CN105838740B - 一种茶树内生草螺菌制备纳米红色元素硒的方法 - Google Patents

一种茶树内生草螺菌制备纳米红色元素硒的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105838740B
CN105838740B CN201610285114.4A CN201610285114A CN105838740B CN 105838740 B CN105838740 B CN 105838740B CN 201610285114 A CN201610285114 A CN 201610285114A CN 105838740 B CN105838740 B CN 105838740B
Authority
CN
China
Prior art keywords
selenate
endophytic
tea tree
selenium
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201610285114.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105838740A (zh
Inventor
王行国
徐萧
刘欣
喻雪婧
李亚东
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hubei University
Original Assignee
Hubei University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hubei University filed Critical Hubei University
Priority to CN201610285114.4A priority Critical patent/CN105838740B/zh
Publication of CN105838740A publication Critical patent/CN105838740A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105838740B publication Critical patent/CN105838740B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P3/00—Preparation of elements or inorganic compounds except carbon dioxide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明涉及一种利用茶树内生草螺菌制备纳米红色元素硒的方法。它利用茶树内生草螺菌对硒酸盐具有较强还原活性的生物学特性，直接用硒酸盐与茶树内生草螺菌一起培养，将有毒的硒酸盐还原成无毒的红色元素硒，通过培养时间的控制，可获得高纯度的红色元素硒纳米球或纳米花。本发明的技术方法成本低、操作简单、转化效率高、安全环保。

