CN102675674A

CN102675674A - 一种溶菌酶与香菇多糖硫酸酯自组装修饰的聚乳酸材料及其制备方法

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Publication number: CN102675674A
Application number: CN201210139806XA
Authority: CN
Inventors: 陈艳军; 连鑫鑫; 王艺峰; 王燕梅; 熊燕飞
Original assignee: Wuhan University of Technology WUT
Current assignee: Wuhan University of Technology WUT
Priority date: 2012-05-08
Filing date: 2012-05-08
Publication date: 2012-09-19

Abstract

本发明属于生物医用材料和生物大分子自组装技术领域，特别是涉及一种溶菌酶与香菇多糖硫酸酯自组装修饰的聚乳酸材料及其制备方法。溶菌酶与香菇多糖硫酸酯自组装修饰的聚乳酸材料，它由基材和修饰层组成，基材由表面氨基化的聚乳酸材料构成，修饰层是在该基材的表面利用层层自组装技术进行表面修饰而得到；其中，修饰层中含有在基材表面交替层层自组装的溶菌酶和香菇多糖硫酸酯。该方法制备的聚乳酸材料的表面具有良好的抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性，该材料表面的血液相容性也得到改善，同时，该材料的制备方法工艺简单，易于控制，制备条件温和，成本低廉。

Description

一种溶菌酶与香菇多糖硫酸酯自组装修饰的聚乳酸材料及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医用材料和生物大分子自组装技术领域，特别是涉及一种溶菌酶与香菇多糖硫酸酯自组装修饰的聚乳酸材料及其制备方法。

背景技术

目前，聚乳酸材料已经成为生物医用材料中最受重视的材料之一，并且被广泛应用于组织工程支架、医用缝合线、药物控制释放载体等生物医用材料领域。然而，聚乳酸材料表面缺少生物活性基团，从而降低了其对生物体的相容性能。此外，普通的生物材料本身不具有抗菌性，植入人体后材料表面会出现细菌的黏附和繁殖，从而引发机体组织发生病变，这是导致相关组织感染和植入手术的失败的主要原因[Biomaterials, 1998, 19(7～9):851～859]。因此，如果使生物材料表面具有较好生物相容性的同时还具有抗菌活性，就能对植入材料引起的术后感染及其并发症起到有效控制和预防作用。

常用的生物材料表面修饰方法有表面化学接枝修饰、等离子表面改性以及表面层层自组装修饰等。近年来, 材料表面层层自组装的研究引起了人们的广泛关注，层层自组装技术（Layer-by-Layer self-assemble, LbL）是基于聚电解质阴阳离子所带正负电荷间相互作用的一种自组装超分子技术。该技术与其它生物材料表面修饰技术相比，具有一系列优点，例如：操作简单，制备条件温和，自组装分子的选择范围广泛等[Advanced Materials, 2006, 18, 3203]。并且，该方法可在常温水溶液中进行，因而有利于保持生物大分子的天然构象和生物活性。因此，该技术已成为生物医用材料表面功能设计的有效手段。

生物多糖是一种广泛存在于生物体中，具有特殊生理活性以及良好生物相容性的一类物质。目前，将生物多糖类物质固定在材料表面是改善生物医用材料的生物相容性和表面生物性能最为有效的途径之一。值得注意的是，在为数众多的生物多糖中，香菇多糖表现出十分显著的抗肿瘤、免疫调节、抗病毒、抗菌等多方面的生物活性[Applied Microbiology and Biotechnology, 2002, 60(3):258～274]。

此外，溶菌酶（lysozyme）是一种天然的抑菌剂，它广泛存在于人体的多种组织器官以及血液、汗液等分泌物中。这种酶是一种专门作用于微生物细胞壁的糖苷水解酶，它能通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸（NAM）的1位碳原子和N-乙酰葡萄糖胺（NAG）的4位碳原子间的β-1,4糖苷键，使细菌的细胞壁分解，从而起到抑制细菌活性的作用[Bioprocess and Biosystems Engineering, 2009, 32:633～639]。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种溶菌酶与香菇多糖硫酸酯自组装修饰的聚乳酸材料及其制备方法，该方法制备的聚乳酸材料的表面具有良好的抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性，该材料表面的血液相容性也得到改善；同时该材料制备工艺较简单，反应迅速，易于控制，成本较低廉。

