CN114946884A - 一种纳米硒益生菌制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纳米硒益生菌制剂的制备方法，包括：将活化后的益生菌发酵乳杆菌接种于预先改良的MRS液体培养基中，厌氧培养，得到纳米硒‑发酵乳杆菌发酵醪液；其中，所述预先改良的MRS液体培养基为采用在MRS液体培养基中加入亚硒酸钠制备得到；从所述纳米硒‑发酵乳杆菌发酵醪液中，收集得到纳米硒‑发酵乳杆菌复合物；将所述纳米硒‑发酵乳杆菌复合物与保护剂混合，冻干处理，得到所述纳米硒‑发酵乳杆菌制剂，即得到所述纳米硒益生菌制剂；本发明制备的纳米硒‑发酵乳杆菌制剂中纳米硒能够抑使小麦赤霉菌的孢子萌发和菌丝生长受明显抑制，其中的纳米硒具有促进植物生长的功效；安全无毒，同时，能够避免了环境污染。

Description

一种纳米硒益生菌制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于纳米抑菌制剂技术领域，特别涉及一种纳米硒益生菌制剂及其制备方法和应用。
背景技术
目前，真菌感染已造成全球约25％的农产品损失，是农业生产面临的主要威胁；小麦赤霉病在中国南方冬麦区及东北三江平原春麦区经常流行，造成产量严重损失，而且病麦含有致呕毒素和类雌性激素等毒素，人畜食后可引起急性中毒。为了抑制真菌感染，大量化学农药被广泛使用，农药残留严重威胁人体健康，并对环境造成极大污染。因此，开发无毒、高效的真菌病原菌抑菌药物是当前亟需解决的关键问题之一。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种纳米硒益生菌制剂及其制备方法和应用，以解决现有采用化学农药的抑制真菌方法中，存在农药残留及环境污染的技术问题。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明公开了一种纳米硒益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、对益生菌发酵乳杆菌进行活化处理，得到活化后的益生菌发酵乳杆菌；
步骤2、将活化后的益生菌发酵乳杆菌接种于预先改良的MRS液体培养基中，厌氧培养，得到纳米硒-发酵乳杆菌发酵醪液；其中，所述预先改良的MRS液体培养基为采用在MRS液体培养基中加入亚硒酸钠制备得到；
步骤3、从所述纳米硒-发酵乳杆菌发酵醪液中，收集得到纳米硒-发酵乳杆菌复合物；
步骤4、将所述纳米硒-发酵乳杆菌复合物与保护剂混合，冻干处理，得到所述纳米硒-发酵乳杆菌制剂，即得到所述纳米硒益生菌制剂。
进一步的，步骤1中，对益生菌发酵乳杆菌进行活化处理，得到活化后的发酵乳杆菌的过程，具体如下：
将益生菌发酵乳杆菌接种于蔗糖改良的MRS液体培养基中，厌氧培养；
重复上述操作，连续活化处理预设次数后，得到所述活化后的益生菌发酵乳杆菌。
进一步的，厌氧培养温度为35℃-37℃，培养时间为14-20h；连续活化2-3次。
进一步的，步骤2中，将活化后的益生菌发酵乳杆菌接种于预先改良的MRS液体培养基中，厌氧培养，得到纳米硒-发酵乳杆菌发酵醪液的过程中，具体如下：
将所述活化后的益生菌发酵乳杆菌按1％-3％的接种量接种于预先改良的MRS液体培养基中，置于35-37℃的条件下，厌氧培养36-48h，得到所述纳米硒-发酵乳杆菌发酵醪液。
进一步的，步骤2中，预先改良的MRS液体培养基中，亚硒酸钠的终浓度为3-30mmol/L；所述亚硒酸钠采用单独灭菌后加入MRS液体培养基中。
进一步的，步骤3中，从所述纳米硒-发酵乳杆菌发酵醪液中，收集得到纳米硒-发酵乳杆菌复合物的过程，具体如下：
