CN111407722B - 一种银纳米粒子复合水凝胶、其制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种银纳米离子复合水凝胶及其制备方法，其将手性色氨酸衍生物的水溶液调节pH至碱性，再与银盐的水溶液混合，放置后得到银纳米粒子复合水凝胶。本申请还提供了所述银纳米粒子复合水凝胶的应用。本发明中的银纳米粒子复合水凝胶的形成无需超声、无需额外的还原剂和稳定剂；该复合水凝胶的制备方法简单、制备成本低；具有可注射性、良好的生物兼容性和优异的抗菌性能。

Description

一种银纳米粒子复合水凝胶、其制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及水凝胶技术领域，尤其涉及一种银纳米粒子复合水凝胶的制备方法及其应用。
背景技术
超分子凝胶即小分子凝胶，是小分子(凝胶因子)之间通过氢键、π-π堆积、疏水-疏水作用以及静电作用等非共价键之间的协同作用组装形成的纤维三维网络结构，从而束缚住溶剂形成的胶冻状物质。我们把网络结构中束缚水分子的小分子凝胶称为超分子水凝胶。由于超分子凝胶体系中存在的非共价键作用力较弱，当外界条件发生改变时(如机械类等)，凝胶会垮塌，当条件恢复，凝胶也会随之恢复，所以超分子水凝胶具有多重刺激响应性。超分子水凝胶由于具有良好的生物相容性和生物降解能力，经常被用于生物传感、药物缓释以及组织工程等，其已经发展成为一类在光电、氧化还原以及催化等领域具有广泛应用前景的智能软材料。
近年来，抗生素等的长期使用使细菌的耐药性增加，由细菌引发的各种疾病严重危害着人类的健康。因此，研发持久而广谱、高效又安全的新型抗菌剂迫在眉睫。
银单质及其化合物是最常见的抗菌剂之一，具有广谱抗菌性，对各种细菌(大肠杆菌、革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌等)有很好的抗菌作用。银纳米粒子(Ag NPs)因其小尺寸效应、表面效应等特异性，具备特殊的光、电、催化等性能。Ag NPs与银离子相比，抗菌性能更持久，其作为高效、广谱及不产生耐药性的抗菌剂引起研究者的极大关注。
银纳米粒子有多种合成方法，如化学还原法、电化学还原法、光化学还原法、超声还原法、微波法、紫外辐射法等等。其中光催化还原法无需加入任何的还原剂与稳定剂等有毒的化学试剂，绿色环保，成本低，适于大规模生产。目前有很多文献和专利都报道了以银纳米粒子凝胶作为抗菌剂，在制备银纳米粒子时，使用了毒性较大的化学试剂，细胞毒性较大，生物相容性相对较差(公开号为CN101664563A的中国专利)；银纳米粒子容易出现团聚严重的现象，分散不均匀导致其抗菌性能受到影响(公开号为CN102218155A的中国专利)；另外，在制备银纳米粒子时需要聚合物环境(公开号为CN106146862A的中国专利)。
上述文献报道的含有银纳米粒子的水凝胶绝大多数需要高分子聚合物环境，或者需要加入还原剂或稳定剂，有些需要超声或紫外光作用才可以形成，增加了含有银纳米粒子的水凝胶制备的难度。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种银纳米粒子复合水凝胶的制备方法，该方法无需超声、无需额外的还原剂和稳定剂，制备方法简单，且该方法制备的复合水凝胶具有可注射性、良好的生物兼容性和优异的抗菌性能。
有鉴于此，本申请提供了一种银纳米粒子复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将如式(I)所示或如式(II)所示的的手性色氨酸衍生物的水溶液调节pH至碱性，再与银盐的水溶液混合，放置后得到银纳米粒子复合水凝胶；
Figure BDA0002390287110000021
优选的，所述银盐为硝酸银。
优选的，所述放置在避光下放置或在自然光照下放置。
优选的，所述避光下放置的时间为5～12h，所述自然光照下放置的时间为5～15min。
优选的，所述手性色氨酸衍生物的水溶液的浓度为2～10mg/mL。
优选的，所述pH为8～9。
本申请还提供了一种银纳米粒子复合水凝胶，由如式(I)所示或如式(II)所示的的手性色氨酸衍生物和银盐制备得到；
Figure BDA0002390287110000031
