CN104774875B - 一种利用水生拉恩氏菌制备生物纳米硒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用水生拉恩氏菌制备生物纳米硒的方法，属于微生物应用与纳米硒合成领域。本发明的方法是以硒酸盐或亚硒酸盐为原料，以水生拉恩氏菌为发酵菌，收集发酵培养液，分离并纯化得到纳米硒。本发明方法清洁无毒，环保高效，合成的纳米硒性质稳定，杂质少，粒径均一，分散度好，可用于生产富硒产品。本发明方法弥补传统方法生产纳米硒及富硒产品方式的不足，从而达到环保高效的效果，可广泛应用于富硒产品的开发等领域，具有较好的经济效益和社会效益。

Description

一种利用水生拉恩氏菌制备生物纳米硒的方法

技术领域

本发明涉及属于微生物应用与纳米硒合成领域，具体地，涉及利用水生拉恩氏菌制备生物纳米硒的方法。

背景技术

硒(Se)是动物和人类所必需的一种微量元素，与人体内抗氧化功能，甲状腺激素代谢，和免疫系统等密不可分。缺硒会造成人类肌肉萎缩，心血管、骨骼或免疫系统疾病，增加癌症的风险，但过量硒也会对人体产生毒害。然而，在我国硒的分布极不均匀，缺硒地区占有相当大的比例，迫切需要解决。目前，通过补食植物富硒产品的应用最为广泛，其生产主要是依靠施用硒肥补充硒盐，但硒盐具有较高的毒性，会对环境带来潜在风险。

据研究纳米材料可表现出新的特征，比如表面活性高，比表面积大，活性位点多，及较高的催化效率等，应用范围广泛。而纳米硒作为一种有益的低毒元素逐渐成为研究热点，用纳米硒作为抗氧化剂可以降低硒毒害风险，纳米硒颗粒与C＝O，COO和C-N组蛋白结合时会表现出重要的生物活性，可用于生物、化学、医药等领域，比如可以生产硒-维生素、食品添加剂、新型抗生素衣料，纳米硒医用材料以及在防治癌症方面的应用等。纳米硒还能够抑制人类乳腺癌细胞(MCF-7)的生长以及致病菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的生长。并且纳米硒具有很好地光电学和半导体特性，已广泛应用于太阳能电池、整流器、传感器，静电复印等光电元件。所以纳米硒在工业、保健品产业及富硒农作物产业中具有极大地应用潜力。

纳米硒通常通过化学反应，结晶技术，反向胶束法等技术生成，但这些技术会受到高温、高压、催化剂等条件限制，而且会对环境造成危害，生产的纳米硒性质也不稳定。进而需要一种清洁，无毒，环保的方法来生产稳定的纳米硒。

细菌对硒在自然界中的循环发挥着重要作用，尤其是根际促生菌(PGPR)可促进植物对硒的吸收。已发现许多细菌如如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、深红红螺菌(Rhodospirillum Molisch)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)等可将氧化态硒还原为无毒高效的红色纳米硒，而且这种纳米硒性质稳定，活性高。由于细菌具有生长迅速、繁殖快、代谢能力强、适应性强等特点，所以利用微生物转化硒不受季节和气候的影响，生产周期短，故利用细菌合成生物纳米硒被认为是一种高效硒的生物转化和降低环境风险的解决方式之一。其中水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)HX2具有很好的溶解磷作用，产生植物促生物质IAA和PQQ，同时能够产生植物抗菌物质，对植物具有防病促生效果，目前还未见利用水生拉恩氏菌合成生物纳米硒的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物纳米硒的制备方法。

本发明的另一个目的在于提供水生拉恩氏菌在制备生物纳米硒中的用途。

本发明的生物纳米硒的制备方法，是以硒酸盐或亚硒酸盐为原料，以水生拉恩氏菌为发酵菌，发酵生产生物纳米硒。

本发明的生物纳米硒的制备方法，包括以下步骤：

(1)活化的水生拉恩氏菌接种于LB液体培养基中，加入硒酸盐溶液；

(2)振荡培养。

本发明的生物纳米硒的制备方法，还包括步骤(3)收集培养液，离心，冲洗沉淀，向沉淀中加入氢氧化钠溶液，沸水浴，静置至室温，再加入正己烷溶液，静置分层后取下层的红色溶剂相。

其中步骤(3)中，离心条件为8000-12000r/min，离心5-15min；向沉淀中加入1N氢氧化钠溶液，沸水浴15-25min，再加入总溶液1/2体积的正己烷，搅拌均匀，静置分层后取下层的红色溶剂相。