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：

一种溶菌酶与香菇多糖硫酸酯自组装修饰的聚乳酸材料，其特征在于：它由基材和修饰层组成，基材由表面氨基化的聚乳酸材料构成，修饰层是在所述基材的表面利用层层自组装技术进行表面修饰而得到；其中，修饰层中含有在所述基材表面交替层层自组装的溶菌酶和香菇多糖硫酸酯。

本发明先通过化学修饰方法制备香菇多糖硫酸酯，再利用氨基化反应使聚乳酸基材表面带上氨基基团，然后使基材表面带正电后，再通过表面层层自组装交替吸附溶菌酶和香菇多糖硫酸酯，从而构成修饰层；基材采用普通商用聚乳酸材料，其和修饰层构成所述的一种溶菌酶和香菇多糖硫酸酯自组装修饰的聚乳酸材料。

上述一种溶菌酶与香菇多糖硫酸酯自组装修饰的聚乳酸材料的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：

1）香菇多糖硫酸酯衍生物的制备：

按香菇多糖: 二甲基亚砜: 吡啶: 氯磺酸＝（0.6～1.2）g:（50～100）mL: （9～18）mL:（3.7～7.4）mL，选取香菇多糖、二甲基亚砜、吡啶和氯磺酸，备用；

将香菇多糖加入装有二甲基亚砜的反应容器中，在20～30℃下搅拌12～18小时，再以2～4mL/分钟的速度缓慢逐滴滴加吡啶，继续搅拌30～40分钟，然后将反应容器置于冰浴中，搅拌下用恒压漏斗以0.5～1mL/分钟的速度逐滴缓慢滴加氯磺酸，滴加完毕后升温至80℃继续搅拌反应100～120分钟，反应停止后冷却至室温，用质量百分数为1～10wt%的NaOH溶液调节pH至7.0，得到反应液；再将所得反应液注入再生纤维素透析袋中，在pH为10的NaOH溶液中透析12～18小时，再用自来水流水透析4～6天，蒸馏水透析3～5天，然后将透析液旋转蒸发浓缩，最后经过冷冻干燥，得到黄色粉末状的香菇多糖硫酸酯；

2)聚乳酸膜片的制备：

按聚乳酸: 二氯甲烷=（6～12）g:（45～90）mL，选取聚乳酸和二氯甲烷，首先将聚乳酸材料溶于二氯甲烷中，待搅拌完全溶解后将溶液倒入平底成膜盘内，在室温下干燥24～48小时，待溶剂完全挥发后，得到聚乳酸薄膜；

将上述聚乳酸薄膜切成圆形膜片，在体积比为1︰1的乙醇水溶液中搅拌清洗2～3小时，以除去表面的杂质，然后用大量的蒸馏水清洗，在40～50℃真空干燥24～48小时，得到聚乳酸膜片；

3）聚乳酸膜片表面氨基化：

按聚乳酸膜片: 含乙二胺的异丙醇溶液＝（4～8）g: 60mL，选取聚乳酸膜片和含乙二胺的异丙醇溶液，含乙二胺的异丙醇溶液的浓度为0.09g/mL；

将上述的聚乳酸膜片放入含乙二胺的异丙醇溶液中，在45～50℃下搅拌反应3～5分钟，得到表面带有氨基官能团的聚乳酸膜片，再用大量蒸馏水冲洗聚乳酸膜片，以除去其表面物理粘附的乙二胺，然后在室温下将表面带有氨基官能团的聚乳酸膜片用浓度为0.012mol/L的 HCl溶液浸泡15～30分钟，再用蒸馏水洗涤膜片4～8次，得到表面氨基化的聚乳酸膜片基材；

