CN108213459B - 一种葡聚糖/纳米金-银合金复合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种葡聚糖/纳米金‑银合金复合物的制备方法，以金纳米种子/葡聚糖为种子，合成制备葡聚糖/纳米金‑银合金复合物。本发明以金纳米粒子为种子，可为银纳米粒子生长提供附着点，大大降低反应所需温度、缩短反应时间，而且合成的金银合金复合物粒径非常均一，大大提高了纳米银的抗菌活性。
Description
技术领域
本发明属于纳米合金材料的绿色制备技术领域，特别涉及一种具有抗菌活性的葡聚糖/纳米金-银合金复合物及其制备方法。
背景技术
近年来，具有纳米尺寸的功能性的纳米粒子与聚合物组装体在构建纳米材料方面拥有显著的功效，得到人们的广泛关注。其中，银纳米粒子的抗菌活性较好，并且具有广谱性，对不同菌种都有良好的抑制效果，而且银纳米粒子属于非抗生素类杀菌剂，不会产生耐药性，因此银纳米粒子广泛应用于临床抗菌领域。特别地，利用多糖的特殊结构及性质合成纳米材料已成为纳米材料制备领域的新兴研究课题，引起了研究者广泛关注。多糖在纳米材料合成过程中可以起还原剂和稳定剂的作用，且反应完成后易于降解、无环境污染。因此，多糖已成为纳米合成中理想的绿色原料。目前，环糊精、壳聚糖、纤维素、普鲁兰多糖、葡聚糖、海藻酸钠及其衍生物已作为还原剂和稳定剂在水溶液中绿色合成了金纳米粒子，但是利用葡聚糖等不易还原硝酸银制备银纳米粒子，比如常见的银镜反应需要在偏碱性的条件下进行，利用葡聚糖直接还原硝酸银其反应速度较慢，而且需要高温条件。本发明采用以金纳米粒子为种子，不仅可以克服上述问题，而且葡聚糖/纳米金-银合金复合物也具有非常好的抗菌活性，尤其是整个合成过程是非常绿色安全的，具有良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗菌活性的葡聚糖/纳米金-银合金复合物，该复合物能显著的抑制各类细菌生长。
本发明的另一个目的在于还提供上述葡聚糖/纳米金-银合金复合物的制备方法，该制备方法简单易行、成本较低廉。
本发明目的还在于提供上述葡聚糖/纳米金-银合金复合物在制备抗菌的药物或保健品中的用途。
本发明的目的是以下述技术方案实现的：
一种葡聚糖/纳米金-银合金复合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将葡聚糖和氯金酸在水溶液中微波加热反应得到金纳米种子/葡聚糖；所用葡聚糖和氯金酸质量比为100:1-20:1，微波功率在800W以上，反应时间在2min以内；
（2）将步骤（1）得到的金纳米种子/葡聚糖与硝酸银在水溶液中密封加热反应，得到葡聚糖/纳米金-银合金复合物；所用金纳米种子/葡聚糖和硝酸银中金银离子的摩尔比为1:1-1:10，加热温度为70-80℃，反应时间为20-30min。
优选的，所述步骤（1）具体为：将葡聚糖密封溶解于水中，葡聚糖水溶液的浓度为2-10 mg/mL；在持续搅拌过程中迅速滴加0.5-1.0倍体积的氯金酸溶液，然后微波加热反应得到金纳米种子/葡聚糖溶液。
所述微波反应功率在1000W以上。
所述步骤（2）具体为：将步骤（1）得到的金纳米种子/葡聚糖溶液冷却至室温后，加入硝酸银溶液，混合均匀后封口，加热反应得到葡聚糖/纳米金-银合金复合物溶液。
所述步骤（2）加热反应后所得的混合液经微孔滤膜过滤、离心、分散在水中、去离子水透析、冷冻干燥、得到葡聚糖/纳米金-银合金复合物。
一种葡聚糖/纳米金-银合金复合物，它为采用如上所述方法制备获得。