Description

一种茶树内生草螺菌制备纳米红色元素硒的方法
技术领域
本发明涉及的是生物细胞生产纳米红色元素硒技术，特别是一种应用茶树内生草螺菌转化有毒硒酸盐并结晶生成无毒的纳米红色元素硒的方法。
背景技术
硒是人和动物必需的微量元素之一，与机体的抗氧化能力、免疫功能、抗病毒、抗癌作用等有着重要的关系。与无机硒和有机硒相比，红色纳米硒(零价硒)具有毒性低、生物活性高等特征。鉴于零价硒的低毒性、高效抗氧化、抗癌、中和重金属毒性、高吸收利用率等独特的生物学效应，因此在家养动物生产、医药、保健品方面具有广泛的应用前景；又鉴于红色纳米硒与其它单质硒一样具有纳米粒子的特性，它的高压电热电性能、高光电导率、低熔点以及高化学活性也能在整流器、半导体元件、静电复印技术、激光元件、红外光导材料、光电器件、光电池以及合成硒化物功能纳米材料等方面有着广泛的应用。
目前，纳米级单质硒生产的方法主要有物理法、化学法或物理-化学综合法。使用较多的是化学方法，它需要合适的还原剂和分散剂。还原剂主要有维生素C、亚硫酸钠、肼、硫代硫酸钠等，分散剂主要有PVP、羧甲基纤维素钠、壳聚糖、聚乙烯醇等。单质硒具有多种形态：红色单质硒、灰色单质硒、黑色单质硒以及无定形单质硒,其中红色单质硒毒性最低，且红色单质硒毒性小,对热稳定,通常不转化为灰色或黑色单质硒,被认为是硒生物解毒的方式,在生物活性方面具有较高的应用价值。目前研究发现许多生物能将硒酸盐或亚硒酸盐还原成红色单质硒，但因其效率低尚处在研究阶段。
茶树内生草螺菌是一种茶树共生专一性强的内生细菌。文献“两株茶树内生草螺菌的微生物学特性”(王婷等，微生物学报2014第4期，2014.04.04，P424-432)详细叙述了茶树内生草螺菌的筛选和微生物学特性，但未涉及茶树内生草螺菌的应用。我们利用茶树内生草螺菌与硒酸盐共培养，获得了红色元素硒纳米花结晶，并建立了一种利用茶树内生草螺菌制备纳米红色元素硒的新方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提出一种利用茶树内生草螺菌制备纳米红色元素硒的方法。使用茶树内生草螺菌与硒酸盐共培养，细菌能有效促进硒酸盐还原成红色元素硒，并形成红色元素硒纳米颗粒或纳米花结晶。
一种茶树内生草螺菌制备纳米红色元素硒的方法，以硒酸盐为原料，用微生物将硒酸盐还原为红色硒，其特征在于：所用微生物为茶树内生草螺菌，所述的方法为茶树内生草螺菌直接与硒酸盐共培养或内生草螺菌活化、培养均与硒酸盐共培养或培养中分批次加入硒酸盐。
优选地，如上所述的茶树内生草螺菌直接与硒酸盐共培养的方法为：保存的茶树内生草螺菌菌种接种营养肉汤培养基，每分钟150转摇动，28℃培养过夜，将活化后的菌液以体积比1:100接入含有50-500mM硒酸盐的LB液体培养基中放大培养，摇床转速每分钟100-200转、温度为28-37℃条件下培养6-36小时，即可获得红色元素硒纳米颗粒或纳米花晶体。
优选地，如上所述的内生草螺菌活化、培养均与硒酸盐共培养的方法为：保存的茶树内生草螺菌菌种接种含有50mM硒酸盐的LB液体培养基，每分钟150转摇动，28℃培养过夜培养过夜，将活化后的菌液以体积比1:100接入含有50-500mM硒酸盐的LB液体培养基中放大培养，摇床转速每分钟100-200转、温度为28-37℃条件下培养6-36小时即可获得红色元素硒纳米颗粒或纳米花晶体。
优选地，如上所述的培养中分批次加入硒酸盐的方法为：保存的茶树内生草螺菌菌种接种LB培养基培养过夜，将活化后的菌液以体积比1:100接入含有50-200mM硒酸盐的LB液体培养基中放大培养，摇床转速每分钟100-200转、温度为28-37℃条件下培养3-6小时后,再次加入300-450mM硒酸盐,继续在摇床转速每分钟100-200转、温度为28-37℃条件下培养4-6小时,即可获得红色元素硒纳米颗粒或纳米花晶体。
优选地，如上所述的所述的一种茶树内生草螺菌制备纳米红色元素硒的方法，其特征在于：所述营养肉汤培养基为10g胰蛋白胨，3g牛肉粉，5g NaCl，加水至1000ml，10μg/mL壮观霉素，5μg/mL氨苄青霉素。
优选地，如上所述的所述的一种茶树内生草螺菌制备纳米红色元素硒的方法，其特征在于：所述LB液体培养基为10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，加水至1000ml，10μg/mL壮观霉素，5μg/mL氨苄青霉素。红色无素硒形成的观察:在茶树内生草螺菌与硒酸钠共培养过程中,直接用眼睛观察培养液的颜色变化,培养液的颜色变红说明红色无素硒己生成。
与现有技术相比，本发明具有以下的优点：
1、充分利用了茶树内生草螺菌的生物学特点，茶树内生草螺菌是茶树专一性强的内生细菌，与茶树互惠共生无公害，它能产生多种抗氧化的蛋白和酶如谷胱苷肽、过氧化物酶等活性物质。这些蛋白或酶的存在使该细菌具有强的还原能力,能有效地将硒酸盐还原成红色无素硒。使用茶树内生草螺菌转化硒酸盐或亚硒酸盐制备纳米红色无素硒，转化率高、成本低廉、操作方便、容易纯化、安全环保。
2、使用茶树内生草螺菌转化硒酸盐或亚硒酸盐制备纳米红色无素硒，产品单一，无其它形态单质硒,还可根据培养时间控制纳米红色无素硒的形态。培养6-10小时，红色无素硒骤集形成50-200nm球形或多角形颗粒。培养12小时以后，红色无素硒骤集形成1μm大小的纳米花晶体。
