CN109730964A

CN109730964A - 一种微环境响应型交联季铵盐胶束抗菌剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109730964A
Application number: CN201910094753.6A
Authority: CN
Inventors: 张仕勇; 刘访琴; 贺登峰; 于云龙
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2019-05-10
Anticipated expiration: 2039-01-31
Also published as: CN109730964B

Abstract

本发明公开了一种微环境响应型交联季铵盐胶束抗菌剂及其制备方法和应用，属于生物医学材料领域。所述交联胶束可以很好地穿透并集中在生物膜底部，在进入生物膜后交联胶束可以进行环境响应发生解离，得到季铵盐寡聚物，这些寡聚物通过多价杀菌可以实现优于单体的抗菌效果。此外，对于季铵盐来说自由长烷基链是产生毒性的主要原因，交联胶束得益于长烷基链稳定的束缚在空腔内，很好的改善了季铵盐的毒性。这种新型自治疗纳米抗菌剂优异的抗菌性及生物相容性使其具有良好的应用前景。

Description

一种微环境响应型交联季铵盐胶束抗菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学材料领域，具体涉及一种微环境响应型交联季铵盐胶束抗菌剂及其制备方法和应用。

技术背景

目前临床上超过80%的细菌感染被认为是由生物膜引起的，生物膜是细菌不可逆的吸附在材料或组织上，并且封装在自产生的胞外聚合物(extracellular polymericsubstances，EPS)中。EPS的基本组成是胞外多糖，蛋白质，DNA和各种酶，EPS对抗菌剂会产生吸附，酶解，从而使得生物膜对抗菌剂产生耐药性，因此生物膜的耐药性是临床上急需解决的重要问题。近年来越来越多的报道将纳米粒子作为一种新的治疗手段，使其可以很好的克服小分子抗菌剂对生物膜穿透性差的问题，这归因于纳米粒子有高的表面体积比及物理化学性质灵活的可控性。目前纳米粒子抗菌剂主要分为以下两类：首先是金属及其复合物，比如说ZnO、蚕丝蛋白-Ag复合物。这些纳米粒子有良好的抗生物膜性能，但高毒性是阻碍其实际应用的关键问题；其次是各种纳米粒子载体递送系统，比如聚合物，脂质体，二氧化硅等纳米粒子递送各种抗生素，植物素，季铵盐，光动光热试剂等抗菌剂。这些纳米粒子不仅可以实现递送，还可以通过敏感响应实现按需抗菌，所以这些纳米粒子递送系统被认为是目前较有前途的抗菌策略。但是，理想的载体设计需要满足严苛的条件，比如说生物可降解性，低毒性，有足够的包载量等，更重要的是，大部分这些载体自身不发挥抗菌作用，实现递送后成为资源浪费。因此，开发克服以上体系存在的问题的新型抗菌纳米粒子新体系是有很好的应用前景的。

