CN106513701B - 一种制备收集纳米银的生态方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备收集纳米银的生态方法，属于生物保鲜材料领域，包括如下步骤：将鱼腥草打浆、固液分离，取上清，得到鱼腥草汁；该鱼腥草汁以硫酸铵沉淀，初步分离后，得到粗提物；该粗提物过凝胶色谱柱纯化，得到鱼腥草提取物纯化组分；该纯化组分中加入AgNO3溶液，室温静置，得到纳米银溶胶；该纳米银溶胶和菌体混合、静置，收集吸附有纳米银粒子的菌体。本发明采用的制备方法操作简单，经济可行，既不需要昂贵精密的设备，也不需要使用有害试剂，解决了一般生物法杂质多、富集困难的问题，整个过程非常绿色环保。
Description
技术领域
本发明属于生物保鲜材料领域，具体涉及一种制备收集纳米银的生态方法。
背景技术
纳米银(AgNPs)是以纳米技术为基础研制而成的新型抗菌产品，比银离子具有更稳定的物理化学特性，由于小尺寸效应、量子效应和具有极大的比表面积，因而具有传统无机抗菌剂无法比拟的抗菌效果，且效力持久、安全性高，不易产生耐药性，可用以解决食品工业中普遍存在的保鲜防腐问题，其广阔的应用前景已经引起了人们广泛的重视。
AgNPs制备方法多种多样，主要有物理法、化学法和生物法三大类。物理或化学还原法制备的AgNPs纯度较高，目前在商业性规模生产中大多采用这些方法，但制备过程中需要添加多种稳定剂和分散剂以形成纳米银的“壳核”结构，在一定程度上对人体和环境都有危害，因此限制了AgNPs在医学、食品等领域的应用。与传统的物理化学方法相比，采用生物材料体系合成纳米微粒，具有很多优点，如操作简单、反应温和、不需要添加其他还原剂和表面活性剂、且不产生有毒性副产物等，因此，发展安全、绿色、经济的生物法制备AgNPs具有很大的研究价值，是实现生态友好及安全可靠目标的一种良好途径。生物法中有一类方法为微生物还原法，微生物法一般还原速率较慢，反应时间长，通常要数天(张杰，张映，郭瑞，张琦，杨洪一，王滨松.钩状木霉生物合成纳米银及其杀菌性能[J].微生物学通报，2016,43(2)：386-393。)，生产效率较低，不利于工业过程的开发，而且微生物的培养和收集也较为麻烦。
利用植物生物质是另外一种制备纳米金属粒子的不错选择。有一些利用其他植物提取物制备AgNPs的报道，如绿茶、杨梅、芒果叶、番石榴叶、紫苏叶、辣椒等，但有一些缺点，如需要在反应体系中加入十二烷基硫酸钠做为表面活性剂(王迎春，陈慧英，蓝蓉.绿茶提取物制备纳米银[J].环境科学与技术，2013，36(12)：122-125)，另外植物中具有合成AgNPs作用的生物分子一般是黄酮类、萜类、还原糖、生物碱类等还原性物质进行非酶促反应，植物复杂组分也使得制备组装的纳米粒子表面不洁净(陆瑤，郭清泉，郭秋兰，曾金华.植物生物质合成金纳米粒子的研究进展，现代化工，2013,33(8)：36-41)。
本发明在前期试验中用数十种植物匀浆滤液进行AgNPs的制备，包括百合、马齿苋、芦蒿、芥蓝、圆白菜、圆青椒、山药、洋葱、苦菊、冰草、青菜、西兰花、鱼腥草、草莓、柠檬、苹果、空心菜、绿茶、蓝莓叶、黑莓叶、银杏叶、小麦苗、莴苣叶、甘薯叶，另外还有没食子酸、茶多酚、葡萄糖等分析纯试剂作为阳性对照，发现鱼腥草制备AgNPs的反应速度较快，产物抗菌活性高，目前还没有关于用鱼腥草提取物制备AgNPs的报道，因此选用纯化的鱼腥草提取物作为还原试剂制备AgNPs，同时进一步对鱼腥草汁进行分离纯化，采用相对纯净的组分进行AgNPs的制备，使得制备出的AgNPs粒径、形貌均一，表面洁净。
另外，制备好的纳米粒子一般为溶胶体系，由于纳米颗粒尺寸小，收集溶胶中的AgNPs需要12000rpm以上的高速离心，给大规模工业化生产造成困难，而如果不离心富集，直接冷冻干燥，又会造成能耗高的缺点。本发明人发现通过采用一株具有吸附功能的专利菌株，将制备好的AgNPs直接吸附到菌体表面，再通过简单的过滤或低速离心就可以收集AgNPs，实现安全、绿色、节能生产，有着广阔的应用前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种制备收集纳米银的生态方法，以克服现有技术中存在的不足。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
