CN108676817B

CN108676817B - 利用地衣芽孢杆菌生物合成纳米碲的方法及其应用

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Publication number: CN108676817B
Application number: CN201810779581.1A
Authority: CN
Inventors: 王昊; 哈卿; 张洒洒
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-07-16
Filing date: 2018-07-16
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2038-07-16
Also published as: CN108676817A

Abstract

本发明公开了一种利用地衣芽孢杆菌生物合成纳米碲的方法及其应用。本发明提供一株可以还原亚碲酸盐的新菌种‑‑地衣芽孢杆菌S13(保藏编号CGMCC No.11742)，其可将离子态的碲转化为纳米碲以从环境中去除，同时利用纳米碲对肿瘤细胞具有抑制能力，提供在抗肿瘤方面的应用，为今后生物纳米碲进一步在医药方面的研究及应用提供基础。

Description

利用地衣芽孢杆菌生物合成纳米碲的方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物纳米材料制备技术领域，具体地说，涉及一种利用地衣芽孢杆菌生物合成纳米碲的方法及其应用。

背景技术

碲(Tellurium,Te)是非金属元素，是元素周期表中第52号元素，与氧、硒和钋属于同族元素，在环境中主要和碲化金(AuTe₂)、碲化金银(AgAuTe₄)等形态组成复合矿物，地球自然状况下平均含量在0.027ppm。碲目前在工业上主要应用于改善金属热传导、玻璃光学特征和太阳能的光电转化等，在医学上利用碲化物的荧光特征，大量用于病理快速检测，近年来在碲是生物医药方面的应用开始起步。随着人类对碲的应用更加广泛，碲污染也日益严重，其4价状态(亚碲酸盐)有剧毒，对环境中微生物及动植物危害严重。

碲作为硒的同族元素，其化学性质应与硒类似。而以往国内外的大部分研究都是以硒为主，对碲的研究却十分有限，其可能原因是碲并不是人体必需元素。碲生物学活性与硒类似，在抗肿瘤活性，并且作为半导体材料方面的应用潜力巨大。目前已有的文献主要研究了纳米碲的化学及物理制备方法，但生物纳米碲结构更为稳定，生物活性高，合成过程环境影响小，其有较强的开发利用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用地衣芽孢杆菌生物合成纳米碲的方法及其应用。

为了实现本发明目的，本发明从土壤中分离得到一株可以还原亚碲酸盐的新菌种--地衣芽孢杆菌S13，其可将离子态的亚碲酸盐转化为纳米碲(通过降低其迁移能力)以从环境中去除，同时利用纳米碲对肿瘤细胞具有抑制能力，提供在抗肿瘤方面的应用。

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)S13现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.11742，保藏日期2015年11月26日。可通过CGMCC直接获得菌株S13。

第一方面，本发明提供地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)S13的以下任一种应用：

1)生物合成纳米碲中的应用；

2)修复亚碲酸盐污染环境中的应用。

第二方面，本发明提供利用地衣芽孢杆菌S13生物合成纳米碲的方法，将地衣芽孢杆菌S13接种至含有亚碲酸盐的发酵培养基中，摇培一段时间，然后从发酵产物中分离纯化纳米碲。

其中，所述发酵培养基中亚碲酸盐的浓度为0.001-0.3mM。优选地，所述发酵培养基中亚碲酸盐的浓度为0.05-0.2mM。更优选地，所述发酵培养基中亚碲酸盐的浓度为0.05、0.1或0.2mM。

前述方法包括以下步骤：

S1、菌种活化

挑取S13菌株单菌落接种于LB液体培养基中摇培至菌液OD₆₀₀＝0.8-1.0，即得种子液；

S2、纳米碲的生物合成

将上述种子液接种于含有亚碲酸盐的发酵培养基中，摇培一段时间，然后从发酵产物中分离纯化纳米碲。

若无特殊说明，本发明中摇培条件是指150-180rpm，37℃。

LB液体培养基为：每升培养基含NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，琼脂15g，去离子水1L。

优选地，步骤S2中将种子液按0.1-0.3v/v％的接种量接种于含有亚碲酸盐的LB液体培养基中进行摇培。

前述的方法，从发酵产物中分离纯化纳米碲的方法如下：

(1)发酵液经离心，弃上清，用生理盐水重悬沉淀，离心冲洗3-5遍；

(2)向0.1-0.3克菌体沉淀中加入1M的氢氧化钠0.5-0.8mL，100℃沸水浴20-30min；然后离心，弃上清，用生理盐水重悬沉淀，离心冲洗3-5遍，将沉淀重悬于水中，得到生物纳米碲悬液；