3、可根据需求缩小或放大生产规模。本发明是利用细菌培养制备纳米红色无素硒,因此只需依据细菌培养的方法确定生产规模。既可使用摇瓶、摇床实验室规模制备，也可放大后使用发酵罐大规模制备。
附图说明
图1为本发明实施例1中加入不同浓度的硒酸盐与细菌共培养8小时后培养基的颜色，从左至右依次为空白(LB不含硒酸盐)、硒酸盐在LB中的终浓度分别为100mM、150mM、200mM、300mM、400mM、500mM。
图2为本发明实施例1中培养8小时后红色无素硒骤集形成的纳米球形颗粒。
图3为本发明实施例2中培养7小时后红色无素硒骤集形成的纳米多形态颗粒。
图4为本发明实施例3中培养12小时后红色无素硒骤集形成的纳米花晶体。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但本发明的内容不仅仅局限于实施例所述的范围，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1
(1)取-80℃保存的茶树内生草螺菌菌种，接种5mL营养肉汤培养基(10g胰蛋白胨，3g牛肉粉，5g NaCl，10μg/mL壮观霉素，5μg/mL氨苄青霉素，加水至1000ml)，每分钟150转摇动，28℃培养过夜。
(2)将活化后的菌液以体积比1:100接入新鲜含50-200mM mMNa2SeO4的LB液体培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，10μg/mL壮观霉素，5μg/mL氨苄青霉素，50-200mM Na2SeO4，加水至1000ml，pH7.2-7.4)中放大培养，培养条件为:摇床转速每分钟150转，温度为37℃。培养6-8小时,培养液开始变红，说明红色无素硒己生成，尔后随着培养时间的延长,红色逐渐加深。
(3)红色无素硒纳米颗粒形态检测：取步骤(3)的100μl细菌培养液，与900μl磷酸缓冲液(10mM Na2HPO4、2mM NaH2PO4、pH＝7.4)混合稀释，混均后取20μl稀释液并滴在碳膜型铜网上，室温条件下晾干，然后使用Tecanai G2 20S-TWIN透射电子显微镜观察和拍照。透射电镜观察到红色元素硒聚集成50-100nm大小的球状颗粒(见图1和图2)。
实施例2
(1)将-80℃保存的茶树内生草螺菌菌种直接接入5ml含硒酸盐的LB液体培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，10μg/mL壮观霉素，5μg/mL氨苄青霉素，50mMNa2SeO4,加水至1000ml，pH7.2-7.4)中,每分钟150转摇动，28℃培养过夜。
(2)将活化后的菌液以体积比1:100比例接入新鲜含200mM Na2SeO4的LB液体培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，10μg/mL壮观霉素，5μg/mL氨苄青霉素，200mMNa2SeO4,加水至1000ml，pH7.2-7.4)中放大培养。培养条件为:摇床转速每分钟150转，温度为37℃。培养6-8小时,培养液开始变红，说明红色无素硒己生成，尔后随着培养时间的延长,红色逐渐加深。
(3)红色无素硒纳米颗粒形态检测：取步骤(3)的100μl细菌培养液，与900μl磷酸缓冲液(10mM Na2HPO4、2mM NaH2PO4、pH＝7.4)混合稀释，混均后取20μl稀释液并滴在碳膜型铜网上，室温条件下晾干，然后使用Tecanai G2 20S-TWIN透射电子显微镜观察和拍照。透射电镜观察到红色元素硒聚集成100nm大小的球状颗粒(见图3)。
实施例3
(1)将-80℃保存的茶树内生草螺菌菌种直接接入5ml含硒酸盐的LB液体培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，10μg/mL壮观霉素，5μg/mL氨苄青霉素，50mMNa2SeO4,加水至1000ml，pH7.2-7.4)中,每分钟150转摇动，28℃培养过夜。
(2)直接将活化的细菌以体积比1:100接入新鲜含200mM Na2SeO4LB液体培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，10μg/mL壮观霉素，5μg/mL氨苄青霉素，200mMNa2SeO4,加水至1000ml，pH7.2-7.4)中放大培养。培养条件为:摇床转速每分钟150转，温度为37℃。培养5小时后,再加入200mM Na2SeO4，使硒酸钠的总浓度为400mM。继续在摇床转速每分钟150转、温度为37℃条件下培养8-10小时。
(3)红色无素硒纳米颗粒形态检测：取步骤(2)的100μl细菌培养液，与900μl磷酸缓冲液(10mM Na2HPO4、2mM NaH2PO4、pH＝7.4)混合稀释，混均后取20μl稀释液并滴在碳膜型铜网上，室温条件下晾干，然后使用Tecanai G2 20S-TWIN透射电子显微镜观察和拍照。透射电镜观察到红色元素硒聚集成大小可达1μm的纳米花(见图4)。