对所述纳米硒-发酵乳杆菌发酵醪液进行离心，弃上清液，得到沉淀产物；其中，离心转速为8000-10000r/min，离心时间为10-15min；
对所述沉淀产物进行重复洗涤，离心，得到所述纳米硒-发酵乳杆菌复合物；其中，洗涤过程采用无菌生理盐水悬浮洗涤；离心转速为8000-10000r/min，离心时间为10-15min。
进一步的，步骤4中，保护剂为海藻糖和低聚果糖；其中，海藻糖的质量百分数为6.0％-8.0％，低聚果糖的质量百分数为12.0％-14.0％。
进一步的，步骤4中，冻干处理过程，具体为：采用在-80℃的条件下，预冻2-6h后，冻干处理12-36h。
本发明还提供了一种纳米硒益生菌制剂，所述纳米硒益生菌制剂采用所述的一种纳米硒益生菌制剂的制备方法制备得到。
本发明还提供了一种纳米硒益生菌制剂的应用，所述纳米硒益生菌制剂应用于小麦赤霉菌的抑制。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供了一种纳米硒益生菌制剂及其制备方法和应用，利用活化后的益生菌发酵乳杆菌将无机硒转化为低毒、活性强的纳米硒，将纳米硒-发酵乳杆菌复合物冻干处理，制备成纳米硒-益生菌制剂；由于活化后的益生菌发酵乳杆菌转化合成纳米硒能力强，形成的纳米硒均匀、分散、粒度小的特点；纳米硒-益生菌制剂中的纳米硒不仅能显著抑制小麦赤霉菌，而且纳米硒还具有促进植物生长、提高产品富硒水平等功效；并且益生菌发酵乳杆菌具有安全、抑菌、有益等功效；利用纳米硒和益生菌制备成的高活性纳米硒-益生菌制剂，具有双重功效，与现有抑制真菌的产品，更安全、更有效；所述的纳米硒益生菌制剂安全无毒，同时，能够避免了环境污染。
附图说明
图1为实施例1中纳米硒-发酵乳杆菌复合物的扫描电镜图；
图2为实施例1中纳米硒-发酵乳杆菌复合物中纳米硒的透射电镜图；
图3为实施例1中纳米硒-发酵乳杆菌复合物中纳米硒的粒度分布图；
图4为实施例1中不同浓度的纳米硒-发酵乳杆菌制剂对小麦赤霉菌的孢子萌发率柱状图；
图5为实施例2中不同浓度的纳米硒-发酵乳杆菌制剂对小麦赤霉菌的孢子萌发率柱状图。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题，技术方案及有益效果更加清楚明白，以下具体实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了一种纳米硒益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，菌种活化
将冰箱保存的发酵乳杆菌接种于蔗糖改良MRS液体培养基，35℃-37℃厌氧培养14-20h，连续活化2-3次；其中，所述蔗糖改良的MRS液体培养基为采用蔗糖等量替换MRS液体培养基配方中的葡萄糖。
步骤2，纳米硒转化
将步骤1活化后的发酵乳杆菌分别以1-3％的接种量，接种于亚硒酸钠终浓度为的6mmol/L-30mmol/L的改良MRS液体培养基中，亚硒酸钠需单独灭菌后加入，35℃-37℃厌氧培养36-48h得到纳米硒-发酵乳杆菌发酵醪液。
步骤3，纳米硒-发酵乳杆菌的收集
将步骤2的发酵醪液，于高速冷冻离心机离心处理10-15min，离心转速为8000-10000r/min，离心温度为4℃；弃上清液，沉淀用无菌生理盐水悬浮洗涤，离心10-15min，离心转速为8000-10000r/min，离心温度为4℃；重复洗涤三次得湿菌体，即收集得到纳米硒-发酵乳杆菌复合物。
步骤4，将步骤3制备的纳米硒-发酵乳杆菌复合物添加保护剂，并在-80℃的条件下，预冻2-6h后，冻干12-36h，得到所述纳米硒-发酵乳杆菌制剂，即得到所述纳米硒益生菌制剂；所述纳米硒益生菌制剂为具有双重保健作用可常温保存的纳米硒-发酵乳杆菌制剂；其中，保护剂为海藻糖和低聚果糖；海藻糖的质量百分数为6.0％-8.0％，低聚果糖的质量百分数为12.0％-14.0％。