本发明提供的葡聚糖/纳米金-银合金复合物具有显著抗菌活性。因而本发明葡聚糖/纳米金-银合金复合物可以用于抗菌机能的药物或保健品中。进而，本发明还提供含有上述葡聚糖/纳米金-银合金复合物的抗菌药物或保健品。
本发明具有如下优点：
（1）整个反应过程中无有毒物质或环境污染物，绿色环保。
（2）通过控制金银盐溶液的比例，可以得到不同金-银比例的纳米合金粒子。
（3）以金纳米粒子为种子，合成制备的金-银纳米合金复合物粒径更加均一，抗菌效果更好。
（4）操作步骤简单易行，制备的金-银纳米合金复合物具有很好的水溶性和细胞低毒性，并且可实现连续大规模生产。
因此，本发明提供的是一种绿色环保、简单易行、金-银比例大小可控的制备方法，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是实施例2制备得到的多糖基金-银合金纳米粒子（金银摩尔比1:1）在水溶液中的紫外吸收图谱。
图2是实施例2制备得到的多糖基金-银合金纳米粒子（金银摩尔比1:1）的透射电镜图。
图3是实施例3制备得到的多糖基金-银合金纳米粒子（金银摩尔比1:5）在水溶液中的紫外吸收图谱。
图4是实施例3制备得到的多糖基金-银合金纳米粒子（金银摩尔比1:5）的透射电镜图。
图5是实施例4制备得到的多糖基金-银合金纳米粒子（金银摩尔比1:5）在水溶液中的紫外吸收图谱。
图6是实施例4制备得到的多糖基金-银合金纳米粒子（金银摩尔比1:5）的透射电镜图。
图 7是对比例1制备得到的多糖基银纳米粒子在水溶液中的紫外吸收图谱。
图 8是对比例1制备得到的多糖基银纳米粒子的透射电镜图。
图 9是多糖基金银纳米合金（金银摩尔比1:1和1:5）和银纳米粒子对小鼠成纤细胞（NIH3T3）的细胞毒性；
图 10是多糖基金银纳米合金（金银摩尔比1:1和1:5）和银纳米粒子对巨噬细胞（RAW）的细胞毒性。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的生化试剂为市售分析纯试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
一种葡聚糖/纳米金-银合金复合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将葡聚糖（2-10 mg/mL）密封溶解于水中，持续搅拌迅速滴加0.5-1.0倍体积氯金酸溶液后使用大功率微波加热，快速反应得到葡聚糖还原制备的较小颗粒的金纳米种子；所用葡聚糖和氯金酸质量比为100:1-20:1，微波功率在800W以上，反应时间在2min以内；反应中葡聚糖使用量远远超过金离子使用量，是由于葡聚糖不仅作为还原剂参与反应，还具有吸附在纳米颗粒表面起到稳定剂的作用，葡聚糖优选用葡聚糖dextran，分子量7W；采用微波加热主要是由于其加热均匀快速，相比其他加热方法可合成出粒径较小且均匀的纳米种子；
（2）将步骤（1）所得金纳米种子/葡聚糖溶液冷却至室温后，加入硝酸银溶液，金纳米种子/葡聚糖和硝酸银中金银离子的摩尔比为1:1-1:10，混合均匀后封口，70-80℃加热搅拌20-30min，以小颗粒的金纳米粒子为种子，缓慢还原制备得到金-银合金粒子；
（3）将步骤（2）反应后所得的混合液冷至室温，经微孔滤膜过滤、离心、分散在水中、去离子水透析及冷冻干燥，得到葡聚糖/纳米金-银合金复合物。
本发明采用以金纳米粒子为种子，可为银纳米粒子生长提供附着点，大大降低反应所需温度、缩短反应时间，而且合成的金银合金粒子粒径非常均一（本发明种子生长法可以提高粒径的均一性），大大提高了纳米银的抗菌活性，尤其是整个合成过程是非常绿色安全的，具有良好的应用前景。