优选的，所述银纳米粒子复合水凝胶具有纳米纤维网络结构。
本申请还提供了所述的制备方法所制备的银纳米粒子复合水凝胶或所述的银纳米粒子复合水凝胶在制备抗菌药物中的应用。
优选的，所述抗菌药物的菌种为大肠杆菌或白色葡萄球菌。
本申请提供了一种银纳米粒子复合水凝胶的制备方法，其将如式(I)所示或如式(II)所示的的手性色氨酸衍生物的水溶液调节pH至碱性，再与银盐的水溶液混合，放置后得到银纳米粒子复合水凝胶；本申请提供的制备方法利用纯手性色氨酸衍生物和银盐原位形成含有银纳米粒子的复合水凝胶；在制备过程中无需超声，无需额外的还原剂和稳定剂，制备方法简单，成本较低。实验结果表明，本申请制备的银纳米粒子复合水凝胶具有注射性、良好的生物兼容性和抗菌性能。
附图说明
图1为Ag NPs-HAIP复合水凝胶的形成过程；
图2为Ag NPs-HAIP复合水凝胶的摇溶性和可注射性照片；
图3为Ag NPs-HAIP复合水凝胶的步频流变力学图；
图4为Ag NPs-HAIP复合水凝胶的SEM图(左)和TEM(右)；
图5为Ag NPs-HAIP复合水凝胶的X射线光电子能谱分析图；
图6为Ag NPs-HAIP复合水凝胶的X射线粉末衍射图；
图7为不同细菌(大肠杆菌(左)、白葡萄球菌(中)、金葡萄球菌(右))在复合水凝胶存在下24h后生长状况的数码照片图；
图8为不同细菌在相同的Ag NPs-HAIP凝胶浓度下的OD测试结果；
图9为细胞在凝胶因子和银凝胶中的相对活性。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
基于含银纳米粒子的水凝胶的性能与应用需求，本申请提供了一种银纳米粒子复合水凝胶的制备方法，该银纳米粒子复合水凝胶的制备方法的形成与凝胶因子的旋光性有关，纯手性的配体(L-HAIP或D-HAIP)与银盐可以形成水凝胶，而外消旋体((L+D)-HAIP)与银盐在相同的条件下不能形成凝胶；该复合水凝胶制备方法简单、制备成本低。该复合水凝胶具有可注射性、良好的生物兼容性和优异的抗菌性能。具体的，本申请提供了一种银纳米粒子复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将如式(I)所示或如式(II)所示的的手性色氨酸衍生物的水溶液调节pH至碱性，再与银盐的水溶液混合，放置后得到银纳米粒子复合水凝胶；
Figure BDA0002390287110000041
色氨酸是天然氨基酸中的一种，结构中含有吲哚基团、氨基和羧基，吲哚基团具有一定的疏水性和提供非共价键作用力的能力，羧基既具有配位能力，又可以提供组装所需要的氢键，更重要的是色氨酸是少数具备还原能力的氨基酸，因此，在制备银纳米粒子复合水凝胶的过程中选用色氨酸的衍生物比其它氨基酸类更适合。如式(I)所示的手性的色氨酸衍生物标记为L-HAIP，如式(II)所示的手性的色氨酸衍生物标记为D-HAIP，上述色氨酸衍生物的制备方法按照本领域技术人员熟知的方法制备，对此本申请没有特别的限制。按照本发明，将色氨酸衍生物的水溶液调节pH至碱性，以利于其形成复合水凝胶，在具体实施例中，所述pH为8～9。
对于银纳米粒子复合水凝胶制备的另一原料为银盐，即含有银离子的化合物，在具体实施例中，所述银盐选自硝酸银。
在原料准备完之后，本申请则将调节pH后的手性色氨酸衍生物溶液与银盐的水溶液混合，放置，即得到银纳米粒子复合水凝胶。所述手性色氨酸衍生物的水溶液的浓度为2～10mg/mL。所述放置可以在避光下放置，也可以在自然光照下放置；所述避光下放置的时间为5～12h，所述自然光照下放置的时间为5～15min。本申请的色氨酸衍生物作为凝胶因子，其中含有苯环可以提供π-π堆积，氮原子氧原子等可以形成氢键，分子间还存在范德华力，疏水等非共价键作用力，因此在与银离子混合，放置后可组装形成含有银纳米粒子的复合水凝胶。
本发明还提供了银纳米粒子复合水凝胶，其由如式(I)所示或如式(II)所示的的手性色氨酸衍生物和银盐制备得到；
Figure BDA0002390287110000051
本申请所述银纳米粒子复合水凝胶具有纳米纤维网络结构；其是由上述手性色氨酸衍生物L-HAIP或D-HAIP和银盐制备得到，而外消旋体(L+D)-HAIP与银盐不能形成凝胶。
本申请还提供了上述方法制备的银纳米粒子复合水凝胶在制备抗菌药物中的应用。
