CN113373180A - 解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液、其制备方法及应用 - Google Patents

解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液、其制备方法及应用，属于微生物及微生物制剂技术领域。本发明解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液，是由解淀粉芽孢杆菌进行发酵合成纳米硒后，由解淀粉芽孢杆菌及其合成的纳米硒组成的混合液；所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌KBD‑2；该菌株于2020年08月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.20570。本发明的解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液对作物病毒病具有较好的防治效果，为作物病毒病的防治提供新的微生物资源。此外，本发明解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液还对作物具有促生效果，且效果显著。

Description

解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于微生物及微生物制剂技术领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液、其制备方法及应用。
背景技术
植物病毒引起的病害，是一种全球性的病害，有“植物癌症”之称，每年由病毒病造成的损失高达200亿美元。截止目前，全世界已发现超过900种植物病毒种类，且多种病毒可混合侵染作物，严重影响作物的生长。以经济作物烟草为例，近年来烟草普通花叶病毒常与烟草黄瓜花叶病毒、烟草马铃薯Y病毒混合侵染烟株，病害加重，造成烟田严重减产。病毒病一旦发生很难及时进行控制，实际生产中一般以预防为主，综合防治结合。虽然，化学农药在农业生产中一直占据非常重要的地位，但其高毒、高残留的特性极易促使病原菌产生抗药性，并且对人畜的安全危害极大，因此，绿色、低毒、无残留的生物防治逐渐引起了人们的重视。
硒(Se)作为生物体必需微量元素之一，在提高机体免疫力、调节代谢、抗氧化、解毒、促进生殖等方面均有重要的生理功能。有研究报道，纳米级单质硒(Se-NPs)具有特殊的理化性质，与物理法和化学法相比，微生物转化合成的SeNPs优势更为突出，转化条件温和，结构稳定、均匀，分散性好，在功能食品、肥料、饲料、药物、环境污染治理等方面应用前景良好。
安全高效的微生物制剂近年来一直是研究的热点，但针对经济作物，鲜少有抗病效果及促生效果俱佳的研究成果，更缺乏推广应用。从生物防治方面进行探索，筛选促生且防效优良的微生物制剂应用于作物病毒病的生物防治中，是目前研究的重中之重。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一株耐受亚硒酸钠的解淀粉芽孢杆菌生物合成的纳米硒合成活性菌液；该纳米硒合成活性菌液对作物病毒病具有较好的防治效果，为作物病毒病的防治提供新的微生物资源。此外，本发明解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液还对作物具有促生效果，且效果显著。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液，是由解淀粉芽孢杆菌进行发酵合成纳米硒后，由解淀粉芽孢杆菌及其合成的纳米硒组成的混合液；
所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌KBD-2；该菌株于2020年08月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号为CGMCC No.20570，分类命名为Bacillus amyloliquefaciens。
在上述方案的基础上，所述解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液中解淀粉芽孢杆菌的菌含量≥108cfu/mL；纳米硒浓度≥50mg/L。
上述解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液的制备方法，步骤如下：
将活化后的菌株CGMCC No.20570以1％接种量加入到含1mM亚硒酸钠的LB液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养，2-5d后菌液中观察到红色出现，上述发酵混合液即为所述解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液。
上述解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液在防治农作物病毒病或作物促生中的应用。
上述解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液在制备防治农作物病毒病的抗病毒剂或作物促生剂中的应用。
一种防治作物病毒病的方法，将上述的解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液均匀喷洒于作物叶片正反面，使作物和基质湿透。
在上述方案的基础上，所述病毒病包括由烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)和番茄斑萎病毒(TSWV)中的任意一种病毒所引起的作物疾病。