1、一种制备收集纳米银的生态方法，包括如下步骤：
(1)将鱼腥草洗净，加水打浆，固液分离后取上清，得到鱼腥草汁；
(2)将步骤(1)得到的鱼腥草汁中加入硫酸铵粉末至终浓度为48～52％饱和度，进行沉淀，保留上清；
(3)向步骤(2)得到的上清中加入硫酸铵粉末至终浓度为78～82％饱和度，进行沉淀，保留沉淀；
(4)以水溶解步骤(3)中得到的沉淀，离心并以滤膜过滤，得到鱼腥草粗提取物溶液；
(5)将步骤(4)中得到的粗提物，过凝胶色谱柱纯化得到鱼腥草提取物纯化组分；
(6)在步骤(5)中得到的鱼腥草提取物纯化组分中加入AgNO3水溶液，室温静置，得到纳米银溶胶；
(7)将真菌菌株接种培养，收集并洗涤菌体；
(8)将步骤(6)得到的纳米银溶胶和步骤(7)得到的菌体混合，静置；
(9)收集步骤(8)中的吸附有纳米银粒子的菌体。
步骤(1)中，所述的鱼腥草为市售用于食用的新鲜鱼腥草，切成5～10cm长，利于打浆；所述加水体积与鱼腥草重量的比为1～1.5mL/g。所述水可以为自来水，蒸馏水，去离子水等，所述打浆可以使用家用或工业用打浆机或者搅拌器。所述固液分离方法可以是过滤或离心。
步骤(2)或步骤(3)中，硫酸铵粉末在50～60rpm搅拌速率、冰水浴条件下加入。
步骤(4)中，所述离心的条件为10000～11000rpm、4℃下，离心10～15min，所述滤膜孔径为0.45或0.22μm。溶解沉淀使用的水体积没有特别要求，能够完全溶解沉淀即可，优选的，使用的体积为能溶解沉淀的最小体积。
步骤(5)中，所述过凝胶色谱柱纯化的条件为：凝胶柱填料sephdex G25，有效分子量为1000-5000Da，洗脱流动相为水，用量8～10柱体积，流速为0.10～0.12BV/min。
步骤(6)中，所述的AgNO3水溶液，其终浓度为0.9～1.1mM，优选为1mM，所述室温静置条件为：自然光照，放置时间4～5h；所述AgNO3溶液，可事先配制，浓度可为10～100mM，按一定比例与步骤(5)中的鱼腥草提取物纯化组分混合。
步骤(7)中，所述的真菌菌株为半乳糖地霉Galactomyces geotrichum KG-1，CGMCC No.11127，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年7月31日，保藏信息见专利文件CN 105087280 A。
步骤(7)中，所述的真菌通过如下步骤获得：
(A)真菌培养：将斜面保存的半乳糖地霉Galactomyces geotrichum KG-1接种到YPD培养液中，100～120rpm、25～28℃，培养2～3天，得到发酵液；
(B)收集菌体：将步骤(A)得到的发酵液，4层医用纱布过滤分离菌体，菌体用去离子水洗涤至滤过液无颜色，或者发酵液以2500～3000rpm离心10～12min，弃去上清，去离子水悬浮菌体沉淀至上清无颜色，收集湿菌体。
步骤(8)中，所述的纳米银溶胶和菌体混合吸附条件为：以纳米银溶胶溶液悬浮菌体混匀，至菌体密度1～5×106孢子/ml，25～28℃静置2～3h。
步骤(9)中，所述的收集吸附物条件为：2500～3000rpm，优选2500rpm，离心10～15min，优选10min，所得沉淀即为吸附有纳米银粒子的菌体。
本发明中所述“上清”为“上层清液”，本发明中所述饱和度为硫酸铵粉末在溶液中的饱和度。
有益效果：纳米银具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等生物活性，目前在很多领域都有广泛应用，纳米银的制备方法很多。物理法简单，所得产品杂质少，但是对仪器设备要求较高，生产费用昂贵。化学法则需要使用各种还原剂、络合剂、保护剂等来控制粒子尺寸、形貌及稳定性，容易造成化学试剂的残留。本发明采用的生物制备及吸附收集法操作简单，经济可行，既不需要昂贵精密的设备，也不需要使用有害试剂，解决了一般生物法杂质多、富集困难的问题，整个过程非常绿色环保。