上述银纳米粒子复合水凝胶主要是对大肠杆菌或白色葡萄球菌具有较好的抗菌效果。
在制备银纳米粒子复合水凝胶的过程中，本发明使用的水凝胶因子为L-HAIP或D-HAIP，与硝酸银混合后，通过非共价键自组装得到的Ag NPs-HAIP复合水凝胶呈纳米纤维网络结构。该水凝胶在自然光的作用下，原位合成尺寸均匀银纳米粒子。该体系具有很好的抗菌性能。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的银纳米粒子复合水凝胶进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1
分别称取L-HAIP(或D-HAIP)样品10mg，配制成1mL的L-HAIP(或D-HAIP)水溶液，溶液无色透明；配制0.2M的AgNO3水溶液；
分别移取上述L-HAIP(或D-HAIP)水溶液195μL，调溶液pH 8～9，在其中加入5μLAgNO3水溶液，在玻璃瓶中混合，避光放置；结果发现上述混合物约10小时后形成黄色的AgNPs-HAIP复合水凝胶。
实施例2
分别称取L-HAIP(或D-HAIP)样品10mg，配制成1mL的L-HAIP(或D-HAIP)水溶液，溶液无色透明；配制0.2M的AgNO3水溶液；
移取上述L-HAIP(或D-HAIP)水溶液195μL，调溶液pH 8～9，在其中加入5μLAgNO3水溶液，在玻璃瓶中混合，自然光照射；结果发现上述混合物约5分钟后形成黄色的Ag NPs-HAIP复合水凝胶，如图1。
通过实施例1和2比较发现，光可以加速银纳米粒子的形成。
实施例3
分别配制不同浓度的L-HAIP(或D-HAIP)(2～10mg/mL)，按照实施例2的制备，发现这些体系都可以形成黄色的Ag NPs-HAIP复合水凝胶。
通过该实施例可以看出，形成Ag NPs-HAIP复合水凝胶所需的最小HAIP的浓度是2mg/mL。
实施例4
分别配制浓度为5mg/mL的L-HAIP和D-HAIP水溶液，将二者等体积混合保持总体积是195μL。根据实施例2的方法制备，发现这个体系都不能形成水凝胶，说明HAIP的外消旋体溶液和硝酸银的混合体系不能形成凝胶。
实施例5
将实施例2得到的凝胶震摇，凝胶垮塌，当静置凝胶恢复(如图2a-2b)；将实施例2得到的凝胶吸入注射器，然后推出，推出后的溶胶没有发生流动，迅速恢复至凝胶状态(如图2c-2d)；将实施例2得到的凝胶进行分步时间流变实验(如图3)。上述实验现象表明该凝胶有机械响应性和可注射性。
实施例6
将实施例2中的凝胶进行冷冻干燥，得到黄色粉末(干凝胶)。对干凝胶进行扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)(图4)、X射线光电子能谱分析(XPS)(图5)、X射线粉末衍射(XRD)测试(图6)。通过这些测试证实在该凝胶体系中有银纳米粒子存在。
实施例7
1)利用实施例2中的凝胶进行抗菌实验
选用大肠杆菌、白色葡萄球菌和金黄色葡萄球菌株来评估纳米银凝胶材料抗菌活性；
液体培养基的配置：在烧杯中加入100ml去离子水，分别加入1g胰蛋白胨0.5g酵母提取物和1g氯化钠，用玻璃棒搅拌溶解后，分别取5mL于培养管，用灭菌锅在120℃下灭菌30min；
固体培基的配置：在锥形瓶中加入100ml去离子水，分别加入1g胰蛋白胨、0.5g酵母提取物、1g氯化钠和2.4g琼脂粉，用玻璃棒搅拌溶解后，用灭菌锅在120℃下灭菌30min；
菌种的扩大培养：在用紫外灭完菌的操作台上加入10μL菌种于培养管，在恒温摇床(37℃220转/分钟)扩培8h；
2)平板实验
取3支含有5mL培养液的培养管，分别加入扩培好的菌液100μL后，再在另外两支培养管中加入200μL的凝胶因子和银凝胶材料；分别为空白组(单纯菌液)、凝胶因子组(菌液和凝胶因子)和银凝胶组(菌液和银凝胶材料)；将三支培养管放置于恒温摇床(37℃220转/分钟)培养3h；
涂板：在紫外灯下灭完菌的操作台上，将锥形瓶中已加热溶解的固体培养基适量倒入到三个培养皿(已灭菌)中，待培养基冷却凝固后，分别在3组培养管中取100μL的混合液均匀地涂抹在固体培养皿上后，置于恒温培养箱中37℃培养16h；结果如图7所示，由图7可知，Ag NPs-HAIP复合水凝胶对三种细菌都有一定的抑制作用，特别是对大肠杆菌和白色葡萄球菌由很好的抑制效果。