优选地，离心条件为10000r/min，离心10min；沸水浴20min。

本发明的上述方法，还包括步骤(4)用盐酸调红色溶剂相pH值7.5-7.0，离心去上清，重复操作多次后，将沉淀悬浮于去离子水中，得到生物纳米硒悬浮液。

优选地，步骤(4)用盐酸调红色溶剂相pH值7.2。

进一步地，步骤(4)中，盐酸浓度为6M，离心条件为8000-12000r/min，30min。

进一步地，本发明的生物纳米硒制备方法中，步骤(1)的硒酸盐为硒酸钠或亚硒酸盐为亚硒酸钠；当为硒酸钠时，其在LB液体培养基中的终浓度为50-575mM；当为亚硒酸钠时，其在LB液体培养基中的终浓度为5-75mM。

更进一步地，当为硒酸钠时，其在LB液体培养基中的终浓度为80mM；当为亚硒酸钠时，其在LB液体培养基中的终浓度为15mM。

优选地，本发明方法中所用的水生拉恩氏菌为保藏编号为CGMCC No.1896的水生拉恩氏菌HX2。该菌已于2006年12月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，邮编100101)保藏，分类命名为水生拉恩氏菌Rahnella aquatilis。

本发明的方法中，步骤(2)振荡培养的条件为26-28℃，160-200r/min，培养72-96h。

优选地，步骤(2)振荡培养的条件为28℃，180r/min，培养72-96h。

本发明还提供了水生拉恩氏菌在制备生物纳米硒中的应用。

本发明制备生物纳米硒的方法清洁无毒，环保高效，合成的纳米硒性质稳定，杂质少，粒径均一，分散度好，可用于生产富硒产品。本发明方法弥补传统方法生产纳米硒及富硒产品方式的不足，从而达到环保高效的效果，可广泛应用于富硒产品的开发等领域，同时该生物纳米硒在工业、保健品产业应用潜力巨大，具有较好的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为不同浓度亚硒酸钠对水生拉恩氏菌HX2菌的影响图。

图2为不同浓度硒酸钠对水生拉恩氏菌HX2菌的影响；

图3为添加15mM亚硒酸钠所得纳米硒与水生拉恩氏菌混合液检测图，其中图3A为环境扫描电子显微镜(ESEM)照片，图3B为透射电子显微镜(TEM)照片，图3C为纳米硒能谱(EDX)分析图，箭头所指为纳米硒颗粒分析；

图4为添加200mM硒酸钠所得纳米硒与水生拉恩氏菌混合液检测图，其中图4A为环境扫描电子显微镜(ESEM)照片，图4B为透射电子显微镜(TEM)照片，图4C为纳米硒能谱(EDX)分析图，箭头所指为纳米硒颗粒分析；

图5为分离纯化所得生物纳米硒颗粒透射电子显微镜(TEM)照片；

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 水生拉恩氏菌对亚硒酸钠(Na₂SeO₃)的耐受实验

1、LB液体培养基为：NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，去离子水1L，121℃高压灭菌20min。

LB固体培养基：NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，琼脂粉15g，去离子水1L，分装至100mL的三角瓶中(25mL/瓶)，121℃高压灭菌20min。

分别向上述高压灭菌后的LB固体培养基中加入提前过滤除菌的1M的亚硒酸钠母液配制成以下浓度0mM(CK)、60mM、70mM、75mM、85mM、95mM、105mM、115mM的含亚硒酸钠的LB培养基。

2、吸取100μL活化好的水生拉恩氏菌HX2菌液(OD₆₀₀＝0.8)，用0.85％的生理盐水梯度稀释，最终得到稀释度分别为10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的菌液待用。

3、分别吸取2.5μL上述梯度(10^-3、10^-4、10^-5、10^-6)的菌液滴加到含不同硒浓度的平板上，每个梯度重复三次，待菌滴晾干后，将平板倒置于，28℃条件下静置培养96h。

4、结果如图1所示：培养96h后将平板取出观察①颜色：60～115mM的7个处理中，稀释度为10^-3、10^-4、10^-5均有红色菌落长出，当处理浓度高于75mM时，随着处理浓度的增加，红色显著变淡；②单个菌落大小：当处理浓度高于75mM之后，各处理条件下单个菌落的尺寸相对于空白对照CK(不添加亚硒酸钠的LB平板)明显变小；③菌落个数：当稀释度为10^-5时，硒浓度为75mM的处理下的单菌落个数与空白对照CK的菌落个数之间具有显著性差异(p<0.05)。