(3)向上述生物纳米碲悬液中加入正己烷进行萃取，然后离心收集下层水相。

在本发明的一个具体实施方式中，利用地衣芽孢杆菌S13生物合成纳米碲的方法如下：

①挑取S13菌株单菌落接种于LB液体培养基中摇培(150rpm，37℃)12h，取菌液稀释至OD₆₀₀＝0.8，得到种子液。

②将上述种子液按0.1-0.3v/v％的接种量接种于含0.2mM亚碲酸盐(亚碲酸钠)的LB液体培养基中，摇培(150rpm，37℃)72h。

③收集发酵液，10000rpm离心10min，弃上清，用生理盐水重悬沉淀，10000rpm离心冲洗3-5遍。

④向0.1-0.3克菌体沉淀中加入1M的氢氧化钠0.5-0.8mL，100℃沸水浴20-30min；然后10000rpm离心10-30min沉淀纳米碲，弃上清，用生理盐水重悬沉淀，10000rpm离心冲洗3-5遍，将沉淀重悬于1/2原发酵液体积的无菌水中，得到生物纳米碲悬液。

⑤向上述生物纳米碲悬液中加入正己烷进行萃取3-6次，每次萃取正己烷的用量为生物纳米碲悬液体积的0.4-0.7倍。

⑥10000rpm离心10-35min收集下层水相。获得高纯度、分散性较好生物纳米碲悬液，所得单质碲的透射电子显微镜观察结果见图7。

第三方面，本发明提供按照上述方法制备的生物纳米碲的以下任一种应用：

1)制备抗肿瘤药物中的应用；

2)制备肿瘤检测试剂中的应用；

3)制备肿瘤显像剂中的应用；

4)制备半导体材料中的应用。

第四方面，本发明还提供按照上述方法生物合成的生物纳米碲。透射电镜下观察，所得纳米碲呈柱状，直径为30-80nm，长度为100-500nm。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)利用微生物合成纳米碲具有效率高，成本低，环境影响小，应用范围广等优势，避免化学还原中的化学品二次污染和物理合成中的能耗高等问题，可以广泛应用于环境修复、医学、和工业制造中。

(二)本发明首次利用地衣芽胞杆菌生物合成纳米碲，地衣芽胞杆菌具有生物安全性好等优势，已广泛应用于人体和动物体益生菌。本发明在人体、动物、环境修复等方面具有更广的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中菌株S13合成纳米碲的形态特征。

图2为本发明实施例1中菌株S13对不同浓度亚碲酸盐的耐受性。

图3为本发明实施例2中菌株S13在不同亚碲酸盐浓度下的转化率(A)及对应浓度下的碲产量(B)。

图4为本发明实施例3中菌株S13在0.2mM亚碲酸盐存在时，不同时间点的转化率(A)及对应时间点的碲产量(B)。

图5为本发明实施例4中培养基中添加0.2mM亚碲酸盐时，菌株S13透射电子显微镜(TEM)照片。

图6为本发明实施例4中培养基中添加0.2mM亚碲酸盐时，菌株S13产生的纳米碲能谱图。

图7为本发明实施例5中菌株S13转化生成的纳米碲颗粒纯化后透射电子显微镜(TEM)照片。

图8为本发明实施例6中黑色素瘤细胞(B16F10)在加入生物合成纳米碲后的生长情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中所述亚碲酸盐是指亚碲酸钠。

实施例1地衣芽孢杆菌S13对亚碲酸盐的耐受浓度

1、制备固体LB不同浓度含碲培养基(每升培养基含NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，琼脂15g，去离子水1L)，121℃高压灭菌20min；配制亚碲酸盐母液(0.2M)，过滤灭菌，加入亚碲酸盐溶液，使培养基中亚碲酸盐含量分别0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM。

2、将S13菌株挑取单菌落接种于LB液体培养基中摇培12h(150rpm，37℃)取上述菌液，稀释为OD₆₀₀＝0.8的母液备用；分别在含不同浓度碲的平板上滴100μL母液并均匀涂板，每个浓度6个重复，37℃培养48h，观察菌落生长及颜色变化。纳米级单质碲呈黑色，若菌株能耐受亚碲酸盐并生成纳米碲，其形成菌落应为灰黑色。(图1)