4）香菇多糖硫酸酯溶液、溶菌酶溶液的制备：

按溶菌酶:香菇多糖硫酸酯＝（1.0～2.0）mg:（1.0～2.0）mg，选取溶菌酶和香菇多糖硫酸酯；

将溶菌酶溶解于浓度为0.15mol/L 的NaCl溶液中，得到溶菌酶溶液，其中溶菌酶的浓度1.0～2.0 mg/mL；

将香菇多糖硫酸酯溶解于浓度为0.15mol/L 的NaCl溶液中，得到香菇多糖硫酸酯溶液，其中香菇多糖硫酸酯的浓度为1.0～2.0 mg/mL；

5）在聚乳酸表面进行溶菌酶和香菇多糖硫酸酯的层层自组装：

将上述步骤3）得到的表面氨基化的聚乳酸膜片基材加入到香菇多糖硫酸酯溶液中浸泡15～20分钟，然后分离出膜片用0.15mol/L NaCl溶液洗涤4～6次，制备出表面具有香菇多糖硫酸酯的膜片；

再将该膜片加入到溶菌酶溶液中浸泡15～20分钟，分离出膜片用0.15 mol/L NaCl溶液洗涤4～6次，然后再加入到香菇多糖硫酸酯溶液中浸泡15～20分钟，分离出膜片用0.15mol/L NaCl溶液洗涤4～6次，完成聚乳酸表面的第一个双分子层的自组装；按上述步骤，在溶菌酶溶液和香菇多糖硫酸酯溶液中分别交替自组装5次后，得到香菇多糖硫酸酯为最外层的含5个双分子层的表面层层自组装修饰的聚乳酸膜片，再用去离子水洗涤4～6次后，再将聚乳酸膜片在室温的条件下干燥24～48小时，得到一种溶菌酶和香菇多糖硫酸酯层层自组装修饰的聚乳酸材料；

本发明制备得到的一种溶菌酶与香菇多糖硫酸酯自组装修饰的聚乳酸材料应用于生物医用材料方面，特别适用于制备既具有良好生物相容性又具有抑菌抗感染作用的人造器官和装置的生物医用材料具有广泛的用途。

本发明一种溶菌酶与香菇多糖硫酸酯自组装修饰的聚乳酸材料，采用的层层自组装表面修饰的物质是溶菌酶和香菇多糖硫酸酯。因此，本发明采用的聚乳酸表面修饰物质均是具有生物活性的生物大分子；并且，将生物多糖类生物大分子固定在材料表面是改善生物医用材料的生物相容性和表面生物性能最为有效的途径之一。值得注意的是，在为数众多的生物多糖中，香菇多糖及其衍生物表现出十分显著的抗肿瘤、免疫调节、抗病毒等多方面的生物活性；香菇多糖硫酸酯是一种带有磺酸基的类肝素物质，在生理环境中带负电，有利于排斥血浆蛋白的非特异性吸附，因此，利用香菇多糖硫酸酯进行生物材料的表面修饰有利于提高被修饰材料的血液相容性。溶菌酶是一种来自于生物体的天然抗菌剂，它具有良好的生物相容，能够有效水解细菌细胞壁中的糖苷键，使细菌细胞壁变松弛，失去对细胞的保护作用，最终导致细菌溶解死亡。因此，利用溶菌酶进行生物材料的表面修饰有利于提高被修饰材料的抗菌活性。

本发明的有益效果是：该方法制备的聚乳酸材料的表面具有良好的抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性，同时材料表面的血液相容性也得到改善。本发明通过表面层层自组装的方法将溶菌酶和香菇多糖硫酸酯固定在聚乳酸基材表面。首先，本发明所采用的层层自组装表面修饰技术，具有一系列优点，例如：操作简单，制备条件温和，自组装分子的选择范围广泛等。并且，该方法可在常温水溶液中进行，因而有利于保持生物大分子的天然构象和生物活性。其次，因此，本发明采用的聚乳酸表面修饰物质均是具有生物活性的生物大分子（溶菌酶和香菇多糖硫酸酯），它们具有良好的生物相容性，因此利用香菇多糖硫酸酯进行聚乳酸的表面修饰有利于改善材料的生物相容性。同时，香菇多糖硫酸酯是带有磺酸基的类肝素物质，这些磺酸基团在生理环境中带有较强的负电荷，这有利于排斥血浆蛋白的非特异性吸附，因此，利用香菇多糖硫酸酯进行生物材料的表面修饰有利于提高被修饰材料的血液相容性。此外，用于基材表面修饰的溶菌酶是一种广泛存在于生物体中的天然抗菌剂，它具有抗菌性强、安全无毒、热稳定性好和作用范围广等优点。同时，溶菌酶对于革兰氏阳性菌具有很好的杀灭作用。因此，本发明提供的香菇多糖硫酸酯和溶菌酶自组装修饰的聚乳酸材料，可以有效提高被修饰材料的血液相容性和生物相容性，并且赋予被修饰材料特殊的抗菌活性。

