gaatcgctag taatcgtgaa tcagaatgtc acggtgaata cgttcccggg 1380
ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg agtgggttgc aaaagaagta ggtagcttaa 1440
ccttcgggag ggcgcttacc actttgtgat tcatgactgg ggtgaagtcg taacaaggta 1500
gccgta 1506
Claims (10)
1.肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.13535。
2.一种菌剂，它的活性成分为权利要求1所述的肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：在每g所述菌剂中，所述肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2的活菌数为5～200亿。
4.根据权利要求2或3所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂由所述肠杆菌(Enterobactercowanii)10DI2-2的发酵液和吸附载体按照1L：2Kg至1L：4Kg的配比混和而成。
5.权利要求4所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)培养权利要求1所述的肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2，得到所述肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2的发酵液；
(2)将步骤(1)所得发酵液和权利要求4中所述的吸附载体按照1L：2Kg至1L：4Kg的配比混和，得到所述菌剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，培养所述肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2的培养基为营养肉汤。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：培养所述肠杆菌(Enterobactercowanii)10DI2-2的培养条件为：将所述肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2的种子液接种到所述营养肉汤中，接种量为0.5～5％体积百分含量，培养温度28～30℃，转速180rpm，初始pH 6.0～7.0，培养时间24h。
8.权利要求1所述的肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2的发酵液。
9.权利要求1所述的肠杆菌(Enterobacter cowanii)10DI2-2或权利要求2-4中任一所述的菌剂或权利要求8所述的发酵液在如下任一中的应用：
1)抑制根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)；
2)制备用于抑制根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的产品；
3)预防和/或治疗植物根癌病；
4)制备用于预防和/或治疗植物根癌病的产品。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述根癌病为由根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)引起的根癌病。
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