3)孔板实验
用酶标分析仪配置OD600nm＝0.1的菌液(用培养液稀释高浓度的菌液即可)；96孔板分为三组：空白组(单纯菌液)、凝胶因子组(菌液和凝胶因子)和银凝胶组(菌液和银凝胶材料)；
分别取150μL的菌液于三组孔板中，再分别添加等量的材料加入凝胶因子和银凝胶组，将孔板置于37℃恒温摇床培养24h，每隔6h用酶标仪检测吸光度600nm处的OD值，结果如图8所示，由图8可知，Ag NPs-HAIP复合水凝胶对三种细菌都有一定的抑制作用，特别是对大肠杆菌和白色葡萄球菌有很好的抑制效果。
实施例8 MTT细胞毒性实验(采用实施例2制备的凝胶)
细胞的准备：将冻存的乳腺癌细胞复苏培养，分为如实施例7中的三个对照组；
取100μL含细胞的培养液至每个组每个孔中，重复铺板4次且保持每个孔接种细胞数或者密度一致，其中材料的加入量分别为2μL(也可以取1-10μL检测相容性和耐受程度)；
分别在第二天和第三天开始，取配置好的MTT溶液(5mg/mL)5μL于孔板中继续在细胞培养箱中培养；培养4h后，吸取孔板中上层液体(细胞贴壁生长无影响)，向96孔板中加入150μL DMSO溶解细胞中的甲瓒颗粒；震荡摇匀10分钟后使甲瓒颗粒完全溶解后，将96孔板放置于酶标仪中检测490nm处的OD值，结果如图9所示，由图9可知，Ag NPs-HAIP复合水凝胶对乳腺癌细胞几乎无毒性，说明其有很好的生物相容性。
对比实施例
①配制2～10mg/mL的HAIP水溶液，无色透明；
②配制200mM的AgNO3水溶液，无色透明，避光保存；
③取200微升2mg/mL①溶液于玻璃瓶中，调溶液的pH 8～9，在其中加入1微升②，混合均匀，自然光照，可以形成黄色凝胶；
④取200微升10mg/mL①溶液于玻璃瓶中，调溶液的pH 8～9，在其中加入一定量(1～15微升)②，混合均匀，避光放置；
⑤取200微升10mg/mL①溶液于玻璃瓶中，调溶液的pH 8～9，在其中加入一定量1～15微升)②，混合均匀，自然光照；
比较⑤和④发现二者都可以形成黄色的Ag NPs-HAIP复合水凝胶，但避光需要几小时，⑤只需要几分钟。
相同条件下，单独的L-HAIP或D-HAIP与AgNO3可以形成凝胶，外消旋体(L+D)-HAIP与AgNO3不能形成凝胶。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种银纳米粒子复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将如式(Ⅰ)所示或如式(Ⅱ)所示的手性色氨酸衍生物的水溶液调节pH至8～9，再与银盐的水溶液混合，放置后得到银纳米粒子复合水凝胶；
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述银盐为硝酸银。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述放置在避光下放置或在自然光照下放置。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述避光下放置的时间为5～12h，所述自然光照下放置的时间为5～15min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述手性色氨酸衍生物的水溶液的浓度为2～10mg/mL。
6.一种银纳米粒子复合水凝胶，由如式(Ⅰ)所示或如式(Ⅱ)所示的手性色氨酸衍生物和银盐制备得到；
7.根据权利要求6所述的银纳米粒子复合水凝胶，其特征在于，所述银纳米粒子复合水凝胶具有纳米纤维网络结构。
8.权利要求1～5任一项所述的制备方法所制备的银纳米粒子复合水凝胶或权利要求6～7任一项所述的银纳米粒子复合水凝胶在制备抗菌药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗菌药物的菌种为大肠杆菌或白色葡萄球菌。
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Title
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