一种作物的促生方法，先将上述的解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液制备成稀释液；然后在作物移栽前采用上述稀释液浸根30min，缓苗3d后再往每株根部灌施稀释液，同时取少量稀释液淋于茎基部；所述稀释液中解淀粉芽孢杆菌的菌含量为5×105cfu/mL；纳米硒浓度为2.5mg/L。
一种作物抗病毒剂，其有效成分包含上述的解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液，其中，解淀粉芽孢杆菌的菌含量≥108cfu/mL；纳米硒浓度≥50mg/L。
一种作物促生剂，其有效成分包含上述的解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液，其中，解淀粉芽孢杆菌的菌含量为5×105cfu/mL；纳米硒浓度为2.5mg/L。
本发明技术方案的优点：
本发明的解淀粉芽孢杆菌菌株KBD-2，可应用于防治经济作物病毒病。采用接种枯斑寄主的生物学测定显示，KBD-2菌液及其生物合成纳米硒对TMV具有较好的抑制效果，抑制率分别为90.1％、94.2％。同时，纳米硒生物合成活性菌液对TMV、CMV、PVY、TSWV的防效较好，均在72.0％以上，在田间生产上用作抗病毒剂可有效预防田间病毒病的发生。另，KBD-2菌液及其生物合成纳米硒的促生效果较好，可有效促进株高和根系的生长，增加叶片表面积，积累干物质，KBD-2菌的整体促生效果略低于其纳米硒生物合成活性菌。这表明，KBD-2菌生物合成纳米硒后增强了其促生及抗病毒的能力，在生产上具有一定的实际应用价值。
附图说明
图1为菌株KBD-2生物合成纳米硒的效果(左：纳米硒生物合成活性菌液，菌液颜色为红色；右：KBD-2菌液，菌液颜色为淡黄色)；
图2为纳米硒生物合成活性菌液对TMV的枯斑抑制效果图(左侧叶：纳米硒生物合成活性菌液；右侧叶：空白对照)。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1菌株的分离、纯化及鉴定
从保山病毒病高发植烟区采集未发病烟株根际土壤样品，称取采集的土样2g，加入20mL ddH2O，28℃、180rpm振荡培养16h，取出静置30min，取上清在LB固体培养基上划线，倒置于28℃培养箱中培养获得菌株。按照试剂盒说明书进行DNA提取，PCR扩增，后交由宝生物工程(大连)有限公司进行16S rDNA测序，经NCBI网站上的BLAST程序比对确定为解淀粉芽孢杆菌。该菌株的培养条件为28℃，LB培养基，pH7.0。菌株代号为KBD-2，该菌株于2020年08月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号为CGMCC No.20570，分类命名为Bacillusamyloliquefaciens。
实施例2菌株KBD-2生物合成纳米硒
挑取生长良好的单一菌落接种于LB液体培养基中，28℃、150rpm振荡培养20h，后以1％(v/v)接种量加入到含1mM亚硒酸钠的LB液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养2d-5d，菌液呈现红色，表明菌株KBD-2能还原亚硒酸钠生成纳米硒(图1)，后用水稀释，制成纳米硒生物合成活性菌液(硒含量50mg/L，菌浓度108cfu/mL)。
实施例3菌株KBD-2对TMV的抑制作用
采用半叶法检测活性，挑取纯化菌株接种于LB液体培养基，28℃、150rpm振荡培养20h，取10mL KBD-2菌液(浓度为108cfu/mL)与等体积40倍TMV汁液(将带TMV的烟草叶片冷冻研磨成粉末，按1:40加去离子水，纱布过滤)混合15min后，摩擦接种3株三生烟，每株接种上部2片叶，同时设空白对照(PBS缓冲液与等体积40倍TMV汁液混合)，3-5d调查枯斑数。实验结果显示，菌株KBD-2对TMV具有较好的抑制效果，抑制率达90.1％(表1)。
表1菌株KBD-2对烟草普通花叶病毒的抑制作用
Figure BDA0002845832970000041
实施例4纳米硒合成活性菌液对TMV的抑制作用
取10mL纳米硒生物合成活性菌液(硒含量为50mg/L，菌浓度108cfu/mL)与等体积40倍TMV汁液混合15min后，摩擦接种3株三生烟，每株接种上部2片叶，同时设空白对照(LB液体培养基与等浓度病毒汁液混合)，检测其枯斑抑制率。从图2可知，纳米硒生物合成活性菌株对TMV的抑制效果较好，枯斑抑制率高达94.2％(表2)，比菌株KBD-2对TMV的抑制率高(表2)，菌株生物合成纳米硒后增强了其抗TMV的能力。
表2纳米硒生物合成活性菌株对烟草普通花叶病毒的抑制作用
Figure BDA0002845832970000042
实施例5纳米硒生物合成活性菌液对田间作物病毒病的预防作用
(1)菌液处理。实验室发酵50L纳米硒生物合成活性菌液(硒含量为50mg/L，菌浓度108cfu/mL)备用。无毒K326烟苗假植之后，5-6叶期进行接种。按含病毒(TMV、CMV、PVY、TSWV)的新鲜叶片分别与接种缓冲液质量与体积比为1:40配制病毒汁液，并且以LB液体培养基与等体积病毒汁液混合作为阳性对照。3个处理：处理I菌液和病毒汁液混合15min后接种；处理II先喷菌液，2h后再接种病毒汁液；处理III先接种病毒汁液，2h后再喷施菌液。喷药时叶片正反两面均匀喷施，喷雾量以烟苗和基质湿透为宜，保证各处理喷雾量基本一致。
(2)小区设置。2020年4月28日选择在中国农业科学院烟草研究所即墨试验基地土质、肥力、水肥管理一致的烟区进行，分为四个区域，分别进行抗TMV、CMV、PVY、TSWV病毒试验。每个抗病毒实验设3个菌液处理，并且以LB培养基与等体积病毒汁液混合为阳性对照，每个处理3次重复，每小区50株，小区间设保护行。