季铵盐是一类优异的两亲性抗菌剂。它的抗菌机理是通过阳离子氮吸附到细菌表面，非极性尾链穿透细胞膜，最终导致膜内营养物质流出，死亡。这种类似于抗菌肽的两亲性结构使得季铵盐抗菌剂有广阔的应用前景。据报道两亲性季铵盐类抗菌剂在很多情况下浓度是在临界胶束浓度（CMC）以上组装成纳米粒子形式与细菌通过多价相互作用吸附的，这可以增强季铵盐与细菌作用的局部电荷，使季铵盐具有优异的抗菌性能。不幸的是，当季铵盐与生物膜接触时，它会通过与带负电荷的EPS基质结合而降低穿透性。这就导致能够有效消灭浮游细菌的普通季铵盐对生物膜细菌的杀灭能力可能会降低200倍。此外，季铵盐的生物相容性也是一个大问题。高溶血率使季铵盐难以应用于临床。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种微环境响应型交联季铵盐胶束抗菌剂，所述交联季铵盐胶束可以响应细菌的微环境解离得到片段，具有优异的抗菌性。此外，这些交联胶束可以很好地穿透并集中在生物膜底部，在进入生物膜后交联胶束可以进行生物膜环境响应发生解离，解离得到季铵盐寡聚物，这些寡聚物通过多价杀菌可以实现优于单体的抗菌效果。此外，对于季铵盐来说自由长烷基链是产生毒性的主要原因，交联胶束得益于长烷基链稳定的束缚在空腔内，很好的改善了季铵盐的毒性。这种新型自治疗纳米粒子抗菌剂不仅具有优异的抗生物膜性能与生物相容性，而且在一定程度克服现有纳米粒子体系存在的问题，具有良好的应用前景。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种微环境响应型交联胶束抗菌剂，其特征在于，所述交联胶束由两亲性季铵盐分子形成胶束，并通过交联键交联稳定，所述交联胶束能够在细菌和/或生物膜的微环境下发生解离得到部分寡聚物片段。通过交联稳定，既有利于胶束顺利穿透生物膜，又有利于将季铵盐两亲性分子中的长碳链稳定的束缚在空腔内，从而改善季铵盐的毒性。部分解离产物以寡聚物形式存在有利用提高抗菌效果。

作为可选方式，在上述抗菌剂中，所述交联胶束表面带有一圈正电荷。带正电荷有利于所述交联胶束通过多价相互作用吸附与生物膜结合。

作为可选方式，在上述抗菌剂中，所述交联键能够在细菌及生物膜的微环境发生断裂。

作为可选方式，在上述抗菌剂中，所述季铵盐两亲性分子单体的结构如下：

其中，R1、R2、R3、R4为非极性尾链，R1、R2、R3、R4中至少有两个含具有交联活性的末端，所述具有交联活性的末端能够与其他季铵盐两亲性分子单体的非极性尾链发生交联，且形成的交联键能够在细菌及生物膜的微环境发生断裂。

作为可选方式，在上述抗菌剂中，所述交联键是能响应细菌及生物膜微环境的化学键，如酶敏感键、还原敏感键、酸敏感键中的至少一种。

作为可选方式，在上述交联胶束中，所述酶敏感键为能响应酶的酯键或酰胺键，所述还原敏感键为二硫键、二硒键、琥珀酰亚胺-硫醚键中的至少一种，所述酸敏感键为酯键、缩醛、酰胺键。

作为可选方式，在上述交联胶束中，所述交联键为以下敏感键中的至少一种：

其中，R_a, R_b, R_c, R_d, R_e, R_f, R_g, R_h, R_i, R_j的结构通式为：。

作为可选方式，在上述交联胶束中，所述季铵盐两亲性分子单体具体为：。

本发明还提供了一种上述基于季铵盐两亲性分子的交联胶束的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）获取季铵盐两亲性分子单体；（2）制备未交联胶束；（3）对步骤（2）中所得的交联胶束进行交联。

作为可选方式，在上述制备方法中，步骤（1）中所述季铵盐两亲性分子单体采用以下方法制备：首先通过烷基化得到非极性尾链，再通过取代反应得到卤代烷，最后通过季铵化反应得到季铵盐单体。

作为可选方式，在上述制备方法中，所述步骤（3）的交联方法具体为：化学交联或光交联或热交联。

本发明还提供了一种上述基于季铵盐两亲性分子的交联胶束在抗菌剂中的应用。

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本发明的有益效果：

1.本发明通过交联使季铵盐胶束结构稳定的进入生物膜，发挥纳米粒子抗生物膜的优势。

2.设计的纳米粒子结构是一个自递送系统，递送系统自身发挥抗生物膜效果。

3.得到的交联胶束具有双重多价效应，首先纳米粒子自身表面带一圈正电荷，和细菌可以实现多价吸附，其次交联胶束在微环境条件下解离后得到寡聚物片段，可以进一步实现多价抗菌，具有比未交联胶束更好的抗菌性。