Claims (5)

1.一种茶树内生草螺菌制备纳米红色元素硒的方法，以硒酸盐为原料，用微生物将硒酸盐还原为红色硒，其特征在于：所用微生物为茶树内生草螺菌。
2.如权利要求1所述的一种茶树内生草螺菌制备纳米红色元素硒的方法，其特征在于：该方法为茶树内生草螺菌与硒酸盐共培养或茶树内生草螺菌活化、培养时均与硒酸盐共培养或茶树内生草螺菌培养过程中分批次加入硒酸盐。
3.如权利要求2所述的一种茶树内生草螺菌制备纳米红色元素硒的方法，其特征在于：茶树内生草螺菌与硒酸盐共培养的方法为：保存的茶树内生草螺菌菌种接种营养肉汤培养基培养过夜，将活化后的菌液以体积比1:100接入含有50-500mM 硒酸盐的LB液体培养基中放大培养6-36小时，即可获得红色元素硒纳米颗粒或纳米花晶体。
4.如权利要求2所述的一种茶树内生草螺菌制备纳米红色元素硒的方法，其特征在于：茶树内生草螺菌活化、培养时均与硒酸盐共培养的方法为：保存的茶树内生草螺菌菌种接种含有50 mM硒酸盐的LB液体培养基培养过夜，将活化后的菌液以体积比1:100接入含有50-500mM 硒酸盐的LB液体培养基中放大培养6-36小时，即可获得红色元素硒纳米颗粒或纳米花晶体。
5.如权利要求2所述的一种茶树内生草螺菌制备纳米红色元素硒的方法，其特征在于：培养过程中分批次加入硒酸盐的方法为：保存的茶树内生草螺菌菌种接种含有50 mM硒酸盐的LB培养基培养过夜，将活化后的菌液以体积比1:100接入含有50-200mM 硒酸盐的LB液体培养基中放大培养3-6小时后,再次加入300-450 mM硒酸盐,继续培养8-10小时,即可获得红色元素硒纳米颗粒或纳米花晶体。
CN201610285114.4A 2016-05-03 2016-05-03 一种茶树内生草螺菌制备纳米红色元素硒的方法 Expired - Fee Related CN105838740B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610285114.4A CN105838740B (zh) 2016-05-03 2016-05-03 一种茶树内生草螺菌制备纳米红色元素硒的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610285114.4A CN105838740B (zh) 2016-05-03 2016-05-03 一种茶树内生草螺菌制备纳米红色元素硒的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105838740A CN105838740A (zh) 2016-08-10
CN105838740B true CN105838740B (zh) 2020-11-06

Family

ID=56590686

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610285114.4A Expired - Fee Related CN105838740B (zh) 2016-05-03 2016-05-03 一种茶树内生草螺菌制备纳米红色元素硒的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105838740B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106962091A (zh) * 2017-02-15 2017-07-21 湖北大学 一种利用茶树内生草螺菌促进茶叶富硒的应用技术
CN110295211A (zh) * 2018-09-27 2019-10-01 湖北大学 一种细菌富硒蛋白的制备方法与应用
CN110923144B (zh) * 2019-10-21 2021-03-02 湖北大学 一株高硒酸盐耐受细菌及筛选方法和应用
CN114956905A (zh) * 2022-06-20 2022-08-30 安徽省膳硒食品有限公司 一种生物活性纳米单质硒肥料及其制备方法和制备装置