本发明一种溶菌酶与香菇多糖硫酸酯自组装修饰的聚乳酸材料能够在生物材料领域具有十分广泛的用途；同时，该材料的制备工艺简单，易于控制，制备条件温和，成本低廉，特别适用于制备具有良好生物相容性和抑菌抗感染作用的人造器官和装置的生物医用材料。

附图说明

图1是聚乳酸材料氨基化修饰前与茚三酮反应的颜色变化，其中PLA代表未修饰的聚乳酸材料。

图2是聚乳酸材料氨基化修饰后与茚三酮反应的颜色变化，其中PLA-NH₂代表氨基化修饰后的聚乳酸材料。

图3是层层自组装修饰过程中聚乳酸材料表面的静态水接触角的变化图，其中PLA代表未经表面修饰的聚乳酸材料，PLA-NH₂代表氨基化修饰后的聚乳酸材料，PLA/LS-(Lys-LS)₅代表香菇多糖硫酸酯（LS）为最外层的含有五个双分子层的层层自组装修饰的聚乳酸材料。

图4是修饰前后的聚乳酸材料表面对大肠杆菌的抑制效果图，其中control代表未加样品的空白对照组，PLA代表未经表面修饰的聚乳酸材料，PLA/LS-(Lys-LS)₅代表香菇多糖硫酸酯（LS）为最外层的含有五个双分子层的层层自组装修饰的聚乳酸材料。

图5是修饰前后的聚乳酸材料表面对金黄色葡萄球菌的抑制效果图，其中control代表未加样品的空白对照组，PLA代表未经表面修饰的聚乳酸材料，PLA/LS-(Lys-LS)₅代表香菇多糖硫酸酯（LS）为最外层的含有五个双分子层的层层自组装修饰的聚乳酸材料。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1：

一种溶菌酶与香菇多糖硫酸酯自组装修饰的聚乳酸材料的制备方法，它包括如下具体步骤：

1）香菇多糖硫酸酯衍生物的制备：

将0.6g 香菇多糖加入装有50mL 二甲基亚砜的反应瓶中，在20℃下搅拌12小时，再以2mL/分钟的速度缓慢逐滴滴加9mL 吡啶，继续搅拌30分钟，然后将反应瓶置于冰浴中，搅拌下用恒压漏斗以0.5mL/分钟的速度缓慢逐滴滴加3.7mL氯磺酸（其中氯磺酸与吡啶的摩尔比为1：2），然后升温至80℃继续搅拌反应100分钟，反应停止后冷却至室温，用浓度为5wt%的NaOH溶液调节pH至7.0，得到反应液；再将所得反应液注入再生纤维素透析袋（36mm，Mw：8000-14000）中，在pH为10的NaOH溶液中透析12小时，再用自来水流水透析4天，蒸馏水透析3天，然后将透析液旋转蒸发浓缩，最后经冷冻干燥得到黄色粉末状的香菇多糖硫酸酯（LS）；

2)聚乳酸膜片的制备：

将6g聚乳酸材料（浙江海正生物材料股份有限公司产品）溶于45mL二氯甲烷中，待搅拌完全溶解后将溶液倒入平底成膜盘内，在室温下干燥24小时，待溶剂完全挥发后，得到聚乳酸薄膜；再将上述聚乳酸薄膜切成圆形膜片，在体积比为1︰1的乙醇水溶液中搅拌清洗2小时，以除去表面的杂质，然后用大量的蒸馏水清洗，在40℃真空干燥24小时，得到聚乳酸膜片；

3）聚乳酸膜片表面氨基化：

将4g上述的聚乳酸膜片放入60mL浓度为0.09g/mL乙二胺的异丙醇溶液中，在45℃下搅拌反应3分钟，得到表面带有氨基官能团的聚乳酸膜片，再用大量蒸馏水冲洗聚乳酸膜片，以除去其表面物理粘附的乙二胺，然后在室温下将表面带有氨基官能团的聚乳酸膜片用浓度为0.012mol/L的 HCl溶液浸泡15分钟，再用蒸馏水洗涤膜片4次，得到表面氨基化的聚乳酸膜片基材；