5、最小抑制浓度的确定：综合上述步骤4中的分析，得到亚硒酸钠对菌株HX2最小抑制浓度为75mM，故利用水生拉恩氏菌HX2生产纳米硒时，需控制亚硒酸钠浓度在75mM以下。此数据与现已报道的菌株如球型红细菌(4.6mM)、罗尔斯通氏菌CH43(6mM)、慢生大豆根瘤菌(12mM)、大肠杆菌(20mM)等的耐亚硒酸钠浓度相比，HX2的耐受能力更强。

实施例2 水生拉恩氏菌对硒酸钠(Na₂SeO₄)的耐受实验

1、制备含硒酸钠浓度分别为0mM(CK)、475mM、500mM、525mM、550mM、575mM、600mM、625mM的LB无菌固体培养基平板。(其中LB固体培养基配法同实施例1，分别加入提前过滤除菌的3M的硒酸钠母液配制成相应浓度硒含量的LB培养基)

2、取100μL活化好的水生拉恩氏菌HX2菌液(OD₆₀₀＝0.8)用0.85％的生理盐水梯度稀释，最终得到稀释度分别为10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的菌液待用。

3、分别吸取2.5uL的上述梯度(10^-3、10^-4、10^-5、10^-6)的菌液滴加到含不同硒浓度的LB平板上，每个梯度重复三次，待菌滴晾干后，将平板倒置，于28℃条件下静置培养96h。

4、结果如图2所示：培养96h后将平板取出观察①颜色：475～625mM的前六个处理中，稀释度为10^-3、10^-4、均有淡红色菌落长出，但当处理浓度高于575mM时，随着处理浓度的增加，红色显著变淡，甚至呈现浅白色；②单个菌落大小：当处理浓度高于575mM之后，各处理条件下单个菌落的尺寸相对于空白对照CK(不添加硒酸钠的LB平板)明显变小；③菌落个数：当稀释度为10^-5时，硒浓度为575mM的处理下的单菌落个数与空白对照CK的菌落个数之间具有显著性差异(p<0.05)。

5)最小抑制浓度的确定：综合上述4)中的分析，得到硒酸钠对菌株HX2最小抑制浓度为575mM，故利用水生拉恩氏菌HX2生产纳米硒时，需控制硒酸钠浓度在575mM以下。可见HX2菌对硒酸钠的耐受程度极高，至今还未有研究其他菌株对硒酸钠的耐受程度的报道。

实施例3 利用水生拉恩氏菌HX2以亚硒酸钠(Na₂SeO₃)为原料生物合成纳米硒

活化水生拉恩氏菌HX2后，转接1％的菌液(OD₆₀₀＝0.8)于灭菌后的含LB液体培养基的锥形瓶中，设3个试验组，加入一定体积已过滤灭菌后的1M Na₂SeO₃母液，保证每个试验组中锥形瓶内Na₂SeO₃终浓度分别为5、15、60、75mM，置于摇床内(28℃，180rpm)，对应的培养时间为96、88、80、72h。

实施例4 利用水生拉恩氏菌HX2以硒酸钠(Na₂SeO₄)为原料生物合成纳米硒

活化水生拉恩氏菌HX2后，转接1％的菌液(OD₆₀₀＝0.8)于灭菌后的含LB液体培养基的锥形瓶中，设4个试验组，再加入一定体积已过滤灭菌后的3M Na₂SeO₄溶液，保证每个试验组中锥形瓶内Na₂SeO₄终浓度分别为50、80、250、550、575mM，然后在摇床内(28℃，180rpm)对应的培养时间为96、90、85、80、72h。

实施例5 细菌与纳米硒形态观察及元素分析

分别将实施例3、4的摇床内培养的9个试验组72-96h后的红色菌液取出，在常温下8000r/min离心10分钟，去上清，用去离子水重悬浮沉淀体，离心冲洗3遍。取约0.25mL沉淀体，加15倍体积的3.5％戊二醛固定液，用0.1M的PPS磷酸缓冲液(pH＝7.2)冲洗，将菌体依次用1％的锇酸固定、酒精梯度脱水。然后置于干燥器(LEICA EM CPD030)中，加热到二氧化碳临界点(31℃，7.4Mpa)，使之气化干燥。再取适量气化干燥后的粉末样品固定于粘有导电胶的金属载物台上。最后在真空镀膜机(Eiko IB-5)内将金喷镀到样品表面后，在环境扫描电子显微镜(ESEM,Phillips XL)下观察。