3、根据上述2结果，可知0.05mM、0.1mM、0.2mM亚碲酸盐对地衣芽孢杆菌生长没有明显抑制作用；而0.3mM亚碲酸盐存在时，地衣芽孢杆菌S13生长受到较大影响，活菌量迅速降低；亚碲酸盐浓度大于等于0.4mM时，地衣芽孢杆菌S13在48h内无法形成菌落，由此得到地衣芽孢杆菌S13对亚碲酸盐耐受浓度范围为0-0.3mM。(图2)

实施例2地衣芽孢杆菌S13在不同亚碲酸盐浓度下对生物纳米碲的合成效率

1、制备不同浓度含碲液体LB培养基：配制亚酸盐母液(0.2mM)，过滤除菌；向培养基中加入亚碲酸盐溶液，使培养基中亚碲酸盐含量分别0.05mM，0.1mM，0.2mM，每个浓度梯度3个重复，121℃高压灭菌20min。

2、菌种活化：将S13菌株挑取单菌落接种于LB液体培养基中摇培12h(150rpm，37℃)，取上述菌液，稀释至OD₆₀₀＝0.8；将稀释好的菌液按照0.1v/v％接种量接种于上述含碲LB培养基中，摇培72h(150-180rpm，37℃)。

3、亚碲酸盐含量测定：将含有0.05mM，0.1mM，0.2mM浓度亚碲酸盐的LB培养基培养48h后的S13菌液充分悬浮，从每个三角瓶中吸取1.5mL菌液分别移入2mL的离心管中(三个浓度重复共27个样)，10000g离心10min，取上清液1mL，加入0.5M的Tris-HCl(pH 7.0)溶液3mL和10mM的DDTC(二乙基二硫代氨基甲酸钠三水)溶液1mL混匀，在室温反应5min之内，在波长340nm处测定吸光度，并绘制碲浓度与吸光值的标准曲线(Te⁴⁺浓度＝OD₃₄₀×0.2895)。

转化率＝(初始Te⁴⁺浓度-OD₃₄₀×0.2895)/初始Te⁴⁺浓度

转化量＝转化率×初始Te⁴⁺浓度

4、根据亚碲酸盐吸光度标准曲线换算获得培养上清中残留的碲的含量。计算获得S13转化亚碲酸盐为纳米碲的转化率。(图3A)。S13菌株在较低亚碲酸盐浓度下转化率较高，在浓度为0.05mM时约为73.1％，转化生成纳米碲含量约为0.0366mM，对0.1mM亚碲酸盐的转化率为69.3％，产量为0.0693mM；0.2mM亚碲酸盐时，S13菌株转化纳米碲达到最高产量，为0.121mM，但此时对亚碲酸盐的转化率仅为60.3％。(图3B)

实施例3地衣芽孢杆菌S13合成纳米碲的最佳培养时间

1、培养基制备和菌株活化参考实施例1中步骤1和2。

2、将活化好的S13菌株菌液浓度调整为OD₆₀₀＝0.8；将稀释好的菌液按照0.1v/v％接种量接种于含0.2mM亚碲酸盐LB培养基中，37℃，150rpm摇培，对照与处理各3个重复。分别于摇培8h、16h、24h、32h、40h、48h、72h、96h、120h、144h取样，每个处理三个重复。

3、将培养好的菌液10000rprn离心10min，取上清液1mL，加入0.5M的Tris-HCl(pH7.0)溶液3mL和10mM的DDTC溶液1mL混匀，5min内在波长340nm处测定吸光度。

4、根据亚碲酸盐吸光度标准曲线换算可知样品中亚碲酸盐含量。通过此数据可得出S13菌株转化完成亚碲酸钾的体积，从而得出转化效率。S13菌株在时间较长时转化效率较高，在144h时最高可达74.2％，转化生成纳米碲含量约为0.148mM，转化率随时间增长而逐渐变高，并在32h时有明显增高。(图4)

实施例4地衣芽孢杆菌S13合成生物纳米碲的特征分析

1、培养基制备和菌株活化参考实施例1中步骤1和2。

2、将活化好的S13菌株菌液浓度调整为OD₆₀₀＝0.8；将稀释好的菌液按照0.1％接种量接种于含0.2mM亚碲酸盐LB培养基中，37℃，150rpm摇培72h。