4）香菇多糖硫酸酯溶液、溶菌酶溶液的制备：

将100mg香菇多糖硫酸酯溶解于100mL浓度为0.15mol/L 的NaCl溶液中，得到香菇多糖硫酸酯溶液，其中香菇多糖硫酸酯的浓度为1.0 mg/mL；

将100mg溶菌酶溶解于100mL浓度为0.15mol/L 的NaCl溶液中，得到溶菌酶溶液，其中溶菌酶的浓度1.0 mg/mL；

将上述步骤3）得到的表面氨基化的聚乳酸膜片基材加入到香菇多糖硫酸酯溶液中浸泡15分钟，然后分离出膜片用0.15mol/L NaCl溶液洗涤4次，制备出表面具有香菇多糖硫酸酯的PLA/LS膜片；

再将该膜片加入到溶菌酶溶液中浸泡15分钟，分离出膜片用0.15 mol/L NaCl溶液洗涤4次，然后再加入到香菇多糖硫酸酯溶液中浸泡15分钟，分离出膜片用0.15mol/L NaCl溶液洗涤4次，完成聚乳酸表面的第一个双分子层的自组装；按上述步骤，在溶菌酶溶液和香菇多糖硫酸酯溶液中分别交替自组装5次后，得到香菇多糖硫酸酯为最外层的含5个双分子层的表面层层自组装修饰的聚乳酸膜片，再用去离子水洗涤4次后，再将聚乳酸膜片在室温的条件下干燥24小时，得到一种溶菌酶和香菇多糖硫酸酯层层自组装修饰的聚乳酸材料PLA/LS-(Lys-LS)₅。

图1和图2分别是聚乳酸材料氨基化修饰前后与茚三酮反应的颜色变化。茚三酮是一种常见的用于分析氨基酸的试剂，它可以与氨、伯胺、仲胺反应显色，茚三酮与伯胺反应生成一种蓝紫色的复合物，从而证明氨基基团的存在，因此用茚三酮来检测聚乳酸表面的氨基。将聚乳酸膜片加入到l.0 mol/L的茚三酮/乙醇溶液中浸泡5分钟，然后直接放入盛有1mL蒸馏水的干净试管中，在80℃水浴中加热15分钟，反应完毕后观察聚乳酸膜片表面的颜色变化。由图1可知，未改性的PLA与茚三酮反应后，其表面未出现任何颜色变化；由图2可知，经过氨基化修饰的PLA-NH₂与茚三酮反应后，表面变为蓝紫色。以上结果表明，通过与乙二胺反应，在聚乳酸材料表面进行了氨基化修饰。

图3是实施例1表面层层自组装过程中聚乳酸材料表面的静态水接触角的变化。测试过程为：在接触角测试仪（C 201型，上海梭伦科技）上将20μL去离子水滴到待测聚乳酸膜片表面（待测聚乳酸膜片为实施例1中所得到的溶菌酶与香菇多糖硫酸酯自组装修饰的聚乳酸材料），待稳定后测出薄膜与水滴的左右两个夹角，每个样品测量6次，其平均值为最终的水接触角，其标准偏差为接触角的误差。从图2中可以看出，未经表面修饰的聚乳酸材料PLA的水接触角为75.1°，经过氨基化修饰的PLA-NH₂的水接触角为70.8°，而经过修饰的聚乳酸材料PLA/LS-(Lys-LS)₅表面水接触角达为48.1°，说明经溶菌酶与香菇多糖硫酸酯自组装修饰后聚乳酸材料表面的亲水性增加。以上结果表明，经过溶菌酶和香菇多糖硫酸酯层层自组装修饰的聚乳酸材料其表面具有良好的亲水性。