1、本发明采用经过硫酸铵二次沉淀、凝胶色谱柱纯化后的鱼腥草提取物作为还原剂，制备纳米银粒子。
2、本发明采用植物提取物纯化成分作为一种生物催化剂制备纳米银，条件温和，操作简单，反应速度快，是一种生态友好及安全可靠的途径。
3、本发明采用的植物提取物成分经过部分纯化，与一般的生物制备体系相比组分简单，杂质少，减少对产物AgNPs的干扰，产物粒径、形貌均匀，表面洁净。
4、本发明所采用的鱼腥草提取物主要为蛋白类组分，可以有效包裹在AgNPs表面形成壳核结构，不需要再额外添加稳定剂防止纳米粒子聚合，既简化了操作，又减少了杂质和有害试剂残留。
5、本发明采用具有表面吸附功能的半乳糖地霉Galactomyces geotrichum KG-1的菌体作为载体，吸附溶胶体系中的纳米银粒子。
6、本发明所采用的制备和收集纳米银粒子的方法均不需要使用特殊设备和试剂，操作简单，成本低。
附图说明
图1鱼腥草提取物纯化组分的FTIR图谱
图2鱼腥草提取物与硝酸银溶液反应体系的溶液外观。
图3鱼腥草提取物与硝酸银溶液反应体系的紫外-可见扫描光谱
图4AgNPs的透射电镜图像
图5半乳糖地霉Galactomyces geotrichum KG-1菌体的扫描电镜图像
图6半乳糖地霉Galactomyces geotrichum KG-1菌体吸附AgNPs的扫描电镜图像
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
步骤(1)：鱼腥草汁的制备。
市售新鲜鱼腥草，洗净表面泥土，沥水5-10min，称取2kg鱼腥草，切成段，不超过10cm长，以利于打浆。加入去离子水，加水体积与鱼腥草重量的比为1mL/g，用家用匀浆机打浆1～2min。
匀浆于4000rpm条件下离心10min，倒出上清，上清用快速定性滤纸过滤，保留滤液，约1600ml。
步骤(2)：鱼腥草汁的硫酸铵沉淀
鱼腥草汁装于烧杯中，放入磁力搅拌子，于冰浴、磁力搅拌50rpm条件下，慢慢加入事先用研钵研碎的硫酸铵粉末，至终浓度为50％饱和度。4℃下静置过夜，12000rpm、4℃下离心15min，保留上清。
参照以上步骤，在离心所得上清中再继续加入硫酸铵，至终浓度为80％饱和度，进行二次沉淀，4℃下静置过夜，12000rpm、4℃下离心15min，弃去上清，保留沉淀。
步骤(3)：提取物的复溶和过滤
向步骤(2)得到的沉淀中逐渐加入去离子水，同时搅拌或旋涡混合直至溶解，共计约30ml，10000～11000rpm、4℃离心10～15min，上清过0.45μm滤膜。
步骤(4)：过柱纯化和收集
将步骤(3)中得到的滤液进行凝胶柱层析纯化。上样量1ml，色谱柱尺寸100cm(长)×1.6cm(内径)，凝胶柱填料采用sephdex G25(有效分子量为1000-5000Da)，洗脱用流动相为去离子水，流速0.6ml/min。采用HD-8离子交换层析检测仪(南京普阳科学仪器研究所)根据280nm吸光值进行洗脱监测，收集第二个出峰组分。图1为收集到的组分的傅里叶变换红外光谱图。
步骤(5)：纳米银的制备。
称取硝酸银AgNO3 1.69g，以100ml纯净水溶解，配制成浓度为100mM的AgNO3溶液。取99ml实施例4中收集的纯化组分，加入上述100mM的AgNO3溶液1ml，使AgNO3终浓度为1mM。
室温、自然光照条件下放置4h，可见溶液颜色变为棕褐色，见图2所示，即为制备而成的纳米银溶胶。对纳米银溶胶体系进行紫外-可见光谱扫描以及透视电镜观察，结果见图3、图4。结果显示该溶液在440-450nm范围内有纳米银粒子的特征性等离子吸收峰，制备的纳米银粒子为球形，直径范围2-50nm。调节放大倍数至一定程度，可见纳米银粒子表面的晶格条纹。
步骤(6)：真菌的培养。