4.对于两亲性抗菌剂而言，疏水链是产生毒性的重要因素，交联可以将疏水链很好的束缚在空腔内，可以很好的提高抗菌剂的生物相容性，进一步应用。

5.通过交联敏感键的设计，可以响应普通浮游菌及生物膜的微环境实现季铵盐抗菌剂的按需（On demand）释放。

附图说明：

图1为实施例1 所述材料基本物化性质表征结果。

图2为实施例1所述材料CMC表征结果。

图3为实施例1所述交联前后纳米粒子氢谱核磁表征结果。

图4为实施例1所述交联胶束打断后片段表征结果；其中A、B、C代表不同二聚体结构的特征峰；D代表三聚体结构的特征峰；E、F代表不同四聚体结构的特征峰。G、H代表不同五聚体结构的特征峰，其结构式分别为：

A：

B：

C：

D：

E：

F：

G:

H：。

图5为实施例1所述交联前后纳米粒子在不同pH条件下的抗金黄色葡萄球菌性能

图6为实施例1所述交联前后纳米粒子抗大肠杆菌性能

图7为实施例1所述交联前后处理金黄色葡萄球菌生物膜的渗透情况

图8为实施例1所述交联前后材料移除生物膜效果表征结果；

图9为实施例1所述交联前后材料生物相容性表征结果；

图10为本发明所述交联胶束的交联和解离示意图，其中m、 n不等于0，m<n。

具体实施方式：

以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应当将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明的精神和原则之内做的任何修改，以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改进，均应包括在本发明的保护范围内。

实施例1 一种能在脂肪酶和PH5.0条件下解离的交联胶束抗菌剂

1. 季铵盐单体的合成

具体合成路线如下：

（1）化合物5的制备：在室温下，将4-羟基苯甲醛(1.22 g, 10 mmol)与二甲甲酰胺(DMF, 30 mL)溶液中加入化合物碳酸钾(8.27 g, 60 mmol)。在60 摄氏度下搅拌1 h后，慢慢加入1-溴十二烷(2.9 mL, 12 mmol)。反应混合物在80摄氏度下搅拌过夜，冷却至室温，倒入70 mL冰水中。混合物用氯仿萃取(3×20 mL)。合并后的有机相是用盐水洗净(3×10mL),用无水MgSO₄干燥和减压蒸馏得到黄色液体。

（2）化合物4的制备：化合物 5 (2 g, 7.0 mmol)的四氢呋喃(THF, 16 mL)溶液，在0摄氏度时逐滴加入NaBH₄ (0.54 g, 14 mmol)的THF搅拌悬浮液中，反应混合物在室温下搅拌过夜，用少量的水(1.2 mL)淬火。残渣溶解在CH₂Cl₂(20 ml)中。溶液是用饱和食盐水洗净(3×10 mL),无水Na₂SO₄干燥和旋干得到白色粉末(1.76 g,86.0%)。

(3) 化合物3的制备：将PBr₃ (1.0 mL, 10 mmol) 的无水CH₂Cl₂ (12.5 mL)溶液缓慢加入CH₂Cl₂ (25 mL)中化合物 4 (1.5 g, 5 mmol)中，反应混合物在室温下搅拌3小时，慢慢倒入大量的水(300 mL)。产品用二氯甲烷萃取(3×25 mL)。有机相用盐水洗净(3×10 mL),在无水Na₂SO₄干,旋干得到黄色的固体(1.34 g,75.4%)。

（4）化合物2的制备：在含有三乙胺(6.8 g, 67.2 mmol)的40 mL干CH₂Cl₂溶液中，滴加2.4 g丙烯酰氯(4.56 g, 52.0 mmol)。反应混合物在室温下搅拌24小时，然后旋转蒸发除去溶剂。通过硅胶(石油醚:乙酸乙酯= 5:1)柱层析纯化后，得到2为澄清油状(2.32 g,60.7%)。

