CN117106619B - 一株富硒植物乳植杆菌kd-2及其在发酵乳和奶粉中的应用 - Google Patents
一株富硒植物乳植杆菌kd-2及其在发酵乳和奶粉中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一株富硒植物乳植杆菌KD‑2及其在发酵乳和奶粉中的应用，该菌株已于2023年4月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2023478。所述植物乳植杆菌KD‑2在缓冲液条件下能还原亚硒酸钠制备得到纳米硒，不需要在培养基中进行，还可以将该菌株用于制备富硒益生菌发酵乳、制备富硒益生菌和纳米硒，并将富硒益生菌和纳米硒应用于奶粉中。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及一株富硒植物乳植杆菌KD-2及其在制备发酵乳和奶粉中的应用。
背景技术
硒是人和动物所必需的一种微量元素，但由于其毒性，很容易被过量服用。纳米硒是硒在所有形式中毒性最低的，且其纳米尺寸具有更高的生物利用活性，因此纳米硒的制备是目前研究的热点。
目前，纳米硒制备方法有化学方法、生物法。化学方法已被广泛的应用于制备纳米硒中，最普遍的方法是利用抗坏血酸来还原亚硒酸盐和硒酸盐等硒氧阴离子，并通过模板法和固相法等方法使其得到的还原产物为纳米级的单质硒。
生物法合成纳米粒子与化学方法相比，属于“绿色化学”，旨在尽量减少化学合成对环境造成的负面影响。因此，用生物(微生物、植物和动物)及其来源的酶制备各种元素的纳米粒子是对化学合成的生态学无害替代，并且是目前研究的热点。在过去10年，各种纳米结构材料的生物制备，包括通过自然界中广泛存在的微生物产生的硒纳米颗粒也越来越吸引研究人员的注意。
大部分微生物细胞均有能力将硒氧阴离子(SeO4 2-和SeO3 2-)还原成零价的单质硒。从受污染地区中得到的厌氧菌如芽孢杆菌(Bacillus sp.)、金属雷尔氏菌(Ralstoniametallidurans)和陶厄氏菌属(Thauera sp.)等和能将亚硫酸盐和硫酸盐利用的脱硫菌属(Desulfomicrobium sp.)和脱硫螺旋藻(Desulfurispirillum indicum)一起将亚硒酸盐和硒酸盐作为呼吸链中的电子受体进行还原，其中也包括一些根际微生物(根瘤菌，假单胞菌属菌种和巴西假单胞菌)。这些微生物都可以将有毒的亚硒酸盐或硒酸盐转化成不溶的零价纳米硒。
益生菌有益的健康特性和通过参与食品发酵生产有益的生物分子不断鼓励人们尤其在传统食品中寻找新型的益生菌。益生菌最重要特点是耐酸性和胆汁、通过肠道的存活率高、肠道的粘附和定植能力强、在宿主中的作用持久。乳酸菌是益生菌的主要来源，并已在生产发酵食品和饮料生产等食品工艺中应用。此外，许多报告也显示乳酸菌作为益生菌对人类和动物有很多的有益作用，例如抗菌性、免疫调节、抗癌基因、止泻、抗过敏和抗氧化活性。与许多微生物吸收和转化硒离子的能力相似，在适当的条件下，一些乳酸菌能够积累大量的微量元素，例如硒、锌和铜，并将其掺入有机化合物中。乳酸菌菌株已被用于将无机硒进行生物富集和生物转化为有机硒和纳米硒。大量的体外和体内研究已经证明了这种富含硒的乳酸菌对健康有益的作用。目前国内外主要通过将无机硒盐添加到乳酸菌生长的培养基中，在乳酸菌生长过程中将硒盐转化为纳米硒，但存在发酵液成分复杂影响后续纳米硒的分离纯化等问题。
发明内容
为了解决上述现有技术的问题，本发明提供一株富硒植物乳植杆菌KD-2及其在发酵乳和奶粉中的应用，植物乳植杆菌KD-2在缓冲液条件下能还原亚硒酸钠制备得到纳米硒，不需要在培养基中进行，还可以将该菌株用于制备富硒益生菌发酵乳、制备富硒益生菌和纳米硒，并将富硒益生菌和纳米硒应用于奶粉中。
本发明通过以下技术方案实现：
