CN110153440B - 一种日本曲霉发酵液绿色制备纳米银的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开以日本曲霉Aspergillus japonicus PJ01发酵液制备纳米银粒子的方法，属于纳米材料领域。本发明以固态发酵产出的粗酶液为还原剂和稳定剂，通过简易的磁力搅拌辅助合成纳米银，得到棕色液体。将液体通过高速离心、洗涤和烘干，得到粉末状银纳米粒子。在紫外光谱扫描下，溶液在400nm附近有最大吸收峰。制备出的银纳米粒子呈饱满球形且分散性良好。另外，本发明还提供酶液合成银纳米粒子在抑菌领域的应用。本发明生产工艺简单且绿色环保，在医药抑菌领域具有广阔前景。

Description

一种日本曲霉发酵液绿色制备纳米银的方法及应用
技术领域
本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及日本曲霉Aspergillus japonicus PJ01菌株固态发酵产粗酶液合成纳米银方法及其应用。
背景技术
由于细菌或病毒感染所导致的疾病和死亡显著增加，而传统抗生素和药物治疗的耐药性逐步增强，因此制备出无毒且耐药性强的抗菌药物已成为研究热点。纳米银具有广谱高效抗菌性能，效果持久无耐药性且环保无毒，比传统抗生素有更大的优势。纳米银的主要制备方法有化学法、物理法和生物法等，化学还原法最常用的有机溶剂和还原剂有水合肼和硼氢化钠等，但很多还原剂都有可能造成潜在的环境破坏和生物污染，也可能对人体有一定的危害。利用物理法合成纳米银制备出的纳米粒子具有形态均一且不受污染的特点，但成本较高，也不能作为一种绿色简易的制备方法。因而研究一种绿色无毒简易制备纳米银的方法也愈发重要。
生物法合成纳米颗粒不仅能减少对环境的污染，其制备成本也较低，因此，采用生物合成纳米粒子已成为当今的研究热点。利用微生物合成法的有两个途径。一是利用发酵产生的酶进行制备。微生物中最普遍的合成机制是利用微生物含有的硝酸还原酶，Ramanathan Vaidyanathan(2010)等人利用地衣芽孢杆菌在pH＝8时生产硝酸还原酶，生产的纳米银颗粒在10～80nm范围内，可应用于多种医药领域。Yan Zhang(2017)等人首次开发了一种简便的果胶酶保护金属纳米粒子的合成方法，所得的PE-AuNPs还可作为一种超灵敏、高选择性的比色法检测Mg2+。二是利用发酵过程中的菌液进行制备。Vahabi(2011)等人使用里氏木霉进行纳米银细胞外合成，将真菌菌丝暴露于硝酸银溶液中，利用胞外酶和真菌代谢物的催化作用使银离子被还原为纳米银。蒋静(2017)等人制备了蒙脱石－银/溶菌酶纳米复合材料，溶菌酶作为银离子的还原剂和捕获剂，蒙脱石减小了纳米银的团聚现象。
本发明采用的是以A.japonicas PJ01为发酵菌株进行固态发酵生产果胶酶粗酶液，利用粗酶液进行纳米银的制备合成。粗酶液中含有果胶酶、纤维素酶等植物细胞降解酶，另外还含有许多多糖、还原性糖及蛋白质等，这些物质都可以与硝酸银反应生成纳米银。通过加入氢氧化钠不仅能还原粗酶液中的一部分多糖，轻度的碱过剩还可以保证银离子的完全还原。
目前在使用绿色方法合成纳米银研究中，较多的是利用植物提取物、溶菌酶、淀粉酶等，利用霉菌粗酶液生成纳米银的报道还较少，因此本研究可为纳米银的制备方法提供另一种新思路。另外，对合成纳米银抗菌活性的研究亦可为纳米银在医药方面的应用提供科学依据。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出绿色合成纳米银的一种新思路，且避免有毒还原剂的使用。提供一种绿色环保、成本低、产量高且易操作的银纳米粒子的制备方法及其应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
A.japonicus PJ01发酵粗酶液合成纳米银，包括以下步骤：