（5）化合物1的制备：将化合物 3 (1.0 g, 4.48 mmol)的无水CH₃CN (20 mL)溶液缓慢加入搅拌着的化合物2 (1.5 g, 4.48 mmol)的CH₃CN (30 mL)中。反应混合物在室温下搅拌48h。溶剂通过旋转蒸发除去。通过硅胶柱层析(CH₂Cl₂: CH₃OH = 20:1)纯化后得到1个白色固体(0.88 g, 33.7%)。

2. 季铵盐自组装胶束及交联胶束的制备

11.76毫克化合物1溶解在5毫升去离子水中，超声使其基本完全溶解，得到未交联胶束。接下来，加入10微升提前配置的36毫克每200微升的PI2959的甲醇溶液，再称取3.08毫克DTT加入溶液中，再在254纳米的光反应器中光照4小时，随后将溶液转移到1000 kDa 的透析袋中，在室温下透析36小时得到交联胶束。动态光散射（DLS）测试结果（参见附图1）显示：得到的交联胶束尺寸为33.3 nm, 电位为34.4 mV.

3. CMC的测定

一定量尼罗红的二氯甲烷溶液加到小瓶中，然后将二氯甲烷挥发干净，随后一系列化合物1加到小瓶中，再加去离子水将样品溶解得到浓度范围为2-1024微摩的材料浓度，并且尼罗红的最终浓度为1 × 10^-6 M 。再将样品在37摄氏度摇床中过夜，然后在525纳米测定尼罗红的荧光强度。CMC是荧光强度随浓度变化的两条线性部分的交叉点。结果显示：CMC为32.0 μg/mL。（CMC是形成胶束的基本条件，胶束的形成与抗菌性息息相关，后面测得的交联胶束的抗菌浓度低于CMC，说明交联后的胶束抗菌性不再受CMC限制。）

4．交联胶束的稀释稳定性

通过稀释纳米粒子至CMC以下测DLS的变化。首先纳米粒子稀释至浓度为 250.0,125.0, 62.5, 31.3, 15.6, and 7.8 μg/mL. 随后，通过测定纳米粒子的尺寸和PDI判断其稳定性。结果显示：交联胶束是很稳定的，在浓度低于CMC时,尺寸和PDI也未发生明显改变。

5．交联胶束在脂肪酶和pH 5.0条件下的解离

37 °C下，20 μg/ml交联胶束在100微克每毫升CALB和0.02摩尔每升pH 5.0醋酸缓冲液条件下解离。在设定的时间内交联胶束的粒径和粒子数用动态光散射仪测定。与pH 7.4的PBS孵育的纳米粒子的粒径及粒子数作为对照。结果显示：交联胶束在酸和脂肪酶的条件下可以很好的解离。

6. 不同条件下交联前后胶束最低抑菌浓度 MIC 测定。

采用微量稀释法测定了交联胶束 QAS@CMs 与未交联胶束 free QAS对金黄色葡萄球菌(ATCC29213)的最低抑菌浓度 (MIC)。首先, 从固体LB琼脂板上分别取出一株金黄色葡萄球菌, 加到3毫升LB培养基中,在37摄氏度摇床中摇4h。然后用pH=7.4 LB 培养基将细菌悬浮液稀释为10⁶ CFU/毫升。然后将 QAS@CMs或free QAS与稀释后的细菌悬浮液等体积量混合, 使其对金黄色葡萄球菌最终浓度为35、30、25、20、15微克/毫升。在一定时间间隔测定OD₆₀₀值。采用对应量的去离子水处理的样品作为相应的对照组, MIC值即为肉眼可见未见浑浊的浓度，同样的过程当大肠杆菌作为细菌时重复。pH=5.0的LB培养基重复上面的过程测得QAS@CMs和free QAS在pH为5.0时的MIC。每次试验重复三次。结果显示：QAS@CM对脂肪酶分泌足量的细菌金黄色葡萄球菌在pH=7.4时的MIC为25微克每毫升，在pH=5.0时的MIC可以降至20微克每毫升，而free QAS的MIC均为30微克每毫升。并且QAS@CM对脂肪酶分泌不足的大肠杆菌未体现出抗菌性。