一株植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)KD-2，该菌株已于2023年4月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2023478。
一种富硒植物乳植杆菌KD-2的制备方法，将植物乳植杆菌KD-2菌株接种至培养基中，进行活化培养，活化培养后接种至MRS肉汤培养基中，置于培养箱中培养，当植物乳植杆菌KD-2菌株生长达到对数期后，离心，取菌泥加入磷酸缓冲液，再添加亚硒酸钠溶液，得到菌悬液，置于培养箱中转化，得到转化液；将转化液离心分离，收集沉淀，用生理盐水洗涤，再次离心，得到富硒植物乳植杆菌KD-2；其中，所述植物乳植杆菌KD-2菌株为权利要求1所述的植物乳植杆菌KD-2菌株。
优选的，所述菌悬液中亚硒酸钠浓度为100-200μg/mL，植物乳植杆菌KD-2浓度为0.033-0.067mg/mL，所述菌悬液pH为6.66-7.34。
优选的，转化温度为35-39℃，转化时间为44h-51h。
一株采用所述的制备方法得到的富硒植物乳植杆菌KD-2。
一种益生菌奶粉，包含奶粉和所述的富硒植物乳植杆菌KD-2。
一种采用植物乳植杆菌KD-2菌株转化亚硒酸钠制备纳米硒的方法，从转化液中提取得到纳米硒；所述转化液为采用权利要求2-4任一项所述的制备方法制备得到。
优选的，从转化液中提取得到纳米硒，具体是：将转化液离心，收集沉淀，得到富纳米硒植物乳植杆菌KD-2；将富纳米硒植物乳植杆菌KD-2加入磷酸缓冲液中，并加入溶菌酶，静置酶解，然后超声破碎，洗涤后的沉淀加入无菌水和1-辛醇，重悬后离心，静置后收集沉淀并洗涤，冻干，得到纳米硒。
一种富硒植物乳植杆菌发酵乳的制备方法，取奶粉，加水，灭菌，加入发酵剂、植物乳植杆菌KD-2菌株和亚硒酸钠，进行发酵培养，得到富硒植物乳植杆菌发酵乳；其中，所述植物乳植杆菌KD-2菌株为权利要求1所述的植物乳植杆菌KD-2菌株。
一种采用所述的制备方法得到的富硒植物乳植杆菌发酵乳。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明植物乳植杆菌KD-2能利用菌体细胞转化亚硒酸钠制备纳米硒，不需要在培养基中进行，其转化液成分简单，单位菌体富硒能力强，获得了富硒植物乳植杆菌，将其离心后添加保护剂通过冷冻干燥制备了植物乳植杆菌纳米硒粉，还将离心获得的富含纳米硒的植物乳植杆菌菌泥经酶解、破壁、分离制备得到了纳米硒。本发明植物乳植杆菌KD-2可以用于制备富硒发酵乳，能加快发酵，缩短发酵时间，且植物乳植杆菌KD-2和纳米硒的存在明显改善了发酵乳质构特性，还可将植物乳植杆菌纳米硒粉和纳米硒添加到奶粉中，提高了奶粉的抗氧化性且贮存过程中保持稳定。
附图说明
图1为植物乳植杆菌KD-2的系统发育树；
图2为富硒植物乳植杆菌KD-2制备时不同时间的影响；
图3为富硒植物乳植杆菌KD-2制备时不同温度的影响；
图4为富硒植物乳植杆菌KD-2制备时不同pH的影响；
图5为富硒植物乳植杆菌KD-2制备时不同亚硒酸钠浓度的影响；
图6为植物乳植杆菌KD-2KD-2添加量对富硒植物乳植杆菌KD-2制备的影响；
图7为植物乳植杆菌KD-2在转化前后的SEM图：(a)为转化前的菌株SEM图、(b)为转化后的菌株SEM图、(c)为小颗粒的EDX分析图谱；
图8为pH、时间和植物乳植杆菌KD-2添加量对亚硒酸钠转化率的影响；
图9为pH、时间和菌的添加量对单位菌体硒含量的影响；
图10为pH、时间和菌的添加量对a*红色值的影响；
图11为植物乳植杆菌KD-2转化制备的纳米硒冻干粉末；
图12为纳米硒的TEM图；
图13为植物乳植杆菌KD-2制备的纳米硒表征分析：(a)XPS总谱和(b)Se3d图谱；
图14为植物乳植杆菌KD-2制备的纳米硒的IR图；
图15为发酵时间对含纳米硒发酵乳的影响：(a)为pH、(b)为酸度、(c)为感官评价；
图16为发酵时间对含纳米硒发酵乳的影响：(a)为硬度、(b)为稠度、(c)为粘度、(d)为粘度指数。