半乳糖地霉Galactomyces geotrichum KG-1菌种，4℃保存于PDA斜面。用接种针取菌丝接种到YPD培养液中，120rpm、25℃培养2天，得到活化发酵液；取活化发酵液，按10％接种量于新的YPD培养液中120rpm、25℃培养2天。
YPD配方为：酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。
步骤(7)：菌体分离
取步骤(6)中获得的真菌培养物，用4层医用纱布过滤，弃去滤过液，保留菌体。菌体继续用去离子水洗涤至滤过液无颜色，得到湿菌体。
步骤(8)：纳米银粒子在菌体上的吸附
取步骤(7)中的湿菌体1g，加入实施例5中得到的纳米银溶胶100ml，混匀，至菌体密度1～5×106孢子/ml，25～28℃静置2h。
步骤(9)：纳米银和菌体吸附复合体的收集
将步骤(8)中所得的纳米银和菌体混合体系于2500rpm，离心10min，所得沉淀即为吸附有纳米银粒子的菌体。图5、图6分别为菌体吸附纳米银粒子前后的扫描电镜图像，吸附前的对照菌体表面光滑，吸附后菌体表面完全被纳米银粒子覆盖。
实施例2
步骤(1)：鱼腥草汁的制备。
市售新鲜鱼腥草，洗净表面泥土，沥水5-10min，称取2kg鱼腥草，切成5cm长的段，以利于打浆。加入去离子水，加水体积与鱼腥草重量的比为1.5mL/g，用家用匀浆机打浆1～2min。
匀浆于4000rpm条件下离心10min，倒出上清，上清用快速定性滤纸过滤，保留滤液，约1600ml。
步骤(2)：鱼腥草汁的硫酸铵沉淀
鱼腥草汁装于烧杯中，放入磁力搅拌子，于冰浴、磁力搅拌60rpm条件下，慢慢加入事先用研钵研碎的硫酸铵粉末，至终浓度为52％。4℃下静置过夜，12000rpm、4℃下离心15min，保留上清。
参照以上步骤，在离心所得上清中再继续加入硫酸铵，至终浓度为82％，进行二次沉淀，4℃下静置过夜，12000rpm、4℃下离心15min，弃去上清，保留沉淀。
步骤(3)：提取物的复溶和过滤
向步骤(2)得到的沉淀中逐渐加入去离子水，同时搅拌或旋涡混合直至溶解，共计约30ml，10000～11000rpm、4℃离心10～15min，上清过0.22μm滤膜。
步骤(4)：过柱纯化和收集
将步骤(3)中得到的滤液进行凝胶柱层析纯化。上样量1ml，色谱柱尺寸100cm(长)×1.6cm(内径)，凝胶柱填料采用sephdex G25(有效分子量为1000-5000Da)，洗脱用流动相为去离子水，流速0.8ml/min。采用HD-8离子交换层析检测仪(南京普阳科学仪器研究所)根据280nm吸光值进行洗脱监测，收集第二个出峰组分。
步骤(5)：纳米银的制备。
称取硝酸银AgNO3 1.69g，以100ml纯净水溶解，配制成浓度为100mM的AgNO3溶液。取99ml实施例4中收集的纯化组分，加入上述100mM的AgNO3溶液1ml，使AgNO3终浓度为1mM。
室温、自然光照条件下放置5h，可见溶液颜色变为棕褐色，即为制备而成的纳米银溶胶。
步骤(6)：真菌的培养。
半乳糖地霉Galactomyces geotrichum KG-1菌种，4℃保存于PDA斜面。用接种针取菌丝接种到YPD培养液中，100rpm、28℃培养3天，得到活化发酵液；取活化发酵液，按10％接种量于新的YPD培养液中120rpm、25℃培养2天。
YPD配方为：酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。
步骤(7)：菌体分离
取步骤(6)中获得的真菌培养物，用4层医用纱布过滤，弃去滤过液，保留菌体。菌体继续用去离子水洗涤至滤过液无颜色，得到湿菌体。
步骤(8)：纳米银粒子在菌体上的吸附
取步骤(7)中的湿菌体1g，加入实施例14中得到的纳米银溶胶100ml，混匀，至菌体密度1～5×106孢子/ml，25～28℃静置3h。
步骤(9)：纳米银和菌体吸附复合体的收集
将步骤(8)中所得的纳米银和菌体混合体系于3000rpm，离心15min，所得沉淀即为吸附有纳米银粒子的菌体。
表1各种植物组分制备AgNPs的结果比较
表1
a：在UV-Vis光谱扫描结果中反应液在最大吸收峰处的吸光值，数值的大小可以用于表示体系中纳米银粒子的浓度。
Claims (10)
1.一种制备收集纳米银的生态方法，包括如下步骤：
(1)将鱼腥草洗净，加水打浆，固液分离后取上清，得到鱼腥草汁；
(2)将步骤(1)得到的鱼腥草汁中加入硫酸铵粉末至终浓度为48～52％饱和度，进行沉淀，保留上清；
(3)向步骤(2)得到的上清中加入硫酸铵粉末至终浓度为78～82％饱和度，进行沉淀，保留沉淀；
(4)以水溶解步骤(3)中得到的沉淀，离心并以滤膜过滤，得到鱼腥草粗提取物溶液；
(5)将步骤(4)中得到的粗提物，过凝胶色谱柱纯化得到鱼腥草提取物纯化组分；
(6)在步骤(5)中得到的鱼腥草提取物纯化组分中加入AgNO3水溶液，室温静置，得到纳米银溶胶；
(7)将真菌菌株接种培养，收集并洗涤菌体；
(8)将步骤(6)得到的纳米银溶胶和步骤(7)得到的菌体混合，静置；
(9)收集步骤(8)中的吸附有纳米银粒子的菌体。
2.如权利要求1所述一种制备收集纳米银的生态方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的鱼腥草为用于食用的新鲜鱼腥草，切成5～10cm长，所述加水体积与鱼腥草重量的比为1～1.5mL/g。
3.如权利要求1所述制备收集纳米银的生态方法，其特征在于：步骤(2)或步骤(3)中，硫酸铵粉末在50～60rpm搅拌速率、冰水浴条件下加入。
4.如权利要求1所述制备收集纳米银的生态方法，其特征在于，步骤(4)中，所述离心的条件为10000～11000rpm、4℃下，离心10～15min，所述滤膜孔径为0.45或0.22μm。
5.如权利要求1所述制备收集纳米银的生态方法，其特征在于，步骤(5)中，所述过凝胶色谱柱纯化的条件为：凝胶柱填料sephdex G25，有效分子量为1000-5000Da，洗脱流动相为水，用量8～10柱体积，流速为0.60～0.80ml/min。
6.如权利要求1所述制备收集纳米银的生态方法，其特征在于，步骤(6)中，所述的加入AgNO3水溶液，其终浓度为0.9～1.1mM，所述室温静置条件为：自然光照，放置时间4～5h。
7.如权利要求1所述制备收集纳米银的生态方法，其特征在于，步骤(7)中，所述的真菌菌株为半乳糖地霉Galactomyces geotrichum KG-1，CGMCC No.11127。
8.如权利要求7所述制备收集纳米银的生态方法，其特征在于，步骤(7)中，所述的真菌通过如下步骤获得：
(A)真菌培养：将斜面保存的半乳糖地霉Galactomyces geotrichum KG-1接种到YPD培养液中，100～120rpm、25～28℃，培养2～5天，得到发酵液；
(B)收集菌体：将步骤(A)得到的发酵液，4层医用纱布过滤分离菌体，菌体用去离子水洗涤至滤过液无颜色，或者发酵液以2500～3000rpm离心10～12min，弃去上清，去离子水悬浮菌体沉淀至上清无颜色，收集湿菌体。
9.如权利要求1所述制备收集纳米银的生态方法，其特征在于，步骤(8)中，所述的纳米银溶胶和菌体混合吸附条件为：以纳米银溶胶溶液悬浮菌体混匀，至菌体密度1～5×106孢子/ml，25～28℃静置2～3h。
10.如权利要求1所述制备收集纳米银的生态方法，其特征在于，步骤(9)中，所述的收集吸附物条件为：2500～3000rpm，离心10～15min，所得沉淀即为吸附有纳米银粒子的菌体。
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2016
- 2016-11-10 CN CN201610994566.XA patent/CN106513701B/zh active Active
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| CN106513701A (zh) | 2017-03-22 |
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