7. 装载尼罗红：50微升 1毫克每毫升的尼罗红的二氯甲烷溶液加到小瓶中，将二氯甲烷挥干，随后5毫升制备好的QAS@CM加入，超声使尼罗红溶解。free QAS包载同上。最后，样品在37摄氏度震荡过夜。同时，生物膜制备，稳定期细菌稀释至10⁸CFU/mL, 100微升稀释的菌液加到含玻璃片的24孔板中吸附1小时，再在37摄氏度培养3天，用PBS洗3次,再将生物膜和100微克/毫升材料孵育1小时，随后用PBS洗3次，再与30 μL 1 μM Syto9。激光共聚焦成像的发射波长在488nm和543nm,不同生物膜深度的荧光强度通过公式归一化。结果显示：QAS@CM的荧光主要集中于生物膜底部，而free QAS的荧光主要存在于生物膜表面，说明QAS@CM可以以稳定的纳米粒子形式穿透进生物膜底部，而free QAS由于结构不稳定，不能很好的渗透至生物膜底部。

8．交联前后胶束抗生物膜效果评估

金黄色葡萄球菌(ATCC29213)用于此研究。对于移除生物膜研究，200微升细菌悬浮液（10⁸CFU/mL) 加到96孔板中在37 °C培养箱中孵育2小时随后移除悬浮液，再用PBS洗三次，再加入200微升新鲜TSB培养基再孵育24小时，然后再用含一定浓度QAS@CM或free QAS的培养基替换（150, 125, 100, 75, 50, 25微克每毫升）。最后，移除悬浮液用PBS洗三次，再用结晶紫，SEM, CLSM进行评估。结果显示：free QAS在浓度高达125微克每毫升时才能移除80%的生物膜。而QAS@CM在50微克每毫升时即可达到同样的效果。从SEM可以看到QAS@CM可以很好的破坏生物膜的结构，并杀死生物膜内的细菌。而未交联胶束对生物膜的底层破坏能力很差，说明QAS@CM可以稳定的穿透生物膜，并且在生物膜酸环境下解离得到的片段具有更好的杀菌性能。

9．交联前后胶束溶血性评估

新鲜的血细胞在3500 rpm下离心5min,得到分离的血浆和红细胞。上清液弃去，得到的红细胞用pH 7.4的生理盐水洗2次，再在生理盐水中再悬浮的到10%的红细胞。然后将950ul不同浓度（700, 600, 500, 400, 50, 25, 12.5, 6.3, 3.1,和 1.5 微克每毫升）的交联前后胶束加到50ul 血细胞悬浮液中，在37 ℃条件下孵育2小时。生理盐水和蒸馏水分别作为阴性对照和阳性对照。孵育完后，在1500 rpm下离心10min ,上清液为红色的说明溶血，上清液无色的说明不溶血。另外，测定上清液在542 nm的紫外吸收计算溶血率。溶血率的计算公式为(A_样品-A_阴性)/(A_阳性-A_阴性)× 100%。结果显示：自由季铵盐在3.1微克每毫升的条件下即产生了溶血，而QAS@CM在500微克每毫升才产生了一定的溶血性。说明QAS@CM由于疏水链被束缚在空腔内可以很好的提高生物相容性。

实施例2 一种能在脂肪酶条件下解离的交联胶束抗菌剂

1. 季铵盐单体制备见实施例1

2. 季铵盐交联胶束的制备

11.76毫克化合物1溶解在5毫升去离子水中，超声使其基本完全溶解，得到未交联胶束。接下来，加入10微升提前配置的36毫克每200微升的PI2959的甲醇溶液，再在254纳米的光反应器中光照4小时，随后将溶液转移到1000 kDa 的透析袋中，在室温下透析36小时得到交联胶束。