图17为纳米硒奶粉贮存过程中的抗氧化性变化：(a)为羊奶粉、(b)为牛奶粉。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行描述，这些描述只是进一步解释本发明的特征和优点，并非用于限制本发明的权利要求。
实施例1本发明植物乳植杆菌KD-2的分离及鉴定
1、植物乳植杆菌KD-2分离
将市售开菲尔粒按5％接种于已灭菌冷却的羊乳中，室温发酵24h后以其为样品，采用平板分离法(平板中添加亚硒酸钠)，从中筛选出富硒的乳酸菌60株，又经反复初筛和复筛，获得一株产纳米硒能力强的乳酸菌。
2、植物乳植杆菌KD-2的鉴定
采用16S rDNA对菌株进行菌种鉴定。对目的片段进行扩增和纯化后，根据16SrDNA部分基因片段的同源性分析对这菌株进行表征，将测得序列与NCBI数据库中的碱基序列进行比对和分析，构建菌株的系统发育树，如图1所示，其碱基对序列如下：
GGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTACTCTCGCGAGTTCGCAACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACCAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTGATAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTATCCATGTCCCCGAAGGGAACGTCTAATCTCTTAGATTTGCATAGTATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCATTCATCGTTTACGGTATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACCCATACTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCACTTCTTCGGTTGAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCAATACCTGAACAGTTACTCTCAGATATGTTCTTCTTTAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCATGGTGAGCCGTTACCCCACCATCTAGCTAATACGCCGCGGGACCATCCAAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTCAAGCTCGGACCATGCGGTCCAAGTTGTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAGGTGTTATCCCCCGCTTCTGGGCAGGTTTCCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCAC
从图1中可以看出，菌株与Lactobacillus plantarum strain HBUAS52455的同源性达到了100％，说明菌株为植物乳植杆菌，命名为植物乳植杆菌KD-2，该植物乳植杆菌KD-2菌株已于2023年4月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2023478。
实施例2富硒植物乳植杆菌KD-2的制备
将植物乳植杆菌KD-2在MRS肉汤培养基中进行活化培养，连续活化三代后，以5％(v/v)的接种量接种在MRS肉汤培养基中，置于培养箱中37℃培养24h，当植物乳植杆菌KD-2菌株生长达到对数期后，取一定量的菌悬液进行离心分离，得到菌泥，并用磷酸缓冲液(pH＝6.4)进行洗涤，洗涤之后所得沉淀加入磷酸缓冲液，得到菌悬液，向菌悬液中加入亚硒酸钠溶液，使其终浓度为100μg/mL，之后置于37℃培养箱中转化24h。