3、将摇培72h后的黑色菌液取出，10000rpm离心10min，去除上清液，用生理盐水重悬浮沉淀，离心冲洗3-5遍，取菌与纳米碲的黑色混合液，滴加一滴在铜网上，用滤纸吸去多余水分，晾干，在透射电镜下(TEM,JEM-1230,Japan)观察，并对该纳米颗粒进行能谱分析。

结果如图5所示，透射电镜下，纳米碲颗粒呈柱状，直径为30-80nm，长度为100-500nm。能谱分析结果如图6所示，在3.6keV，27.5keV和31.3keV处出现碲元素的特征峰。表明S13菌株合成的纳米颗粒为纳米碲。

实施例5地衣芽孢杆菌S13合成生物纳米碲分离与纯化

1、培养基制备和菌株活化参考实施例1中步骤1和2。

2、将活化好的S13菌株菌液浓度调整为OD₆₀₀＝0.8；将稀释好的菌液按照0.1v/v％接种量接种于含0.2mM亚碲酸盐LB培养基中，37℃150rpm摇培72h。

3、将摇培72h后的黑色发酵液取出，10000rpm离心10min，去除上清液，用生理盐水重悬浮沉淀，离心冲洗3-5遍，去除上清液。

4、向0.1-0.3克菌体沉淀中加入1M的氢氧化钠0.5-0.8mL，100℃沸水浴20-30min。

5、10000rpm离心10-30min沉淀纳米碲，无菌生理盐水清洗3-5遍，10000rpm离心收集后重悬于1/2原发酵液体积的无菌纯净水中。

6、将所得生物纳米碲悬液至萃取塔，按照悬浮液0.4-0.7倍体积的正己烷加入悬液中进行萃取3-6次，10000rpm离心30-35min收集下层水相。

7、获得高纯度、分散性较好生物纳米碲悬液，透射电子显微镜观察结果见图7。

实施例6生物纳米碲抗肿瘤活性研究

1、将实施例5中制备的纳米碲稀释至10mM。

2、活化黑色素瘤细胞(B16F10)。复苏3代，将复苏后的细胞接种至细胞培养板中(96孔板，100μL每孔)，细胞密度为1×10⁴’个/mL。

3、37℃培养24h后向细胞培养液中加入已纯化的纳米碲悬液，使培养液最终单质碲浓度分别为1mM，3mM，5mM，7mM，9mM(每个浓度三个平行样)。将加入含纳米碲培养液的细胞37℃培养24h。

4、向细胞培养板每孔中加入10μL的CCK-8溶液，立即用酶标仪测定450nm处吸光度，作为背景值。然后将培养板置于培养箱中培养1-4h后，用酶标仪测定450nm处吸光度。

5、细胞存活率可通过如下公式计算得出：

细胞存活率＝(S_OD450-B_S)/(CK_OD450-B_CK)

其中，S_OD450为1-4h后处理样品450nm吸光度，CK_OD450为对照样品1-4h后450nm吸光度，B_S为处理样品450nm背景吸光度，B_CK为对照样品450nm背景吸光度。

结果见图8，可知当单质碲浓度大于5mM时，细胞浓度相比对照组达到半数致死量，而当单质碲浓度大于7mM时，黑色素瘤细胞数量仅为对照组的10％左右。证明生物纳米碲在一定浓度下具有明显的抗肿瘤活性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)S13的以下任一种应用：

1)生物合成纳米碲中的应用；

2)修复亚碲酸盐污染环境中的应用；

其中，所述地衣芽孢杆菌S13的保藏编号为CGMCC No.11742。

2.利用地衣芽孢杆菌S13生物合成纳米碲的方法，其特征在于，将地衣芽孢杆菌S13接种至含有亚碲酸盐的发酵培养基中，摇培一段时间，然后从发酵产物中分离纯化纳米碲；

其中，所述地衣芽孢杆菌S13的保藏编号为CGMCC No.11742；

所述发酵培养基中亚碲酸盐的浓度为0.001-0.3mM；

从发酵产物中分离纯化纳米碲的方法如下：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中亚碲酸盐的浓度为0.05-0.2mM。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中亚碲酸盐的浓度为0.05、0.1或0.2mM。

5.根据权利要求2-4任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、菌种活化

S2、纳米碲的生物合成

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S1中摇培条件为：150-180rpm，37℃。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S2中将种子液按0.1-0.3v/v％的接种量接种于含有亚碲酸盐的LB液体培养基中，150-180rpm，37℃条件下摇培。