本发明中，利用所述一种纳米硒益生菌制剂的制备方法，制备得到的纳米硒益生菌制剂，能够用于小麦赤霉菌的抑制，应用于小麦种子的储存、育种及加工产品环节。
作用机理：
本发明所述的纳米硒益生菌制剂的制备方法，利用活化后的益生菌发酵乳杆菌，实现将毒性强的无机硒转化成低毒、活性强的纳米硒；菌体对硒的转化是细胞的解毒过程，菌体内存在的谷胱甘肽还原酶能够将无机硒如亚硒酸盐SeO3 2-还原形成中间产物GS-Se-SG，反应过程中同时合成了超氧根离子O2 -，大量的O2 -容易引起对细胞的自由基伤害作用，这也是无机硒引起细胞毒性的一个原因；形成的中间产物GS-Se-SG不稳定，接受NADPH提供氢离子，经过两步反应最终形成稳定的纳米硒；急毒性实验发现，纳米硒的LD50为112.98mg/kg体重，而亚硒酸盐为15.72mg/kg体重，说明微生物转化的纳米硒具有更好的安全性；益生菌发酵乳杆菌具有耐受亚硒酸钠能力强、转化合成纳米硒效率高，形成的纳米硒均匀、分散、粒度小等优势。
本发明制备的纳米硒-发酵乳杆菌制剂中的纳米硒具有抑制小麦赤霉菌生长，使小麦赤霉菌的孢子萌发和菌丝生长受明显抑制；而且其中的纳米硒还具有促进植物生长、提高产品富硒水平等功效；同时，益生菌发酵乳杆菌具有安全、抑菌、有益的保健功效；本发明中将纳米硒和益生菌制备成高活性纳米硒益生菌冻干粉，具有双重功效，与现有采用农药或化学方法抑制真菌的手段相比，更安全、更有效。
实施例1
本实施例1提供了一种纳米硒益生菌制剂的制备方法及其应用，具体包括以下步骤：
步骤1、菌种活化
将冰箱保存的益生菌发酵乳杆菌，接种于蔗糖改良的MRS液体培养基，在37℃的温度条件下，厌氧培养14h；重复上述操作，连续活化3次，得到活化后的益生菌发酵乳杆菌；其中，所述蔗糖改良的MRS液体培养基为采用蔗糖等量替换MRS液体培养基配方中的葡萄糖。
步骤2、纳米硒转化合成
将所述活化后的益生菌发酵乳杆菌按1％的接种量，接种于亚硒酸钠终浓度为的6mmol/L的改良的MRS液体培养基中，置于37℃的温度条件下，厌氧培养48h，得到所述纳米硒-发酵乳杆菌发酵醪液。
步骤3、纳米硒-发酵乳杆菌的收集
将所述纳米硒-发酵乳杆菌发酵醪液，于高速冷冻离心机中，在4℃的温度条件下，以10000r/min转速，离心处理10min，弃上清液，得到沉淀产物；
对所述沉淀产物，采用无菌生理盐水悬浮洗涤，并在4℃的温度条件下，以10000r/min转速，离心处理10min；重复洗涤3次，得到湿菌体，即收集得到纳米硒-发酵乳杆菌复合物。
扫描电镜观察：
将所述纳米硒-发酵乳杆菌复合物进行冻干处理，并经离子溅射后，进行扫描电镜观察，得到纳米硒-发酵乳杆菌复合物的扫描电镜图；其中，冻干处理过程，采用在-80℃下预冻2h后，冻干24h；如附图1所示，附图1中给出了实施例1中的纳米硒-发酵乳杆菌复合物的扫描电镜图，从附图1中可以看出发酵乳杆菌细胞周围存在的球形颗粒为纳米硒，颗粒均匀、分散性良好。
纳米硒的表征：
将纳米硒-发酵乳杆菌复合物用质量百分数为0.9％的NaCl溶液洗涤并且离心后，转入研钵；加入液氮使细胞冷冻，用研棒研磨；研磨后形成的粘合液于超声波100W破碎5min，破碎完成后用含质量百分数为1％的SDS的1.5mol/L Tris/HCl buffer连续离心洗涤3次，得到沉淀物；其中，SDS采用超纯水溶解，Tris/HCl buffer的pH为8.3；将沉淀物重悬于超纯水中，得到重悬液；最终重悬液中包含纳米硒颗粒和细胞碎片。