实施例2
将葡聚糖（8 mg/mL）密封溶解于100 mL水中，持续搅拌迅速滴加氯金酸溶液(等体积0.1mg/mL)后使用大功率微波(1000W)加热两分钟，得到金纳米种子/葡聚糖溶液；所得金纳米种子/葡聚糖溶液冷却至室温后，加入硝酸银溶液，金银离子的摩尔比为1:1，混合均匀后封口，在70℃下加热搅拌20分钟，得到葡聚糖/纳米金-银合金复合物溶液，然后过滤、离心、分散、透析和冷冻干燥，得到多糖基金-银合金纳米粒子。合成制备的金-银合金纳米粒子在水溶液中的紫外吸收峰如图1所示，呈现单峰，没有单独的金或者银纳米粒子吸收峰，说明成功合成纳米合金粒子。合金粒子的形貌如透射电镜图2所示，显示其为较为规则的球形结构，粒径非常均一，平均约为10 nm。
实施例3
将葡聚糖（6 mg/mL）密封溶解于水中，持续搅拌迅速滴加氯金酸溶液(等体积0.1mg/mL)后使用大功率微波(1000W)加热两分钟，得到金纳米种子/葡聚糖溶液；所得金纳米种子/葡聚糖溶液冷却至室温后，加入硝酸银溶液，金银离子的摩尔比为1:5，混合均匀后封口，在70℃下加热搅拌25分钟，得到葡聚糖/纳米金-银合金复合物溶液，然后过滤、离心、分散、透析和冷冻干燥,得到多糖基金-银纳米粒子合金。合成制备的金-银合金纳米粒子在水溶液中的紫外吸收峰如图3所示，同样也呈单峰，说明成功合成纳米合金粒子。合金粒子的形貌如透射电镜图4所示，显示其为较为规则的球形结构，粒径较为均一，平均也约为10nm。
实施例4
将葡聚糖（2 mg/mL）密封溶解于水中，持续搅拌迅速滴加氯金酸溶液(0.5倍体积0.1mg/mL)后使用大功率微波(1000W)加热两分钟，得到金纳米种子/葡聚糖溶液；所得金纳米种子/葡聚糖溶液冷却至室温后，加入硝酸银溶液，金银离子的摩尔比为1:10，混合均匀后封口，在75℃下加热搅拌30分钟，得到葡聚糖/纳米金-银合金复合物溶液，然后过滤、离心、分散、透析和冷冻干燥，得到多糖基金-银纳米粒子合金。合成制备的金-银合金纳米粒子在水溶液中的紫外吸收峰如图5所示，同样也呈单峰，峰值约为436 nm，说明成功合成纳米合金粒子。合金粒子的形貌如透射电镜图6所示，显示其为较为规则的球形结构，粒径较为均一，平均约为15 nm，从图中可以看出随着金纳米种子量减少，紫外吸收峰向低波数位移，并且合金粒子的粒径略有增加，并且均匀性稍有下降趋势。
对比例1
参照样品银纳米粒子的制备方法如下：将葡聚糖（5 mg/mL）密封溶解于水中，加入硝酸银溶液（等体积0.1 mg/mL），混合均匀，在70℃下加热搅拌30分钟，均匀滴加稍过量还原剂硼氢化钠溶液（5 mg/mL），然后过滤、离心、分散、透析和冷冻干燥，得到多糖基银纳米粒子，相对本发明省去金纳米粒子作为种子这一步骤。
图5为银纳米粒子紫外吸收峰，峰值为423 nm左右，符合文献报道，说明成功合成银纳米粒子。图6为合成得到的银纳米粒子的透射电镜图，可以明显看出纯银纳米粒子的粒径分布均匀性要远远低于纳米金-银合金，平均粒径大约为18 nm。
试验例1
应用本发明实施例2、3、4得到的多糖基金-银纳米合金粒子以及对比例1得到的参照样品银纳米粒子测试对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的MIC值。