烟株移栽30d后调查发病情况，结果显示，纳米硒生物合成活性菌液对TMV、CMV、PVY、TSWV的防效均较好(表3)。其中，与病毒汁液混合抑制效果最好，菌液可钝化绝大部分病毒的活性，对4种病毒的抑制效果均在86.0％以上，TMV抑制率最高达93.2％；其次是先喷菌液，2h后接种病毒，菌液可在烟叶表面定殖，阻止病毒侵染，对4种病毒的防效为72.4％-75.5％；而接种后喷菌液对4种病毒的防治效果均不足15.0％，没有经过菌液处理的对照组发病率达到97.7％以上。所以，不同菌液处理方式的抗病毒效果依次为：菌液与病毒混合接种>先喷菌液再接种>先接种后喷菌液>不用菌液处理。菌株KBD-2生物合成纳米硒在田间生产上用作抗病毒剂，可以有效预防田间病毒病的发生。
表3纳米硒生物合成活性菌液在田间对TMV、CMV、PVY、TSWV的抑制活性
Figure BDA0002845832970000051
实施例6纳米硒生物合成活性菌液对作物的促生作用
为检验KBD-2菌株及其生物合成纳米硒的促生效应，在育苗基质中培育K326至5-6片真叶，后选择长势一致的烟苗进行移栽，移栽前将烟苗根部分别浸泡在1×108cfu/mL浓度的KBD-2菌液的200倍稀释液中30min。缓苗3d后再往每株烟苗根部灌施4mL同等浓度的KBD-2菌液，同时取1mL菌液淋于茎基部。另取纳米硒生物合成活性菌液(硒含量为50mg/L，菌浓度108cfu/mL)200倍稀释液按同样的方法处理烟株，空白对照则采用清水，其余按照温室常规管理。3个处理各设3次重复，每重复5株烟。移栽45d后，测量整株及根部的干鲜重，平均株高，平均根长，最大叶长，最大叶宽。
从表4可知，2个处理对K326整株及根部干鲜重的促进作用明显，其中，纳米硒生物合成活性菌对整株干重、根部干重的促进作用最明显，比对照分别增加49.12％、51.43％。2个处理对烟株农艺性状的作用如表5所示，纳米硒生物合成活性菌对根长和株高的促进作用最明显，特别是促进主根系的生长，与对照相比，增长率分别是28.31％和18.32％，略高于KBD-2菌处理的烟苗23.76％和13.61％。这表明，2个处理均可有效促进株高和根系的生长，增加叶片表面积，积累干物质，KBD-2菌的整体促生效果略低于其纳米硒生物合成活性菌。
表4各处理对烟株生物量的促生作用
Figure BDA0002845832970000061
表5各处理对烟苗农艺性状的促生作用
Figure BDA0002845832970000062
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液，其特征在于，是由解淀粉芽孢杆菌进行发酵合成纳米硒后，由解淀粉芽孢杆菌及其合成的纳米硒组成的混合液；
所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌KBD-2；该菌株于2020年08月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号为CGMCC No.20570，分类命名为Bacillus amyloliquefaciens。
2.根据权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液中解淀粉芽孢杆菌的菌含量≥108cfu/mL；纳米硒浓度≥50mg/L。
3.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液的制备方法，其特征在于，步骤如下：
将活化后的菌株CGMCC No.20570以1％接种量加入到含1mM亚硒酸钠的LB液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养，2-5d后菌液中观察到红色出现，上述发酵混合液即为所述解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液。
4.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液在防治农作物病毒病或作物促生中的应用。
5.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液在制备防治农作物病毒病的抗病毒剂或作物促生剂中的应用。
6.一种防治作物病毒病的方法，其特征在于，将权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液均匀喷洒于作物叶片正反面，使作物和基质湿透。
7.根据权利要求6所述防治作物病毒病的方法，其特征在于，所述病毒病包括由烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒和番茄斑萎病毒中的任意一种病毒所引起的作物疾病。
8.一种作物的促生方法，其特征在于，先将权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液制备成稀释液；然后在作物移栽前采用上述稀释液浸根30min，缓苗3d后再往每株根部灌施稀释液，同时取少量稀释液淋于茎基部；所述稀释液中解淀粉芽孢杆菌的菌含量为5×105cfu/mL；纳米硒浓度为2.5mg/L。
9.一种作物抗病毒剂，其特征在于，其有效成分包含权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液，其中，解淀粉芽孢杆菌的菌含量≥108cfu/mL；纳米硒浓度≥50mg/L。
10.一种作物促生剂，其特征在于，其有效成分包含权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的纳米硒合成活性菌液，其中，解淀粉芽孢杆菌的菌含量为5×105cfu/mL；纳米硒浓度为2.5mg/L。
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