将4mL的重悬液转入试管中，并加入2mL仲辛醇于试管中，剧烈摇晃，溶液分成两层；混合的两相通过离心速率为2000r/mim，离心5min而分开，离心后放入4℃冰箱保存24h；产生的纳米硒沉淀于试管底部，细胞碎片仍悬浮于两相之间；将上层的弃之，沉降的纳米硒颗粒依次通过氯仿、乙醇和无菌水洗涤。
取纳米硒颗粒重悬于纯水中，滴加于铜网上，滤纸吸去多余水分，红外线灯照射干燥后，透射电镜观察，得到纳米硒-发酵乳杆菌复合物中纳米硒的透射电镜图，如附图2所示；从附图2中可以看出，本实施例1中在透射电镜下，纳米硒颗粒为规则球体，在水中分散性良好。
将纳米硒重悬于纯水中，滴加于一次性比色皿中，置于纳米粒度仪卡槽中，测定纳米硒的粒径；设定预热时间：120s，测量温度：25℃，测量次数：3次，得到纳米硒-发酵乳杆菌复合物中纳米硒的粒度分布图，如附图3所述；从附图3中可以看出，本实施例1中发酵乳杆菌转化的纳米硒粒度介于51.7-240.7nm之间，平均为78.70±3.89nm。
步骤4、保护剂的添加
将保护剂溶解于纯净水，得到保护剂溶液；其中，保护剂为海藻糖和低聚果糖；海藻糖的质量百分数为8.0％，低聚果糖的质量百分数为12.0％；将所述保护剂溶液在115℃的条件下，30min灭菌后添加到纳米硒-发酵乳杆菌复合物中，得到混合物；其中，冻干保护剂溶液与纳米硒-发酵乳杆菌复合物质量比重为1:1。
步骤5、冻干处理
将步骤4制备的混合物在-80℃的条件下，预冻2h后，置于真空冷冻干燥机中，冻干处理24h，得到所述纳米硒-发酵乳杆菌制剂。
所述纳米硒益生菌制剂应用于小麦赤霉菌的抑制的过程，具体如下：
步骤6、小麦赤霉菌培养
将小麦赤霉菌接种于至PDA培养基中，28℃培养72h。
步骤7、小麦赤霉菌的接种
用接种针将步骤6培养的小麦赤霉菌垂直点接于含有两种不同浓度纳米硒-发酵乳杆菌制剂的PDA培养基中央；其中，第一种含有纳米硒-发酵乳杆菌制剂的PDA培养基中，纳米硒-发酵乳杆菌制剂的浓度为100mg/L；第二种含有纳米硒-发酵乳杆菌制剂的PDA培养基中，纳米硒-发酵乳杆菌制剂的浓度为200mg/L；并以不含纳米硒-发酵乳杆菌制剂的培养基作为对照组。
步骤8、小麦赤霉菌的抑菌培养及观察
将步骤7中的小麦赤霉菌在28℃的温度条件下，恒温培养48h，观察纳米硒-发酵乳杆菌制剂对小麦赤霉菌菌丝生长的影响；其中，无纳米硒-发酵乳杆菌制剂的对照菌丝生长正常，菌丝布满平板。
本实施例1中，在涂布有纳米硒-发酵乳杆菌制剂的平板上，菌落较小，菌丝生长受到明显抑制，菌落直径见表1，并计算抑制率。
表1小麦赤霉菌落直径
Figure BDA0003723952950000081
步骤9、小麦赤霉菌孢子制备
将小麦赤霉菌接种在PDA培养基中，于28℃恒温培养箱中黑暗生长7d；用移液枪吸取5mL无菌水于小麦赤霉菌产孢培养基上，然后利用接种环反复刮小麦赤霉菌的孢子，之后使用无菌纱布对其悬浮液进行过滤；吸取预设量的孢子悬浮液滴于血球计数板在显微镜下进行计数，稀释孢子悬浮液至每个视野下120-130个左右备用。
步骤10、小麦赤霉菌孢子添加纳米硒-发酵乳杆菌制剂
在PDA培养基中分别加入浓度为50mg/L、100mg/L、150mg/L及200mg/L的纳米硒-发酵乳杆菌制剂，以未添加纳米硒-发酵乳杆菌制剂的培养基作空白对照组；准确吸取步骤9制备的小麦赤霉菌孢子悬浮液5uL滴加在添加了不同浓度纳米硒-发酵乳杆菌制剂的PDA培养基中，每个处理设置三个重复步骤。
步骤11、小麦赤霉菌孢子的培养及萌发率计算