(1)按比例配制所需的固态发酵培养基，接入一定量的孢子在30℃下发酵3天。发酵结束后加入固液比为1:15蒸馏水，置于170r/min摇床中振荡45min，过滤收集滤液即为粗酶液。
(2)配制成0～0.8mol/L的硝酸银溶液和0～2.0mol/L的氢氧化钠溶液。
(3)取10mL粗酶液，磁力搅拌下加热到20～50℃时，加入1mL0～0.8mol/L的硝酸银溶液和4mL0～2.0mol/L的氢氧化钠溶液，磁力搅拌1～90min。
(4)根据400nm吸收峰值择优取反应条件，取反应后的液体高速离心，转速10000rpm，离心时间20min。取其沉淀添加等量蒸馏水，重复离心两次，沉淀在50℃烘干箱中烘干过夜后获得纳米银粒子。
本发明还提供一种根据前述A.japonicus PJ01发酵粗酶液合成纳米银得到的纳米粒子在抑菌领域中的应用。
本发明的创新点及优点：
1、本发明利用A.japonicus PJ01发酵产粗酶液作为稳定剂和还原剂，与硝酸银反应，氢氧化钠保证银离子完全还原银纳米粒子。目前使用霉菌粗酶液合成银纳米的较少，本发明可作为制备纳米银的另一种新思路。
2、本发明的银纳米粒子的制备方法，采用磁力搅拌辅助合成银纳米粒子，制备工艺简单，成本低，反应时间短，且避免有毒还原剂的使用。
3、本发明的银纳米粒子具有广谱的抗菌活性，对于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有一定的抑菌效果且其最小抑菌浓度比较低。因此对于开发高效、低成本、广谱的抗菌材料领域方面具有广阔的应用前景，可为医学抑菌领域提供科学依据。
说明书附图
图1为实施例1中银纳米粒子的透射电镜图(a)及粒径分布图(b)。
图2为实施例1中银纳米粒子的紫外-可见光吸收光谱。
图3为实施例1大肠杆菌(a)和金黄色葡萄球菌(b)在不同浓度AgNPs培养条件下波长600nm的吸光值。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
本发明的A.japonicus PJ01发酵粗酶液合成纳米银方法，包括以下步骤：
固态发酵产出的果胶粗酶液为还原剂和稳定剂，粗酶液中含有许多多糖、还原性糖及蛋白质等，保证银离子的完全还原。通过简易的磁力搅拌辅助合成银纳米粒子，利用高速离心方法得到纳米银粉末。提供一种绿色环保、成本低、产量高且易操作的银纳米粒子的制备方法及其应用。
实施例1
本实施例的A.japonicus PJ01发酵粗酶液合成纳米银方法，包括以下步骤：
(1)发酵结束后加入固液比为1:15蒸馏水，振荡45min后过滤收集滤液为粗酶液；
(2)取10mL粗酶液于50mL的锥形瓶中，置于磁力搅拌下；
(3)当粗酶液温度达到30℃，加入1mL0.8mol/L硝酸银溶液，搅拌均匀；
(4)再加入4mL1.5mol/L氢氧化钠溶液，充分反应1min；
(5)取反应后的液体高速离心，离心条件为10000rpm，离心时间20min，取其沉淀，添加等量蒸馏水超声，重复离心两次；
(6)将步骤(5)所得沉淀产物于50℃中烘干过夜，得到的粉末即为纳米银；
(7)在试验中，反应溶液由澄黄透明变成棕黑色即表明产生银纳米粒子，在波长300～600nm条件下进行的紫外光谱扫描，以400nm附近的最大吸收峰作为条件优化；
(8)将本实施例得到银纳米粒子进行透射电镜观察，银纳米粒子透射电镜图如图1(a)所示，粒径分布图如图1(b)所示，由图1可知，本实施例所制备的银纳米粒子平均粒径为9.13±2.90nm，呈现饱满球形且分散性良好。图2为所制备的银纳米粒子紫外-可见光吸收光谱。
实施例2
本实施例与实施例1大致相同，不同之处在于硝酸银的浓度(步骤(3))不同，分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mol/L。
实施例3
本实施例与实施例1大致相同，不同之处在于氢氧化钠的浓度(步骤(4))不同，分别为0、0.5、1.0、1.5、1.75、2.0mol/L。