3. 所得交联胶束的性能表征

得到的交联胶束尺寸为30.2 nm, 电位为44.5 mV, 在pH 7.4条件下对金黄色葡萄球菌MIC为35微克每毫升，在pH=5.0时的MIC可以降至25微克每毫升，移除80%生物所需的浓度为55 μg/mL。

实施例3 一种能在还原条件下解离的交联胶束抗菌剂

1. 单体的获取或制备

化合物3以前的制备过程见实施例1

化合物2的制备：二羧酸（176.75 mg,0.97 mmol）, n -羟基丁二酰亚胺(HOSU, 138mg, 1.2 mmol, 1,3-二环己基羧化亚胺(DCC, 247 mg, 1.2 mmol)溶于7ml的四氢呋喃。在常温氮气氛下搅拌6小时。通过过滤除去沉淀，将滤液在减压条件下浓缩,提纯得到淡黄色粉末(211毫克，72%).

化合物1的制备：化合物3 (461.97 mg, 1.3 mmol)和K₂CO₃ (539 mg, 3.9 mmol)溶于CH₃CN (10 mL)，N-甲基-二（乙基叠氮）(219.95 mg, 1.3 mmol)溶于CHCl₃ (15 mL)。反应混合物回流3天。固体经过滤除去，滤液集中在真空中。以石油醚:乙酸乙酯= 20:1为洗脱剂，硅胶柱层析纯化出黄色油状液体。再将Ph₃P (2.58 g, 9.84 mmol)溶于上述油状液体(729.11 mg, 1.64 mmol)、四氢呋喃(THF) (30 mL)和水(3 mL)的溶液中。反应混合物在80°C搅拌8 h。溶剂被旋转蒸发后,残留物被在硅胶柱层析法纯化使用以二氯甲烷:甲醇:三乙胺 = 6:1:0.1作为洗脱液得到黄色油状化合物。

2. 季铵盐交联胶束的制备

化合物2（18.8 mg, 0.5 μmol）和化合物1（溶解在1毫升二甲亚砜中，缓慢加入1毫升化合物1（23.63 mg, 0.5 μmol）的水溶液，在氮气下搅拌16小时，过柱得到黄色固体，再称取10mg溶于5mL水中。

3. 所得交联胶束的性能表征

得到的交联胶束尺寸为39.4 nm, 电位为41.8 mV, 在pH 7.4条件下对金黄色葡萄球菌MIC为25微克每毫升，在pH=5.0时的MIC可以降至20微克每毫升，移除80%生物所需的浓度为40 μg/mL。

实施例4 一种能在酸性条件下解离的交联胶束抗菌剂单体的获取或制备

化合物1的制备：6 mL丙酮溶液中含丙炔胺(0.85 mL, 9 mmol)，缓慢加入化合物3(3.01 g, 8.5 mmol)的10 mL丙酮溶液中。室温下反应3d，将丙酮在真空中去除，以CH₂Cl₂ /MeOH = 20/1 ~ 10/1的硅胶柱色谱法纯化残渣，洗脱出白色粉末。

化合物2的制备：将2-溴乙醇(5.0 mL, 6.6 mol)、2,2-二甲氧基丙烷(4.0 mL,3.0 mol)、苯(16 mL)和对甲苯磺酸(5.0 mg)的混合物放入装有分馏头的50 mL圆底烧瓶中。混合物用油浴加热。当馏分在62-65摄氏度开始蒸馏时，油浴被除去，混合物冷却到室温。在搅拌下快速加入0.1 g甲醇钠溶液(2 mL)。继续蒸馏，收集80-83 ^oC的馏分。粗产物为2-溴乙醇与期望产物的50:50混合物，经¹H NMR光谱测定，未进一步纯化进行下一步。将粗产物(2.32 g,5.6 mmol)、叠氮化钠(5.2 g, 80 mmol)和DMF(20 mL)在80°C下搅拌10 h。混合物倾倒入水中并用己烷萃取(3×50 mL)。结合有机阶段用盐水洗净,干燥无水Na₂SO₄,集中在真空给一个黄色的油(0.87 g, 73%)