将步骤10中的小麦赤霉菌孢子28℃恒温培养2-3h，利用显微镜对萌发的小麦赤霉菌孢子进行计数，取三次平均值为结果，计算纳米硒处理对小麦赤霉菌孢子萌发的影响，得到不同浓度的纳米硒-发酵乳杆菌制剂对小麦赤霉菌的孢子萌发率柱状图，如附图4所示；从附图4中可以看出，本实施例1中在不同浓度纳米硒-发酵乳杆菌制剂处理下，小麦赤霉菌孢子萌发率随着纳米硒-发酵乳杆菌制剂浓度增大，当纳米硒-发酵乳杆菌制剂浓度为200mg/L时，孢子萌发率只有25.6％。
实施例2
本实施例2提供了一种纳米硒益生菌制剂的制备方法及其应用，具体包括以下步骤：
步骤1、菌种活化
将冰箱保存的益生菌发酵乳杆菌，接种于蔗糖改良的MRS液体培养基，在35℃的温度条件下，厌氧培养16h；重复上述操作，连续活化2次，得到活化后的益生菌发酵乳杆菌；其中，所述蔗糖改良的MRS液体培养基为采用蔗糖等量替换MRS液体培养基配方中的葡萄糖。
步骤2、纳米硒转化合成
将所述活化后的益生菌发酵乳杆菌按2％的接种量，接种于亚硒酸钠终浓度为的15mmol/L的改良的MRS液体培养基中，置于35℃的温度条件下，厌氧培养36h，得到所述纳米硒-发酵乳杆菌发酵醪液。
步骤3、纳米硒-发酵乳杆菌的收集
将所述纳米硒-发酵乳杆菌发酵醪液，于高速冷冻离心机中，在4℃的温度条件下，以8000r/min转速，离心处理15min，弃上清液，得到沉淀产物；
对所述沉淀产物，采用无菌生理盐水悬浮洗涤，并在4℃的温度条件下，以8000r/min转速，离心处理15min；重复洗涤3次，得到湿菌体，即收集得到纳米硒-发酵乳杆菌复合物。
步骤4、保护剂的添加
将保护剂溶解于纯净水，得到保护剂溶液；其中，保护剂为海藻糖和低聚果糖；海藻糖的质量百分数为6.0％，低聚果糖的质量百分数为14.0％；将所述保护剂溶液在115℃的条件下，30min灭菌后添加到纳米硒-发酵乳杆菌复合物中，得到混合物；其中，冻干保护剂溶液与纳米硒-发酵乳杆菌复合物质量比重为1:1。
步骤5、冻干处理
将步骤4制备的混合物在-80℃的条件下，预冻4h后，置于真空冷冻干燥机，冻干处理12h，得到所述纳米硒-发酵乳杆菌制剂。
所述纳米硒益生菌制剂应用于小麦赤霉菌的抑制的过程，具体如下：
步骤6、小麦赤霉菌培养
将小麦赤霉菌接种于至PDA培养基中，28℃培养72h。
步骤7、小麦赤霉菌的接种
用接种针将步骤6培养的小麦赤霉菌垂直点接于含有两种不同浓度纳米硒-发酵乳杆菌制剂的PDA培养基中央；其中，第一种含有纳米硒-发酵乳杆菌制剂的PDA培养基中，纳米硒-发酵乳杆菌制剂的浓度为100mg/L；第二种含有纳米硒-发酵乳杆菌制剂的PDA培养基中，纳米硒-发酵乳杆菌制剂的浓度为200mg/L；并以不含纳米硒-发酵乳杆菌制剂的培养基作为对照组。
步骤8、小麦赤霉菌的抑菌培养及观察
将步骤7中的小麦赤霉菌在28℃的温度条件下，恒温培养48h，观察纳米硒-发酵乳杆菌制剂对小麦赤霉菌菌丝生长的影响；其中，无纳米硒-发酵乳杆菌制剂的对照菌丝生长正常，菌丝布满平板。
本实施例2中，在涂布有纳米硒-发酵乳杆菌制剂的平板上，菌落较小，菌丝生长受到明显抑制，菌落直径及抑制率见表2。
表2小麦赤霉菌落直径
Figure BDA0003723952950000111
步骤9、小麦赤霉菌孢子制备
将小麦赤霉菌接种在PDA培养基中，于28℃恒温培养箱中黑暗生长7d；用移液枪吸取5mL无菌水于小麦赤霉菌产孢培养基上，然后利用接种环反复刮小麦赤霉菌的孢子，之后使用无菌纱布对其悬浮液进行过滤；吸取预设量的孢子悬浮液滴于血球计数板在显微镜下进行计数，稀释孢子悬浮液至每个视野下120-130个左右备用。
步骤10、小麦赤霉菌孢子添加纳米硒-发酵乳杆菌制剂
在PDA培养基中分别加入浓度为50mg/L、100mg/L、150mg/L及200mg/L的纳米硒-发酵乳杆菌制剂，以未添加纳米硒-发酵乳杆菌制剂的培养基作空白对照组；准确吸取步骤9制备的小麦赤霉菌孢子悬浮液5uL滴加在添加了不同浓度纳米硒-发酵乳杆菌制剂的PDA培养基中，每个处理设置三个重复步骤。