具体的测试方法如下：将测量样品和实验所需的各种玻璃器皿进行无菌处理。将保存的菌种以划线法接种到LB培养基(大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，在37℃下培养24h，取典型的菌落接种到装有液体培养基的锥形瓶中，在37℃下培养24h，通过稀释，使菌悬液中细菌浓度在1×105~2×105cfu/ml备用。取一定量的金-银纳米复合物(以样品中纳米合金含量为浓度)，稀释后，取该浓度的溶液10ml，采用两倍稀释法进行稀释，得到一系列浓度的样品，依次类推，直至所需浓度。取上述各浓度样品及空白样品1mL，分别于1mL菌悬液混合，测量浊度并记录。将各样品置于37℃下培养24小时，再次测量浊度，如果某浓度下样品浊度未变化而比其低一浓度级别样品浊度发生变化，则该浓度为该样品的MIC值。结果如表1所示，MIC浓度为样品中最终纳米合金含量，实施例4所得纳米合金粒径明显高于实施例2、3所得纳米粒子，其抗菌活性是三者中最差的，但也明显好于纯银纳米粒子的抗菌效果。
试验例2
应用本发明中抗菌效果较好的实施例2和3得到多糖基金-银纳米粒子合金以及对比例1得到的银纳米粒子测试对小鼠成纤细胞（NIH3T3）和巨噬细胞（RAW）的细胞毒性。
具体测试方法如下：
小鼠成纤细胞（NIH3T3）和巨噬细胞（RAW）细胞以6000个/孔均匀接种在96孔板上，培养基为DMEM（含10%PBS）放于37℃、 5% CO2培养箱中培养24小时后，更换培养基再加入20 µL不同浓度的金-银纳米合金复合物以及银纳米粒子复合物，样品浓度均统一为样品含银量（µg/mL），对照组不加样品。48小时后更换培养基并每孔加入20µL MTT溶液（5 mg/mL）。继续培养4小时，去上清液，每孔加入200 µL DMSO，轻轻震荡使结晶溶解，通过自动酶标仪检测490 nm处每孔光强度（OD）值。细胞的存活率通过（OD490， sample/OD490， control）× 100计算，OD490， sample为加入试样的各实验组的光强度，OD490， control为对照组的光强度。实验结果如图9-10所示，可以看出金-银纳米合金对两株细胞的毒性都要远远低于银纳米粒子。
综上所述，本发明利用金种子来生长纳米合金的方法，获得了粒径更为均一、杀菌效果相比纯银纳米粒子更好、而细胞毒性更低的多糖基金-银纳米粒子。
Claims (3)
1.一种葡聚糖/纳米金-银合金复合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）将葡聚糖密封溶解于水中，葡聚糖水溶液的浓度为2-10mg/mL；在持续搅拌过程中迅速滴加0.5-1.0倍体积的氯金酸溶液，然后微波加热反应得到金纳米种子/葡聚糖溶液；所用葡聚糖和氯金酸质量比为100:1-20:1，微波功率在1000W以上，反应时间在2min以内；（2）将步骤（1）得到的金纳米种子/葡聚糖与硝酸银在水溶液中密封加热反应，得到葡聚糖/纳米金-银合金复合物；所用金纳米种子/葡聚糖和硝酸银中金银离子的摩尔比为1:1-1:10，加热温度为70-80℃，反应时间为20-30min。
2.如权利要求1所述的葡聚糖/纳米金-银合金复合物的制备方法，其特征在于所述步骤（2）具体为：将步骤（1）得到的金纳米种子/葡聚糖溶液冷却至室温后，加入硝酸银溶液，混合均匀后封口，加热反应得到葡聚糖/纳米金-银合金复合物溶液。
3.如权利要求1所述的葡聚糖/纳米金-银合金复合物的制备方法，其特征在于所述步骤（2）加热反应后所得的混合液经微孔滤膜过滤、离心、分散在水中、去离子水透析、冷冻干燥、得到葡聚糖/纳米金-银合金复合物。
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