2. 季铵盐交联胶束的制备

化合物2 (4.3 mg, 0.02 mmol) CuCl₂(10 μL 6.7 mg/mL,0.5 μmol),和抗坏血酸钠(10 μL 99 mg/mL,5 μmol)被添加到化合物1 (9.7 mg, 0.02 mmol)在2 mL 无菌水中。在炔丙基醇(0.6 μL)加进去之前，反应混合物在室温下搅拌缓慢了24小时。12小时后，再用500 da分子量的透析袋进行透析。

3. 所得交联胶束的性能表征

得到的交联胶束尺寸为21.5 nm,电位为37.4 mV, 在pH 7.4条件下对金黄色葡萄球菌MIC为大于250 μg/ml，在pH=5.0时的MIC可以降至35微克每毫升移除80%生物膜所需的浓度为55 μg/mL.

实施例5 通过单一敏感键交联得到的敏感交联胶束

具体合成路线：

1. 化合物3以前的制备见实施例1

化合物1的制备：将化合物 3 (1.0 g, 4.48 mmol)的无水CH₃CN (20 mL)溶液缓慢加入搅拌着的化合物2 (0.65 g, 4.48 mmol)的CH₃CN (30 mL)中。反应混合物在室温下搅拌48 h。溶剂通过旋转蒸发除去。通过硅胶柱层析(CH₂Cl₂: CH₃OH = 20:1)纯化后得到1个白色固体(1.09 g, 48.2%)。

2. 季铵盐自组装胶束及交联胶束的制备

9.97毫克化合物1溶解在5毫升去离子水中，超声使其基本完全溶解，得到未交联胶束。接下来，加入10微升提前配置的36毫克每200微升的PI2959的甲醇溶液，再称取1.54毫克DTT加入溶液中，再在254纳米的光反应器中光照4小时，随后将溶液转移到1000 kDa 的透析袋中，在室温下透析36小时得到交联胶束。

3. 所得交联胶束的性能表征

得到的交联胶束尺寸为21.5 nm,电位为37.4 mV, 在pH 7.4条件下对金黄色葡萄球菌MIC为20微克每毫升，在pH=5.0时的MIC可以降至15微克每毫升, 移除80%生物膜所需的浓度为40 μg/mL.

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围。

Claims

1.一种微环境响应型交联胶束抗菌剂，其特征在于，所述交联胶束由两亲性季铵盐分子形成胶束，并通过交联键交联稳定，所述交联胶束能够在细菌和/或生物膜的微环境作用下发生解离得到部分寡聚物片段。

2.根据权利要求1所述的抗菌剂，其特征在于，所述交联胶束表面带有一圈正电荷。

3.根据权利要求1所述的抗菌剂，其特征在于，所述交联键能够在细菌及生物膜的微环境发生断裂。

4.根据权利要求3所述的抗菌剂，其特征在于，所述交联键是能响应细菌及生物膜微环境的化学键。

5.根据权利要求4所述的抗菌剂，其特征在于，所述交联键是酶敏感键、还原敏感键、酸敏感键中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的抗菌剂，其特征在于，所述两亲性季铵盐分子单体的结构如下：

其中，R₁、R₂、R₃、R₄为非极性尾链，R₁、R₂、R₃、R₄中至少有一个含具有交联活性的末端，所述具有交联活性的末端能够与其他季铵盐两亲性分子单体的非极性尾链发生交联，且形成的交联键能够在细菌及生物膜的微环境发生断裂。

7.根据权利要求1所述的抗菌剂，其特征在于，所述季铵盐两亲性分子单体具体为：。

8.一种如权利要求1所述的微环境响应型交联胶束抗菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）获取季铵盐两亲性分子单体；（2）制备未交联胶束；（3）对步骤（2）中所得的胶束进行交联。

9.根据权利要求1所述的微环境响应型交联胶束抗菌剂在抗浮游菌中的应用。

10.根据权利要求1所述的微环境响应型交联胶束抗菌剂在抗生物膜中的应用。