步骤11，小麦赤霉菌孢子的培养及萌发率计算
将步骤10中的小麦赤霉菌孢子28℃恒温培养2-3h，利用显微镜对萌发的小麦赤霉菌孢子进行计数，取三次平均值为结果，计算纳米硒处理对小麦赤霉菌孢子萌发的影响，得到不同浓度的纳米硒-发酵乳杆菌制剂对小麦赤霉菌的孢子萌发率柱状图，如附图5所示；从附图5中可以看出，本实施例2中在不同浓度纳米硒-发酵乳杆菌制剂处理下，小麦赤霉菌孢子萌发率随着纳米硒-发酵乳杆菌制剂浓度增大，当纳米硒-发酵乳杆菌制剂浓度为200mg/L时，孢子萌发率只有28.5％。
实施例3
本实施例3提供了一种纳米硒益生菌制剂的制备方法及其应用，具体包括以下步骤：
步骤1、菌种活化
将冰箱保存的益生菌发酵乳杆菌，接种于蔗糖改良的MRS液体培养基，在37℃的温度条件下，厌氧培养20h；重复上述操作，连续活化3次，得到活化后的益生菌发酵乳杆菌；其中，所述蔗糖改良的MRS液体培养基为采用蔗糖等量替换MRS液体培养基配方中的葡萄糖。
步骤2、纳米硒转化合成
将所述活化后的益生菌发酵乳杆菌按3％的接种量，接种于亚硒酸钠终浓度为的30mmol/L的改良的MRS液体培养基中，置于36℃的温度条件下，厌氧培养42h，得到所述纳米硒-发酵乳杆菌发酵醪液。
步骤3、纳米硒-发酵乳杆菌的收集
将所述纳米硒-发酵乳杆菌发酵醪液，于高速冷冻离心机中，在4℃的温度条件下，以9000r/min转速，离心处理12min，弃上清液，得到沉淀产物；
对所述沉淀产物，采用无菌生理盐水悬浮洗涤，并在4℃的温度条件下，以9000r/min转速，离心处理12min；重复洗涤3次，得到湿菌体，即收集得到纳米硒-发酵乳杆菌复合物。
步骤4、保护剂的添加
将保护剂溶解于纯净水，得到保护剂溶液；其中，保护剂为海藻糖和低聚果糖；海藻糖的质量百分数为7.0％，低聚果糖的质量百分数为13.0％；将所述保护剂溶液在115℃的条件下，30min灭菌后添加到纳米硒-发酵乳杆菌复合物中，得到混合物；其中，冻干保护剂溶液与纳米硒-发酵乳杆菌复合物质量比重为1:1。
步骤5、冻干处理
将步骤4制备的混合物在-80℃的条件下，预冻6h后，置于真空冷冻干燥机，冻干处理36h，得到所述纳米硒-发酵乳杆菌制剂。
步骤6、将所述纳米硒-发酵乳杆菌制剂应用于小麦赤霉菌生长和孢子萌发的抑制研究，同样能够抑制菌丝生长和孢子萌发，在200mg/L浓度下，小麦赤霉菌菌丝生长抑制率达到77.6％，小麦赤霉菌孢子萌发率为26.3％；具体的抑制过程与实施例1基本相同，此处不在赘述。
本发明所述的纳米硒益生菌制剂及其制备方法和应用，采用活化后的益生菌发酵乳杆菌制备对无机硒进行转化，冻干处理，得到纳米硒益生菌制剂；所述纳米硒益生菌制剂中的益生菌具有安全性和有益作用，所述纳米硒益生菌制剂中的纳米硒对小麦赤霉菌表现明显的的抑菌作用，而且纳米硒具有调节代谢、促进植物生长等重要的生理功能，为抑制小麦病原真菌防控提供一种有效和有益的生物制剂。
本发明中益生菌发酵乳杆菌能产生多种细菌素、苯乳酸等，在抑菌方面具有重要的应用价值；结合纳米硒和益生菌的双重优点，采用发酵乳杆菌转化合成纳米硒并制备成复合制剂为小麦植物病害防治及小麦保存加工领域提供一种生物源纳米硒抑菌剂。
上述实施例仅仅是能够实现本发明技术方案的实施方式之一，本发明所要求保护的范围并不仅仅受本实施例的限制，还包括在本发明所公开的技术范围内，任何熟悉本技术领域的技术人员所容易想到的变化、替换及其他实施方式。

Claims (10)

1.一种纳米硒益生菌制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、对益生菌发酵乳杆菌进行活化处理，得到活化后的益生菌发酵乳杆菌；