实施例4
本实施例与实施例1大致相同，不同之处在于搅拌温度(步骤(3))不同，分别为20、30、40、50℃。
实施例5
本实施例与实施例1大致相同，不同之处在于搅拌时间(步骤(4))不同，分别为1、5、15、30、45、60、90min。
实施例6
本实施例是以A.japonicus PJ01菌株固态发酵产果胶粗酶液合成制备纳米银及其在抑菌领域中的应用，取实施例1所得银纳米粒子进行抑菌实验。
(1)抑菌圈实验
将实施例1中银纳米粒子分散于无菌水中制备成浓度为40mg/mL的分散液。制备平板培养基，吸取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的不同菌悬液到灭菌后的平板培养基上涂布，控制菌悬液的菌浓度大约为105个/mL，将20μl的分散液浸湿于6mm滤纸片，无菌风干后，依次放入有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的平板培养基中。
将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌于37℃中培养18～24h(在本实施例中时间为18h)。
两种菌的抑菌圈分别为8.22mm、12.10mm。
(2)最低抑菌浓度
取实施例1所得银纳米粒子粉末溶于肉汤中，加入一定量大肠杆菌或金黄色葡萄球菌菌悬液(菌悬液浓度控制在105个/mL左右)，形成银纳米粒子浓度为0～0.64mg/mL的样品溶液。
在600nm波长下测其0、3、6、9、12、15、18、21、24h的吸光值，结果如图3所示，其中图3(a)为大肠杆菌，图3(b)为金黄色葡萄球菌，体系中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度都是0.64mg/mL。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.采用日本曲霉Aspergillus japonicus PJ01发酵液绿色合成纳米银的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制固态发酵培养基，接入一定量的日本曲霉孢子，生长发酵一定时间；
(2)在发酵结束后加入一定量的蒸馏水浸提获得粗酶液；
(3)在磁力搅拌下使粗酶液升温到20～50℃；
(4)向步骤(3)中加入硝酸银溶液、氢氧化钠溶液；
(5)将步骤(4)在磁力搅拌下反应1~90min；
(6)将步骤(5)得到的溶液高速离心，获得纳米银固体，加蒸馏水重复离心两次去除可溶性杂质；
(7)将步骤(6)得到的产物于50℃烘箱中烘干过夜，得到的粉末即为银纳米粒子；
所述的银纳米粒子具有广谱的抗菌活性，对于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有抑菌效果。
2.根据权利要求1中所述的A .japonicus PJ01发酵液绿色合成纳米银的方法，其特征在于，所述步骤中粗酶液的制备方法为发酵结束后，发酵饼加入固液比为1:15蒸馏水，置于170r/min摇床45min，滤纸过滤收集滤液即为粗酶液。
3.根据权利要求1中所述的A .japonicus PJ01发酵液绿色合成纳米银的方法，其特征在于，所述步骤中硝酸银溶液制备方法为取硝酸银溶于蒸馏水中，配制浓度为0～0.8mol/L的硝酸银溶液。
4.根据权利要求1中所述的A .japonicus PJ01发酵液绿色合成纳米银的方法，其特征在于，所述步骤中氢氧化钠制备方法为取氢氧化钠溶于蒸馏水中，配制浓度为0～2.0mol/L的氢氧化钠溶液。
5.一种权利要求1-4中任一项所述的方法制备获得的银纳米粒子在抑菌领域中的应用。
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