图4是实施例1表面层层自组装修饰前后聚乳酸材料对大肠杆菌的抑制效果图。其测试过程参考中华人民共和国轻工行业标准：QB/T 2591-2003《抗菌塑料—抗菌性能测试方法和抗菌效果》。实验时采用连续转接2次的新鲜细菌培养物（24h内转接），加入培养液中，依次做10倍递增稀释，选择菌液浓度为（5.0～10.0）×10⁵ CFU/ml的稀释液作为试验用菌液。参考GB 4789.2《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》的方法，在每个培养管中加入2mL菌液，分别加入5片表面修饰前后的聚乳酸膜片，而不加入膜片的培养管作为空白对照组，在37℃恒温振荡培养24小时后，用平板计数法计算出菌落数目。每组数据做两次平行实验，每个样品做三个平行抗菌测试。从图3中可以看出，control代表的未加入样品的空白培养基经过过夜培养后大肠杆菌的浓度为8.04×10⁷CFU/mL，未经修饰的聚乳酸材料PLA经过过夜培养后的大肠杆菌浓度为7.84×10⁷CFU/mL，而经过层层自组装修饰后的聚乳酸材料PLA/LS-(Lys-LS)₅过夜培养后的大肠杆菌浓度为4.57×10⁷CFU/mL，与未经修饰的聚乳酸材料PLA相比，经过修饰的聚乳酸材料抗菌性能提高了41.7%。以上结果表明，经过层层自组装修饰的聚乳酸材料其表面具有良好的抑制大肠杆菌的抗菌活性。

图5是实施例1表面层层自组装修饰前后聚乳酸材料对金黄色葡萄球菌的抑制效果图。其测试过程参考中华人民共和国轻工行业标准：QB/T 2591-2003《抗菌塑料—抗菌性能测试方法和抗菌效果》。实验时采用连续转接2次的新鲜细菌培养物（24h内转接），加入培养液中，依次做10倍递增稀释，选择菌液浓度为（5.0～10.0）×10⁹ CFU/mL的稀释液作为试验用菌液。参考GB 4789.2《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》的方法，在每个培养管中加入2mL菌液，分别加入5片表面修饰前后的聚乳酸膜片，而不加入膜片的培养管作为空白对照组，在37℃恒温振荡培养24小时后，用平板计数法计算出菌落数目。每组数据做两次平行实验，每个样品做三个平行抗菌测试。从图4中可以看出，control代表的未加入样品的空白培养基经过过夜培养后金黄色葡萄球菌的浓度为2.72×10¹¹CFU/mL，未经修饰的聚乳酸材料PLA经过过夜培养后的金黄色葡萄球菌浓度为2.61×10¹¹CFU/mL，而经过层层自组装修饰后的聚乳酸材料PLA/LS-(Lys-LS)₅过夜培养后的金黄色葡萄球菌浓度为0.84×10¹¹CFU/mL，与未经修饰的聚乳酸材料PLA相比，经过修饰的聚乳酸材料抗菌性能提高了67.81%。以上结果表明，经过层层自组装修饰的聚乳酸材料其表面具有良好的抑制金黄色葡萄球菌的抗菌活性。

表1是实施例1表面层层自组装修饰前后聚乳酸材料的溶血试验结果，其中阳性对照代表未加膜片在蒸馏水中对照组，阴性对照代表未加膜片在生理盐水中对照组，PLA代表未经表面修饰的聚乳酸材料，PLA/LS-(Lys-LS)₅代表香菇多糖硫酸酯（LS）为最外层的含有五个双分子层的层层自组装修饰的聚乳酸材料。其测试过程参考中华人民共和国国家标准：GB/T 16175-2008《医用有机硅材料生物学评价试验方法》进行。将待测膜片放入含有10mL生理盐水的试管中，以10mL蒸馏水的试管为阳性对照，10mL生理盐水的试管为阴性对照，将试管分别放入37℃水浴中30min。将新鲜抗凝血液用生理盐水按4︰5稀释，然后向每个试管中加入0.2mL稀释的血液，在37℃恒温水浴中维持60min。然后以2500r/min离心 10min。小心抽取上清液，紫外可见分光光度计（UV-7504，上海欣茂仪器有限公司）在545nm处测定其吸光度。每组数据做两次平行实验，每个样品做三个平行测试。溶血率计算公式为：[(D_样品-D_阴性)/(D_阳性-D_阴性)]×100%，其中D_样品代表测试样品的吸光度，D_阴性代表阴性对照的吸光度，D_阳性代表阳性对照的吸光度。从表1中可以看出未经修饰的聚乳酸材料PLA的溶血率为1.09%，经过修饰的聚乳酸材料PLA/LS-(Lys-LS)₅溶血率为0.76%，该结果说明经过层层自组装修饰的聚乳酸材料其表面血液相容性得到了改善。