步骤2、将活化后的益生菌发酵乳杆菌接种于预先改良的MRS液体培养基中，厌氧培养，得到纳米硒-发酵乳杆菌发酵醪液；其中，所述预先改良的MRS液体培养基为采用在MRS液体培养基中加入亚硒酸钠制备得到；
步骤3、从所述纳米硒-发酵乳杆菌发酵醪液中，收集得到纳米硒-发酵乳杆菌复合物；
步骤4、将所述纳米硒-发酵乳杆菌复合物与保护剂混合，冻干处理，得到所述纳米硒-发酵乳杆菌制剂，即得到所述纳米硒益生菌制剂。
2.根据权利要求1所述的一种纳米硒益生菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤1中，对益生菌发酵乳杆菌进行活化处理，得到活化后的发酵乳杆菌的过程，具体如下：
将益生菌发酵乳杆菌接种于蔗糖改良的MRS液体培养基中，厌氧培养；
重复上述操作，连续活化处理预设次数后，得到所述活化后的益生菌发酵乳杆菌。
3.根据权利要求2所述的一种纳米硒益生菌制剂的制备方法，其特征在于，厌氧培养温度为35℃-37℃，培养时间为14-20h；连续活化2-3次。
4.根据权利要求1所述的一种纳米硒益生菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤2中，将活化后的益生菌发酵乳杆菌接种于预先改良的MRS液体培养基中，厌氧培养，得到纳米硒-发酵乳杆菌发酵醪液的过程中，具体如下：
将所述活化后的益生菌发酵乳杆菌按1％-3％的接种量接种于预先改良的MRS液体培养基中，置于35-37℃的条件下，厌氧培养36-48h，得到所述纳米硒-发酵乳杆菌发酵醪液。
5.根据权利要求1所述的一种纳米硒益生菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤2中，预先改良的MRS液体培养基中，亚硒酸钠的终浓度为6-30mmol/L；所述亚硒酸钠采用单独灭菌后加入MRS液体培养基中。
6.根据权利要求1所述的一种纳米硒益生菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤3中，从所述纳米硒-发酵乳杆菌发酵醪液中，收集得到纳米硒-发酵乳杆菌复合物的过程，具体如下：
对所述纳米硒-发酵乳杆菌发酵醪液进行离心，弃上清液，得到沉淀产物；其中，离心转速为8000-10000r/min，离心时间为10-15min；
对所述沉淀产物进行重复洗涤，离心，得到所述纳米硒-发酵乳杆菌复合物；其中，洗涤过程采用无菌生理盐水悬浮洗涤；离心转速为8000-10000r/min，离心时间为10-15min。
7.根据权利要求1所述的一种纳米硒益生菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤4中，保护剂为海藻糖和低聚果糖；其中，海藻糖的质量百分数为6.0％-8.0％，低聚果糖的质量百分数为12.0％-14.0％。
8.根据权利要求1所述的一种纳米硒益生菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤4中，冻干处理过程，具体为：采用在-80℃的条件下，预冻2-6h后，冻干处理12-36h。
9.一种纳米硒益生菌制剂，其特征在于，所述纳米硒益生菌制剂采用如权利要求1-8任意一项所述的一种纳米硒益生菌制剂的制备方法制备得到。
10.如权利要求9所述的一种纳米硒益生菌制剂的应用，其特征在于，所述纳米硒益生菌制剂应用于小麦赤霉菌的抑制。
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