观察所得培养液的颜色为红色，说明培养液中产生了纳米单质硒，即上述植物乳植杆菌KD-2能在没有培养基的条件下利用菌体细胞将亚硒酸钠转化为纳米硒。菌株的亚硒酸钠转化率为86.23％，单位菌体纳米硒的含量为1.13mg/g。
实施例3植物乳植杆菌KD-2制备纳米硒的工艺优化
1、时间对植物乳植杆菌KD-2制备纳米硒的影响
将植物乳植杆菌KD-2在MRS肉汤培养基中培养24h，离心，所得菌泥洗涤，然后加入磷酸缓冲液、亚硒酸钠溶液，得到菌悬液，菌悬液的菌泥浓度为0.05g/mL、pH为6.4，亚硒酸钠的浓度为100μg/mL，菌悬液在37℃下恒温转化不同时间(12、24、36、48和60h)，测定亚硒酸钠还原率和培养液红色值a*，结果如图2所示。
由图2可以看出随着时间的增加，亚硒酸钠的转化率逐渐增加，在48h后达到85.83％后，亚硒酸钠的转化率随着时间的增加变化逐渐平缓。这是因为在菌体中的还原酶逐渐将亚硒酸盐还原成纳米硒，且随着时间的增加，菌体的活性逐渐降低导致还原酶的作用达到最大，所以当时间达到48h后，亚硒酸钠转化率基本不变。菌悬液的红色值a*与亚硒酸钠的转化率基本上保持一致，也是在48小时达到22.16后变化缓慢。
2、温度对植物乳植杆菌KD-2制备纳米硒的影响
调整转化温度分别为33℃、35℃、37℃、39℃和41℃，转化时间为48h，分析温度对植物乳植杆菌KD-2转化制备纳米硒的影响，结果如图4所示。
从图3中可知，亚硒酸钠的转化率随着温度的增加，先增大后减小，当温度达到37℃时，亚硒酸钠的转化率达到最大为86.10％。这是因为随着温度的增加，菌体中的还原酶逐渐达到最适温度导致亚硒酸钠的还原能力达到最大，当温度过高时，导致菌体的活性降低，因此亚硒酸的转化率降低。菌悬液的a*红色值变化和亚硒酸钠的转化率变化较为一致，当温度为37℃时，a*红色值达到最大为22.64，说明35-39℃是植物乳植杆菌KD-2转化制备纳米硒的适宜温度。
3、pH对植物乳植杆菌KD-2制备纳米硒的影响
调整菌悬液的pH值分别为5.6、6.3、7、7.7、8.4，在37℃恒温转化48h，分析pH值对制备纳米硒的影响，结果如图4所示。
由图4可知，亚硒酸钠的转化率随着pH值的增加先增大后减小，当pH值达到7时，亚硒酸钠的转化率最大达到54.13％。当pH值在弱酸性5.6和弱碱性8.4时，亚硒酸钠的转化率相对较低分别为64.59％和60.24％，说明植物乳植杆菌KD-2更适合在中性条件下对亚硒酸钠进行还原。a*红色值的变化同样也在pH为7时达到最大为18.17。因此后续选取pH值7.0进一步优化转化工艺参数。
4、亚硒酸钠浓度对植物乳植杆菌KD-2制备纳米硒的影响
调整菌悬液中亚硒酸钠的浓度，使其分别为50、100、150、200和250μg/mL，然后在37℃恒温转化48h，分析亚硒酸钠的浓度对制备纳米硒的影响，结果如图5所示。
由图5可以看出，亚硒酸钠的转化率随着亚硒酸钠的浓度先增大后减少，当亚硒酸钠的浓度为100μg/mL时，亚硒酸钠的转化率达到最大为87.1％，当亚硒酸钠的浓度大于100μg/mL后，亚硒酸钠的转化率逐渐降低，这主要是因为亚硒酸盐的还原主要由菌体中的相关还原酶进行作用，当亚硒酸钠过多时，菌体对亚硒酸钠转化达到饱和，且亚硒酸钠会抑制菌体的活性，使相关酶作用活性降低。a*红色值在亚硒酸钠的浓度为100-250μg/mL是的变化较为平缓分别为22.04、22.02、21.94和21.78，说明因此植物乳植杆菌KD-2对亚硒酸钠的转化能力不会因为亚硒酸钠的增多而增强。因此，选择转化率≥70％且a*红色值≥20作为适宜的指标，对应的亚硒酸钠浓度为100-200μg/mL作为植物乳植杆菌KD-2转化制备纳米硒的适宜浓度。
5、植物乳植杆菌KD-2添加量对纳米硒制备的影响
调整菌悬液中植物乳植杆菌KD-2的添加量分别为0.02、0.03、0.04、0.05和0.06g/mL，亚硒酸钠浓度为100μg/mL，菌悬液pH值为7，在37℃恒温转化48h，分析植物乳植杆菌KD-2的添加量对制备纳米硒的影响，结果如图6所示。