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002045513A2 (en) * 2000-12-04 2002-06-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Bacterial inoculants for enhancing plant growth
WO2005026269A1 (en) * 2003-09-04 2005-03-24 Mcdaniel C Steven Microorganism coating components, coatings, and coated surfaces
CN1746310A (zh) * 2004-09-10 2006-03-15 中国农业科学院生物技术研究所 一种高效固氮工程菌及其构建和用途
CN104769123A (zh) * 2012-09-10 2015-07-08 三菱丽阳株式会社 甲基丙烯酸和/或其酯的制造方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4999286A (en) * 1986-12-23 1991-03-12 E. I. Du Pont De Nemours And Company Sulfate reducing bacteria determination and control
EP1260282A3 (en) * 2001-05-16 2004-06-30 "VLAAMSE INSTELLING VOOR TECHNOLOGISCH ONDERZOEK", afgekort "V.I.T.O." Method for improving phytoremediation treatment of a contaminated medium
CA2455878A1 (en) * 2001-08-06 2003-05-15 Degussa Ag Production of l-lysine by genetically modified corynebacterium glutamicum strains
WO2005111202A1 (en) * 2004-05-12 2005-11-24 Metabolic Explorer Recombinant enzyme with altered feedback sensitivity
CA2638813C (en) * 2006-03-03 2015-11-24 Mayekawa Mfg. Co., Ltd. Azospirillum and herbaspirillum bacteria and method for control of plant disease using the same

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002045513A2 (en) * 2000-12-04 2002-06-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Bacterial inoculants for enhancing plant growth
WO2005026269A1 (en) * 2003-09-04 2005-03-24 Mcdaniel C Steven Microorganism coating components, coatings, and coated surfaces
CN1746310A (zh) * 2004-09-10 2006-03-15 中国农业科学院生物技术研究所 一种高效固氮工程菌及其构建和用途
CN104769123A (zh) * 2012-09-10 2015-07-08 三菱丽阳株式会社 甲基丙烯酸和/或其酯的制造方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Response of Sorghum bicolor (L.) Monech to dual inoculation with Glomus fasciculatum and Herbaspirillum seropedicae;M Deepadevi 等;《General and applied plant physiology》;20101231;第36卷;第176-182页 *
两株茶树内生草螺菌的微生物学特性;王婷 等;《微生物学报》;20140430;第54卷(第4期);第424-432页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105838740A (zh) 2016-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lian et al. Characterization of biogenic selenium nanoparticles derived from cell-free extracts of a novel yeast Magnusiomyces ingens
CN109402007B (zh) 生物纳米硒产生菌及利用该菌株制备生物纳米硒的方法
CN105838740B (zh) 一种茶树内生草螺菌制备纳米红色元素硒的方法
Fani et al. Biosynthesis of iron oxide nanoparticles by cytoplasmic extract of bacteria lactobacillus fermentum
CN108949739A (zh) 一种用于深度处理高浓度畜禽养殖废水的复合微生物菌剂及其制备方法
CN110923144B (zh) 一株高硒酸盐耐受细菌及筛选方法和应用
CN104450564B (zh) 一株可制备Ag/AgCl纳米颗粒的硫酸盐还原菌
CN113322211B (zh) 一株具有良好硒转化和Se(0)氧化能力的LX-88菌及其应用
CN104774875B (zh) 一种利用水生拉恩氏菌制备生物纳米硒的方法
CN110964674B (zh) 高产纳米硒的光合细菌及其纳米硒活菌制剂的制备方法
CN103739317B (zh) 一种微生态复合肥
CN103773719B (zh) 一种微生态复合肥的制备方法
CN111235066B (zh) 一种贝莱斯芽孢杆菌Lxh及其制备农用纳米硒片的方法
CN103739322B (zh) 一种生物复合肥的制备方法
CN115838770B (zh) 一种利用芽孢杆菌Bacillus.sp HZ3制备生物纳米硒的方法
CN108676817B (zh) 利用地衣芽孢杆菌生物合成纳米碲的方法及其应用
CN116333938A (zh) 海洋细菌及其在生物纳米硒制备中的应用
CN103773698B (zh) 一种高效微生物肥的制备方法
CN103740616B (zh) 一种生物复合肥
CN103773717B (zh) 一种高效微生物肥
CN114058535B (zh) 一种脱氮副球菌及其制备纳米硒的方法
CN109964957A (zh) 一种Cu2O/Ag纳米抗菌材料的绿色制备方法
CN101948772A (zh) 降解多环芳烃的高效菌株及其构建方法和应用
CN110272922B (zh) 一种利用草假单胞菌无细胞上清液合成纳米银的方法及其产品和应用
CN115433694A (zh) 耐辐射甲基杆菌l321在降解邻苯二甲酸酯以及促生长中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20201106

Termination date: 20210503

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee