CN105039419B

CN105039419B - 一种利用棘孢木霉菌合成纳米银的方法

Info

Publication number: CN105039419B
Application number: CN201510367573.2A
Authority: CN
Inventors: 赵蕾; 张娇娇
Original assignee: Shandong Normal University
Current assignee: Shandong Normal University
Priority date: 2015-06-29
Filing date: 2015-06-29
Publication date: 2017-10-17
Anticipated expiration: 2035-06-29
Also published as: CN105039419A

Abstract

本发明公开了一种利用棘孢木霉菌合成纳米银的方法，包括如下步骤：在棘孢木霉菌培养上清液中加入银离子和硝酸盐，使银离子的浓度为1‑5mmol/L，硝酸盐的浓度为0.1‑0.15mol/L，26‑30℃下避光培养，培养时间为24‑72h，即得纳米银。当硝酸银离子浓度为1mmol/L，24h之内溶液变色，与未添加硝酸钾的溶液相比，纳米银的合成速度大大加快。通过扫描电镜形貌的比较，合成纳米银的数量增加，粒径分布变得均匀，得到的纳米银性质更加优良。

Description

一种利用棘孢木霉菌合成纳米银的方法

技术领域

本发明涉及纳米材料领域，具体涉及一种利用棘孢木霉菌合成纳米银的方法。

背景技术

纳米材料由纳米粒子组成，纳米粒子是指尺寸1-100nm间的粒子。它具有表面效应、小尺寸效应、介电限域效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应，因而显示出不同于常规材料的热、光、电、磁、力、催化和敏感等特性。纳米银就是将粒径做到纳米级的金属银单质。由于纳米银具有很稳定的物理和化学性能，因此被广泛应用于催化剂材料、电池电极材料、低温导热材料、导电浆料、抗菌材料以及医用材料。

纳米材料因其独特的性能已广泛应用于各个医学领域，纳米银具有抑菌和杀菌的作用，从而可以作为抗生素得到应用。研究人员以金黄色葡萄菌和大肠杆菌为测试菌，采用纸片扩散法，研究纳米银与其他抗生素的联合治疗效果，发现其可以增强阿莫西林，红霉素和克林霉素的抗菌活性。此外，涂抹纳米银的生物材料无细胞毒性，可以将其用于关节置换手术。研究还发现，纳米银具有抗病毒和抗癌活性，例如，猴痘病毒是一种临床表现与天花类似的人类病原体，在抗病毒的试验中，表现出对其的抗性。利用纳米粒子作为药物载体来治疗癌症是最近研究的热点。并可作为药物载体来应用，还可用于主动和被动靶向药物。纳米银广阔的应用前景，使得其制备技术迅速发展。目前主要合成纳米银的主要方法是物理法和化学方法，物理法对仪器设备要求苛刻，生产费用成本较高，耗能高，且获得的产品较单一；化学法需使用较多的还原剂，而这些化合物价格昂贵、毒性强，副反应残留较多，且污染严重。由于绿色化学概念的普及，纳米银的合成也向无毒和环境友好的方向发展。因此，目前纳米银的生物合成主要采用微生物和植物等生物材料进行，与传统的物理和化学合成方法相比，生物合成方法具有很多优点，是一种清洁、无毒、环境友好、可持续发展的合成方法，逐渐成为纳米银合成的主要方式。

迄今为止，已发现原核生物和真核生物中的多个物种具有在细胞内或者细胞外合成纳米银的能力。利用真菌合成纳米银是近几年来发展起来的方法，并取得了很大进展。Vigneshwaran等的研究表明，当将黄曲霉与硝酸银共同孵育时，在其细胞壁上可生成Ag纳米晶。研究报告发现，存在某些致病性真菌如Fusarium oxysporum、Aspergillusfumigatus，致病菌素的存在造成其合成的纳米银对某些植物或人具有致病性。与细菌和酵母相比，真菌的优势在于能分泌大量的酶，分离过程简单，并且利用真菌分泌的酶可实现单分散性纳米晶的制备，而且可实现对晶体形貌的控制。木霉菌是一种无致病性的生防真菌，广泛应用于农业生产，其代谢产物硝酸还原酶在微生物体内氮素循环中起到电子载体的作用，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐，该催化体系中，能够将银离子还原生成纳米银。但在利用真菌合成纳米银的实际应用过程中，目前尚存在合成速度慢，产率低的弊端。

发明内容

为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种利用棘孢木霉菌合成纳米银的方法，该方法利用硝酸钾作为诱导物，利用棘孢木霉菌快速高效合成纳米银。

为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：

一种利用棘孢木霉菌合成纳米银的方法，包括如下步骤：在棘孢木霉菌培养上清液中加入银离子和硝酸盐，使银离子的浓度为1-5mmol/L，硝酸盐的浓度为0.1-0.15mol/L，26-30℃下避光培养，培养时间为24-72h，即得纳米银。

优选的，所述硝酸盐为硝酸钾，所述硝酸钾的浓度为0.1mol/L，培养的时间为2d。

优选的，所述避光培养是在恒温震荡培养箱中进行的。

优选的，所述棘孢木霉菌的培养上清液的获得方法，包括如下步骤：

1)木霉菌孢子悬液的制备：将木霉菌株接种于培养基平板上进行培养后，得到木霉菌孢子，取适量孢子，制得孢子悬液；

2)KNO₃最佳浓度的确定：取上述相同体积的孢子悬液接种到相同体积的含有不同浓度的KNO₃的PDB液体培养基中，培养，每隔设定时间进行取样，测定上清液的硝酸还原酶活性，进而确定KNO₃的最佳浓度；

3)棘孢木霉菌的培养：将孢子悬液接种于含有最佳浓度KNO₃的液体培养基中，培养；得到棘孢木霉菌培养上清液。

优选的，步骤1)中，所述的培养基为土豆培养基，土豆培养基由以下重量份的组分组成：马铃薯19.5-20.5份，葡萄糖1.5-2.5份，琼脂1.5-2份，去离子水99.5-100.5份。

优选的，步骤1)中，培养的温度为26-30℃，培养的时间为3-5d。

优选的，步骤1)中，所述孢子悬液的浓度为1×10⁷-10⁸CFU ml^-1。

优选的，步骤2)中，所述液体培养基为马铃薯液体培养基(PDB)。

优选的，步骤2)中，培养的温度为26-30℃，培养的时间为4-6d。

优选的，步骤2)中，取样的时间间隔为24h。

优选的，步骤2)中，上清液的硝酸还原酶活性的测定方法，包括如下步骤：将上清液和pH为7.5的缓冲液混匀，避光反应后，沸水浴反应，向反应溶液中加入磺胺溶液和N-1-萘基乙二胺溶液，混匀后静置，540nm处比色，观察颜色变化，所述缓冲液为含有30mM KNO₃和5％异丙醇的磷酸缓冲液。

进一步优选的，所述磺胺溶液的质量浓度为1％，N-1-萘基乙二胺溶液的浓度为0.02％，所述上清液、缓冲液、磺胺溶液以及N-1-萘基乙二胺溶液的体积比为2：2：1：1。

进一步优选的，避光反应的时间为50-70min，沸水浴反应的时间为5-10min，混匀后静置的时间为15-20min。

优选的，步骤3)中，孢子悬液与液体培养基的体积比为1:100，培养的温度为26-30℃，培养的时间为36-48h。

本发明的有益技术效果为：

1、本实验通过在PDB培养基加入不同浓度硝酸钾诱导硝酸还原酶，测定培养上清液硝酸还原酶活性，最终选取0.1mol/L硝酸钾为最适诱导浓度。与未诱导相比，培养两天后的上清菌液的硝酸还原酶活最高，加入相同浓度的硝酸银后，纳米银的合成速度大大加快。

2、本发明的工艺条件简单可控，合成纳米银粒径分布变得均匀，得到的纳米银性质更加优良。

附图说明

图1为硝酸还原酶活性测定对比图；

图2为纳米银溶胶的UV-vis的吸收光谱图；

图3为纳米银电镜扫描图；

图4为上清液中加入硝酸盐的反应体系与上清液中加入硝酸银和硝酸钾的反应体系培养24h后溶液颜色比较图；

图5为本发明生成的纳米银的紫外-可见光谱图。

具体实施方式

本实验将1mL的孢子悬液接种到分别含有相同浓度的硝酸钾、硝酸钠、硝酸镁、硝酸铝和硝酸钙的培养基中，相同的条件下震荡培养，每隔24h取样，测定上清液中硝酸还原酶活力。结果发现，硝酸铝没有诱导硝酸还原酶产生的能力，硝酸钠、硝酸镁和硝酸钙诱导硝酸还原酶产生的能力低于硝酸钾。所以以下实验均选择硝酸钾。

实施例1

1、菌种：棘孢木霉菌Q₁，分类命名：棘孢木霉(Trichoderma asperellum)，保藏编号：CGMCC NO.7988，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2013年8月12日。

2、培养基：土豆培养基(PDA)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，去离子水1000ml，pH自然。将去皮后的马铃薯切块煮沸30min后用纱布过滤，然后加入糖和琼脂，121℃灭菌20min。

3、方法

1)木霉菌孢子悬液的制备：将木霉菌株接种于PDA平板上，28℃培养5d后，PDA平板被绿色孢子覆盖。向平板上倒入适量无菌水，利用移液枪反复吹打无菌水，使孢子和无菌水充分混合。吸取适量的高浓度孢子液于含玻璃珠的三角瓶中，轻微摇晃以打散孢子，然后吸取适量孢子悬液于血球计数板上，显微镜下计数，控制孢子悬液浓度为1×10⁷CFU ml^-1左右。

2)硝酸还原酶活性测定：取上述1mL孢子悬液接种到100mL(含有0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/LKNO₃)的PDB液体培养基的锥形瓶中，每个设定三个平行试验，28℃，180rpm培养5d。每隔24h取样，10000r/min离心10min后取上清。根据Harley和Saifuddin等描述的方法测定硝酸还原酶活力。反应体系：10mL上清液，10mL含有30mMKNO₃和5％异丙醇的0.1M，pH7.5的磷酸缓冲液，混匀，黑暗中反应1h。反应结束后，沸水浴反应5min，终止反应。向混合体系中加入5mL的磺胺溶液，5mL的N-1-萘基乙二胺溶液，混匀，室温静置20min，540nm处比色。

3)微生物培养：取1mL的孢子悬液于接种到100mL含有0.1mol/LKNO₃液体培养基中，28℃，180rpm培养36h。

4)微生物培养上清液的制备：取培养后的菌液，用滤纸过滤以除去菌体，收集到的滤液用于纳米银的合成。

5)纳米银的合成：取100mL微生物培养上清液，加入三角瓶中，向其加入硝酸银固体，使银离子的浓度在1mmol/L。置于28℃的恒温震荡培养箱避光培养(转速180rpm)。

6)合成纳米银表征方法：采用对合成的纳米银溶液进行分析，波长200-800nm。取反应终止溶液，分离得到的纳米银用无菌水和无水乙醇进行清洗，取20微升滴在铜网上，室温晾干，进行透射电镜，分析纳米银的粒子大小和形状。

4.结果

取1mL孢子悬液接种到含有不同浓度的KNO₃的PDB培养基，在28℃，180rpm培养5d。每隔24h取样，离心后获取上清。根据Harley和Saifuddin等描述的方法进行硝酸还原酶活力测定，结果如图1，将孢子悬液接种到含有0.1mol/L的KNO₃培养基中，在上述条件下培养2d，之后对菌液进行过滤获取的上清液用于纳米银的合成。

将木霉菌的上清液和硝酸银共同孵育时，随着反应的进行，24h之内溶液的颜色由浅黄色变成棕红色。混合体系的颜色变成棕红色是由于混合体系中银离子的还原，继而反应液中有纳米银的生成。同时，利用紫外-可见(UV-vis)光谱扫描，在430-440nm处发现既强又宽的吸收峰(如图2)，由于银离子表面等离子共振作用产生的波峰，说明混合体系纳米银的生成。吸收峰的强度随着反应时间的增加而增加，纳米银粒子数量随之增加。

停止反应后，通过10000rpm，10分钟离心获取纳米银，将分离得到的纳米银用无菌水和酒精分别进行清洗，得到的纳米银滴在覆有铜模的碳网上，室温干燥后，高倍透射电镜观察。由图3可以看出，反应体系中有类球形颗粒生成。

利用上述同样的方法将孢子悬液接种到普通的PDA培养基，获取的上清液与硝酸银混合反应时，发现24h溶液的颜色未发生明显的变化，而含有的KNO₃的培养基获取的上清加入相同浓度的硝酸银，24h溶液的颜色发生明显的变化(如图4所示)，说明反应体系中有纳米银颗粒存在，由此说明未进行诱导的培养基中使银离子还原成银的还原物质较少。同时，利用紫外-可见(UV-vis)光谱对未诱导合成的纳米银的反应体系进行光谱扫描，发现在420nm处发现既强又宽的吸收峰。将二者的紫外-可见光谱扫描进行比较，由图5可知，峰1是培养基中加硝酸钾诱导培养的菌上清合成纳米银，紫外可见光谱扫描得到的峰；峰2是普通的PDA培养基培养的菌上清合成纳米银，紫外可见光谱扫描得到的峰，两张图放在一起，经过比较可知，进行诱导后纳米银的UV-vis峰强度增大，说明反应体系中产生的纳米银数量增多，但峰位置基本不变，说明生成的纳米银粒子粒径不变，粒子数量增加，这是由于体系中硝酸还原酶活性增加，使被还原生成的纳米银的量增加。

实施例2

3、方法

1)木霉菌孢子悬液的制备：将木霉菌株接种于PDA平板上，26℃培养5d后，PDA平板被绿色孢子覆盖。向平板上倒入适量无菌水，利用移液枪反复吹打无菌水，使孢子和无菌水充分混合。吸取适量的高浓度孢子液于含玻璃珠的三角瓶中，轻微摇晃以打散孢子，然后吸取适量孢子悬液于血球计数板上，显微镜下计数，控制孢子悬液浓度为5×10⁷CFU ml^-1左右。

2)硝酸还原酶活性测定：取上述1mL孢子悬液接种到100mL(含有0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/LKNO₃)的PDB液体培养基的锥形瓶中，每个设定三个平行试验，26℃，180rpm培养6d。每隔24h取样，10000r/min离心10min后取上清。根据Harley和Saifuddin等描述的方法测定硝酸还原酶活力。反应体系：10mL上清液，10mL含有30mMKNO₃和5％异丙醇的0.1M，pH7.5的磷酸缓冲液，混匀，黑暗中反应50min。反应结束后，沸水浴反应10min，终止反应。向混合体系中加入5mL的磺胺溶液，5mL的N-1-萘基乙二胺溶液，混匀，室温静置15min，540nm处比色。

3)微生物培养：取1mL的孢子悬液于接种到100mL含有0.1mol/LKNO₃液体培养基中，30℃，180rpm培养48h。

5)纳米银的合成：取100mL微生物培养上清液，加入三角瓶中，向其加入硝酸银固体，使银离子的浓度在1mmol/L。置于30℃的恒温震荡培养箱避光培养(转速180rpm)。

上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.一种利用棘孢木霉菌合成纳米银的方法，其特征在于：包括如下步骤：在棘孢木霉菌培养上清液中加入银离子和硝酸盐，使银离子的浓度为1-5mmol/L，硝酸盐的浓度为0.1-0.15mol/L，26-30℃下避光培养，培养时间为24-72h，即得纳米银；

所述硝酸盐为硝酸钾，所述硝酸钾的浓度为0.1mol/L，培养的时间为2d；

所述棘孢木霉菌的保藏编号为CGMCC NO.7988。

2.根据权利要求1所述的利用棘孢木霉菌合成纳米银的方法，其特征在于：所述棘孢木霉菌的培养上清液的获得方法，包括如下步骤：

2)KNO₃最佳浓度的确定：取步骤1)中所述孢子悬液接种到相同体积的含有不同浓度的KNO₃的液体培养基中，培养，每隔设定时间进行取样，测定上清液的硝酸还原酶活性，进而确定KNO₃的最佳浓度；

3.根据权利要求2所述的利用棘孢木霉菌合成纳米银的方法，其特征在于：步骤1)中，所述的培养基为土豆培养基，土豆培养基由以下重量份的组分组成：马铃薯19.5-20.5份，葡萄糖1.5-2.5份，琼脂1.5-2份，去离子水99.5-100.5份。

4.根据权利要求2所述的利用棘孢木霉菌合成纳米银的方法，其特征在于：步骤1)中，培养的温度为26-30℃，培养的时间为3-5d。

5.根据权利要求2所述的利用棘孢木霉菌合成纳米银的方法，其特征在于：步骤1)中，所述孢子悬液的浓度为1×10⁷-10⁸CFU ml^-1。

6.根据权利要求2所述的利用棘孢木霉菌合成纳米银的方法，其特征在于：步骤2)中，培养的温度为26-30℃，培养的时间为4-6d。

7.根据权利要求2所述的利用棘孢木霉菌合成纳米银的方法，其特征在于：步骤2)中，上清液的硝酸还原酶活性的测定方法，包括如下步骤：将上清液和pH为7.5的缓冲液混匀，避光反应后，沸水浴反应，向反应溶液中加入磺胺溶液和N-1-萘基乙二胺溶液，混匀后静置，540nm处比色，观察颜色变化，所述缓冲液为含有30mM KNO₃和5％异丙醇的磷酸缓冲液。

8.根据权利要求7所述的利用棘孢木霉菌合成纳米银的方法，其特征在于：所述磺胺溶液的质量浓度为1％，N-1-萘基乙二胺溶液的浓度为0.02％，所述上清液、缓冲液、磺胺溶液以及N-1-萘基乙二胺溶液的体积比为2：2：1：1。

9.根据权利要求2所述的利用棘孢木霉菌合成纳米银的方法，其特征在于：步骤3)中，孢子悬液与液体培养基的体积比为1:100，培养的温度为26-30℃，培养的时间为36-48h。