由图6可知，随着植物乳植杆菌KD-2添加量的逐渐增加，亚硒酸钠的还原转化率逐渐增大，且当植物乳植杆菌KD-2的添加量达到0.06g/mL时，亚硒酸钠的转化率达到了最大为88.44％。说明当亚硒酸钠的浓度一定时，菌的添加量越多，菌的还原能力越强。由a*红色值可以看出，当菌的添加量为0.05g/mL和0.06g/mL时a*红色值达到22.35和22.14，说明菌的添加量为0.05和0.06g/mL时，菌悬液的红色程度无显著性差异，考虑到经济实用性，后续选取植物乳植杆菌KD-2添加量为0.05g/mL进一步优化。
6、响应面法优化富硒植物乳植杆菌KD-2制备条件
根据单因素结果可知，反应时间、温度、pH值、亚硒酸钠的浓度和菌的添加量的改变均会对植物乳植杆菌KD-2制备纳米硒的过程产生不同的影响，其中时间和植物乳植杆菌KD-2添加量的改变对亚硒酸钠转化率的影响较大，pH和温度次之，亚硒酸钠添加量影响最小，因此选取转化时间、植物乳植杆菌KD-2添加量和pH为变量，以亚硒酸钠转化率(％)、单位菌体纳米硒的含量(mg/g)和a*红色值为响应值，采用3因素5水平的中心组合试验设计优化制备纳米硒的工艺参数，其因素水平和试验设计及结果如表1和2所示：
表1中心组合试验优化富硒植物乳植杆菌KD-2制备的因素水平表
表2中心组合试验优化富硒植物乳植杆菌KD-2制备的试验设计及结果
根据表1的试验结果构建了回归方程如下：
R1＝96.4+0.021A+3.88B-0.33C+1.58AB-0.58AC-0.14BC-3.01A2-3.01B2-0.53C2
R2＝1238.06-7.72A-5.63B-10.17C+17.06AB-24.37AC+0.84BC-92.4A2-100.33B2+93.17C2
R3＝27.24-0.028A+0.17B-0.22C-0.084AB-0.46AC-0.069BC-1.52A2-1.34B2-1.10C2
在方程中，R1、R2和R3分别为亚硒酸钠转化率、单位菌体纳米硒的含量和a*红色值的预测值。A、B和C分别代表时间、植物乳植杆菌KD-2添加量和pH。
pH、时间和植物乳植杆菌KD-2添加量对转化率、单位菌体纳米硒的含量和a*红色值的影响的等高线和三维响应面图见图8、图9和图10。
结合前面的单因素试验和表2可知，在亚硒酸钠添加量为100-200μg/mL，植物乳植杆菌KD-2添加量为0.033-0.067mg/mL，pH为6.66-7.34，转化温度35-39℃，转化时间为44h-51h时，其转化率为82.17％-98.07％，单位菌体纳米硒含量为0.890mg/g-1.322mg/g，a*红色值为21.53-28.69。
通过对回归方程分析后，得到了富硒植物乳植杆菌KD-2制备转化条件的最佳工艺参数的预测值。预测的到的最佳工艺条件pH值6.98，菌泥的添加量0.052g/mL，转化时间48h，且在该条件下，转化率97.07％，单位菌体硒含量1.23mg/g，a*红色值28.69。便于实验操作将pH值调整为7，并进行验证实验，在该条件下转换率达到了(96.57±1.24％)，单位菌体硒含量为(1.21±0.15)mg/g，a*红色值为(27.32±0.105)实际值与预测值非常接近，表明采用组合试验设计对植物乳植杆菌KD-2制备纳米硒的工艺优化是可行的。
Calomme等人研究了L.plantarum,L.delbrueckii ssp bulgaricus和L.caseissp这3株菌在富含1mg/L Na2SeO3的培养基中培养后，这三株菌的细胞中的硒含量分别为0.375、0.253和0.407mg/g，低于植物乳植杆菌KD-2在最适工艺条件下得到的单位菌体硒的含量1.21mg/g，这主要是因为本实验中的植物乳植杆菌KD-2是在培养基中生长到对数期菌体不再生长后，直接收集菌体进行生物转化制备纳米硒，此时菌体中酶的活性较高，且菌体受到亚硒酸钠的抑制作用较小，因此将亚硒酸钠还原的量多。这也说明生长好后的菌体直接生物转化还原亚硒酸钠比在含有培养基中边生长边还原亚硒酸钠的效率更高。
实施例4富硒植物乳植杆菌KD-2粉
以实施例3中得到的转化液为原料，对其冷冻离心(离心条件为12000r/min，4℃，15min)，获得富硒植物乳植杆菌KD-2沉淀，将其用0.85％生理盐水洗涤沉淀，以去除沉淀中的亚硒酸钠，再次离心获得富硒植物乳植杆菌KD-2沉淀，根据沉淀重量，按每kg沉淀加入40g谷氨酸钠、25g抗坏血酸钠、30％的脱脂乳1L、250mL磷酸缓冲液和4滴吐温80，然后用漩涡混合仪混合均匀，再将其置于冻干盘，装样高度为0.5cm，放入-35℃环境中预冻5h，然后再-55℃真空度5pa冻干24h获得富硒植物乳植杆菌KD-2粉，其活菌数为1.22×1011CFU/g，通过加速试验测定了富硒植物乳植杆菌KD-2粉中植物乳植杆菌KD-2的失活速度常数为1.82×10-6，说明其活性稳定。
图7为植物乳杆菌KD-2和富硒植物乳植杆菌KD-2粉的扫描电镜照片，从图(a)中可知，没有添加亚硒酸钠的植物乳植杆菌KD-2菌粉为圆滑的短棒状，其将亚硒酸钠还原后，菌体表面出现内陷皱缩外翻，周围出现圆形的纳米级的小颗粒。对图(b)中的小颗粒进行X射线能谱分析得到图(c)，发现在1.4KeV附近，出现了硒的特征峰，证实了植物乳植杆菌KD-2还原亚硒酸盐产生了纳米硒，且分布在细胞质和细胞外的空间。
实施例5纳米硒的分离提取与表征
1、纳米硒的提取
以最优工艺条件下的植物乳植杆菌KD-2培养液为原料，在4℃下，以10000r/min的速率离心10min，得到沉淀物质，向沉淀物质加入pH为7.0的PBS，加入100μL浓度为100mg/mL溶菌酶静止3h，然后进行超声破碎20min，采用含1％十二烷基磺酸钠的Tris/HCL(pH为7.0)进行洗涤，10000r/min离心10min，所得沉淀重悬于无菌水中，加入1-辛醇，20000r/min离心5min，放入4℃冰箱中静置24h，然后弃去上层细胞碎片悬浮液，将底部纳米硒沉淀用氯仿、无水乙醇、70％乙醇和无菌水先后洗涤，最后预冻3h后进行冷冻冻干30h，得到纳米硒粉末(图11)。
2、纳米硒的透射电镜(TEM)分析
图12为植物乳植杆菌KD-2制备的纳米硒的透射电镜照片，由图12可知植物乳植杆菌KD-2转化制备的纳米硒粒径在80.31-190nm之间。
3、纳米硒的X射线光电子能谱(XPS)分析
利用XPS对植物乳植杆菌KD-2转化得到的纳米硒表面组成的化学元素的价态进行分析，从图13(a)可以看出，在纳米硒表面存在C、O、N、P、S等元素，且这些峰的强度比硒的强，说明纳米硒表面存在一些生物大分子，这些生物大分子将纳米硒包裹起来。可以从图13(b)中看出在55e V附近有零价硒的特征峰，证明是纳米硒的表面存在零价硒。
4、纳米硒的傅里叶红外光谱(FT-IR)分析
对纳米硒粉末进行傅里叶红外光谱分析，FT-IR光谱分析可以表明在纳米硒表面上存在的官能团。从图14中可知，在3233cm-1处的峰对应组成多糖和蛋白质残基中的O-H和N-H的伸缩振动。在1643cm-1和1289cm-1处的峰是蛋白质的酰胺I带和酰胺III带，属于酰胺键的羧基和C-N伸缩振动是典型的蛋白带。1097cm-1处的峰归属于C-O伸缩震动引起的。这些数据表明由植物乳植杆菌KD-2合成提取的纳米硒可能被蛋白质和多糖包裹。
实施例6富硒植物乳植杆菌KD-2发酵羊乳
按1：7(w/v)的比例，将羊奶粉加水配成复原乳并灭菌，分成三组进行试验，第一组加入0.05％(w/v)的直投式发酵剂TW作为对照，第二组加入0.05％(w/v)直投式发酵剂TW和亚硒酸钠(7μg/mL)，第三组加入0.03％(w/v)的直投式发酵剂TW、0.02％(w/v)植物乳植杆菌KD-2冻干菌粉和亚硒酸钠(7μg/mL)，然后于42℃恒温培养不同时间(3、4、5、6、7h)，再冷藏后熟12h，之后测定得到的益生菌发酵乳的pH值、酸度、硬度、粘度、稠度及粘性指数，结果如图15-图16所示。