结果如图3A和4A所示：HX2菌在含亚硒酸钠和硒酸钠的LB培养基中培养72h-96h后会可将两种硒盐还原成规则的球形纳米颗粒，这些颗粒大小集中在100-200nm之间，粒径较均一，且分散度较好，在细菌的胞内、胞外和膜上均有分布。

戊二醛固定液配方：0.2M Na₂HPO₄36mL，0.2M NaH₂PO₄14mL，25％戊二醛溶液16mL，超纯水34mL。

取约1mL的菌与纳米硒的红色混合液，滴加一滴在铜网上，用滤纸吸去多余水分，晾干，在透射电镜下(TEM,Hitachi HT7700,Japan)观察，并利用能谱分析仪(EDX)对元素分析。

结果如图(3B 4B)和图(3C 4C)所示：透射电镜(TEM)下也可以观察到HX2菌还原亚硒酸钠和硒酸钠所形成的球形纳米颗粒。通过EDX能谱分析红色箭头所指的纳米颗粒知硒的特定吸收峰分别出现在1.37，11.22，和12.49keV处，说明HX2菌将亚硒酸钠和硒酸钠还原后形成的纳米颗粒是纳米硒。

实施例6 生物纳米硒的分离与纯化

1、收集实施例3或实施例4培养72h-96h后的菌与纳米硒混合液，10000rpm离心10min，用去离子水冲洗，如此反复离心冲洗三遍后，向收集到的红色沉淀中加入1N NaOH溶液，沸水浴20min，静置至室温。然后再加入液体1/2体积的正己烷溶液，搅拌均匀，静置分层后用分液漏斗得到下层红色溶剂相。

2)用6M的HCl调上述红色液体至pH＝7.2。常温下10000rpm离心30min，去上清。如此反复离心冲洗三遍后悬浮于去离子水内，可得到生物纳米硒悬浮液。

3)取上述2)中1mL溶液，滴加一滴在铜网上，用滤纸吸收多余水分，晾干，在透射电镜下(TEM)观察。

结果如图5所示：可见分离纯化后的生物纳米硒所含杂质较少，粒径较均一，分散度也很好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种利用水生拉恩氏菌制备生物纳米硒的方法，其特征在于，以硒酸盐或亚硒酸盐为原料，以水生拉恩氏菌为发酵菌，发酵生产生物纳米硒；

其中，所述水生拉恩氏菌为保藏编号为CGMCC No.1896的水生拉恩氏菌HX2。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)活化的水生拉恩氏菌接种于LB液体培养基中，加入硒酸盐或亚硒酸盐溶液；

(2)振荡培养。

3.如权利要求2所述的方法，还包括步骤(3)收集培养液，离心，冲洗沉淀，向沉淀中加入氢氧化钠溶液，沸水浴，静置至室温，再加入正己烷溶液，静置分层后取下层的红色溶剂相。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，离心条件为8000-12000r/min，离心5-15min；向沉淀中加入1N氢氧化钠溶液，沸水浴15-25min，再加入总溶液1/2体积的正己烷，搅拌均匀，静置分层后取下层的红色溶剂相。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括步骤(4)用盐酸调红色溶剂相pH值7.0-7.5，离心去上清，重复操作多次后，将沉淀悬浮于去离子水中，得到生物纳米硒悬浮液。

6.如权利要求2-5任一所述的方法，其特征在于，步骤(1)的硒酸盐为硒酸钠，亚硒酸盐为亚硒酸钠；当为硒酸钠时，其在LB液体培养基中的终浓度为50-575mM；当为亚硒酸钠时，其在LB液体培养基中的终浓度为5-75mM。

7.如权利要求2-5任一所述的方法，其特征在于，步骤(1)的硒酸盐为硒酸钠，亚硒酸盐为亚硒酸钠；当为硒酸钠时，其在LB液体培养基中的终浓度为80mM；当为亚硒酸钠时，其在LB液体培养基中的终浓度为15mM。

8.如权利要求2-5任一所述的方法，其特征在于，步骤(2)振荡培养的条件为26-28℃，160-200r/min，培养72-96h。

9.水生拉恩氏菌在制备生物纳米硒中的应用，其中，所述水生拉恩氏菌为保藏编号为CGMCC No.1896的水生拉恩氏菌HX2。