由图15可以看出，添加植物乳植杆菌KD-2可显著加速TW发酵，发酵5h其pH均低于4.50，而对照需要7h pH才能达到4.50。
由图16可知，添加硒、植物乳植杆菌KD-2后，发酵乳的酸硬度、稠度、粘度和粘性指数有了明显的差别，可显著改善发酵乳的质构特性，说明利用植物乳植杆菌KD-2开发含富硒植物乳植杆菌KD-2发酵乳是可行的。
实施例7纳米硒植物乳植杆菌KD-2奶粉
将实施例4中制备的纳米硒植物乳植杆菌KD-2粉通过等量递增和干混法按表3添加到奶粉(牛奶粉、山羊奶粉、绵羊奶粉和骆驼奶粉)中，制备了纳米硒植物乳杆菌KD-2系列奶粉，其活菌数均高于1.0×106CFU/g，DPPH自由基清除率和亚铁离子螯合率均高于70％。
表3纳米硒植物乳杆菌KD-2奶粉活菌数及抗氧化性
实施例8纳米硒奶粉
将实施例5中制备的纳米硒按每升15μg-25μg的添加量添加到乳(牛奶、山羊奶和绵羊奶)中，经浓缩至固形物45％，再通过喷雾干燥，制备了纳米硒奶粉(见表4)。
表4纳米硒奶粉的抗氧化性
奶粉中纳米硒含量为120μg-200μg/kg，其具有抗氧化性，DPPH自由基清除率高于65％，亚铁离子螯合率高于65％，贮存5周后DPPH自由基清除率和螯合铁离子能力仍高于65％和60％，如图17。
Claims (10)
1.一株植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)KD-2，其特征在于该菌株已于2023年4月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2023478。
2.一种富硒植物乳植杆菌KD-2的制备方法，其特征在于，将植物乳植杆菌KD-2菌株接种至培养基中，进行活化培养，活化培养后接种至MRS肉汤培养基中，置于培养箱中培养，当植物乳植杆菌KD-2菌株生长达到对数期后，离心，取菌泥加入磷酸缓冲液，再添加亚硒酸钠溶液，得到菌悬液，置于培养箱中转化，得到转化液；将转化液离心分离，收集沉淀，用生理盐水洗涤，再次离心，得到富硒植物乳植杆菌KD-2；其中，所述植物乳植杆菌KD-2菌株为权利要求1所述的植物乳植杆菌KD-2菌株。
3.根据权利要求2所述的富硒植物乳植杆菌KD-2的制备方法，其特征在于，所述菌悬液中亚硒酸钠浓度为100-200μg/mL，植物乳植杆菌KD-2浓度为0.033-0.067mg/mL，所述菌悬液pH为6.66-7.34。
4.根据权利要求2所述的富硒植物乳植杆菌KD-2的制备方法，其特征在于，转化温度为35-39℃，转化时间为44h-51h。
5.一株采用权利要求2-4任一项所述的制备方法得到的富硒植物乳植杆菌KD-2。
6.一种益生菌奶粉，其特征在于，包含奶粉和权利要求5所述的富硒植物乳植杆菌KD-2。
7.一种采用植物乳植杆菌KD-2菌株转化亚硒酸钠制备纳米硒的方法，其特征在于，从转化液中提取得到纳米硒；所述转化液为采用权利要求2-4任一项所述的制备方法制备得到。
8.根据权利要求7所述的采用植物乳植杆菌KD-2菌株转化亚硒酸钠制备纳米硒的方法，其特征在于，从转化液中提取得到纳米硒，具体是：将转化液离心，收集沉淀，得到富纳米硒植物乳植杆菌KD-2；将富纳米硒植物乳植杆菌KD-2加入磷酸缓冲液中，并加入溶菌酶，静置酶解，然后超声破碎，洗涤后的沉淀加入无菌水和1-辛醇，重悬后离心，静置后收集沉淀并洗涤，冻干，得到纳米硒。
9.一种富硒植物乳植杆菌发酵乳的制备方法，其特征在于，取奶粉，加水，灭菌，加入发酵剂、植物乳植杆菌KD-2菌株和亚硒酸钠，进行发酵培养，得到富硒植物乳植杆菌发酵乳；其中，所述植物乳植杆菌KD-2菌株为权利要求1所述的植物乳植杆菌KD-2菌株。
10.一种采用权利要求9所述的制备方法得到的富硒植物乳植杆菌发酵乳。
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