表1

样品	吸光度值	溶血率（%）
			阳性对照	0.8365±0.0106	100
阴性对照	0.0413±0.0005	0
			PLA	0.0500±0.0100	1.09
PLA/LS-(Lys-LS)₅	0.0473±0.0023	0.76

实施例2：

1）香菇多糖硫酸酯衍生物的制备：

将1.2g 香菇多糖加入装有100mL 二甲基亚砜的反应瓶中，在30℃下搅拌18小时，再以4mL/分钟的速度缓慢逐滴滴加18mL 吡啶，继续搅拌40分钟，然后将反应瓶置于冰浴中，搅拌下用恒压漏斗以1mL/分钟的速度缓慢逐滴滴加7.4mL氯磺酸（其中氯磺酸与吡啶的摩尔比为1：2），然后升温至80℃继续搅拌反应120分钟，反应停止后冷却至室温，用浓度为5wt%的NaOH调节pH至7.0，得到反应液；再将所得反应液注入再生纤维素透析袋（36mm，Mw：8000-14000）中，在pH为10的NaOH溶液中透析18小时，再用自来水流水透析6天，蒸馏水透析5天，然后将透析液旋转蒸发浓缩，最后经冷冻干燥得到黄色粉末状的香菇多糖硫酸酯（LS）；

2)聚乳酸膜片的制备：

将12g聚乳酸材料（浙江海正生物材料股份有限公司产品）溶于90mL二氯甲烷中，待搅拌完全溶解后将溶液倒入平底成膜盘内，在室温下干燥48小时，待溶剂完全挥发后，得到聚乳酸薄膜；再将上述聚乳酸薄膜切成圆形膜片，在体积比为1︰1的乙醇水溶液中搅拌清洗3小时，以除去表面的杂质，然后用大量的蒸馏水清洗，在50℃真空干燥48小时，得到聚乳酸膜片；

3）聚乳酸膜片表面氨基化：

将8g上述的聚乳酸膜片放入60mL浓度为0.09g/mL乙二胺的异丙醇溶液中，在45℃下搅拌反应4分钟，得到表面带有氨基官能团的聚乳酸膜片，再用大量蒸馏水冲洗聚乳酸膜片，以除去其表面物理粘附的乙二胺，然后在室温下将表面带有氨基官能团的聚乳酸膜片用浓度为0.012mol/L的 HCl溶液浸泡30分钟，再用蒸馏水洗涤膜片8次，得到表面氨基化的聚乳酸膜片基材；

4）香菇多糖硫酸酯溶液、溶菌酶溶液的制备：

将上述步骤3）得到的表面氨基化的聚乳酸膜片基材加入到香菇多糖硫酸酯溶液中浸泡20分钟，然后分离出膜片用0.15mol/L NaCl溶液洗涤6次，制备出表面具有香菇多糖硫酸酯的PLA/LS膜片；

再将该膜片加入到溶菌酶溶液中浸泡20分钟，分离出膜片用0.15 mol/L NaCl溶液洗涤6次，然后再加入到香菇多糖硫酸酯溶液中浸泡20分钟，分离出膜片用0.15mol/L NaCl溶液洗涤6次，完成聚乳酸表面的第一个双分子层的自组装；按上述步骤，在溶菌酶溶液和香菇多糖硫酸酯溶液中分别交替自组装5次后，得到香菇多糖硫酸酯为最外层的含5个双分子层的表面层层自组装修饰的聚乳酸膜片，再用去离子水洗涤6次后，再将聚乳酸膜片在室温的条件下干燥48小时，得到溶菌酶和香菇多糖硫酸酯层层自组装修饰的聚乳酸材料PLA/LS-(Lys-LS)₅。

实施例3：

1）香菇多糖硫酸酯衍生物的制备：

将0.6g 香菇多糖加入装有50mL 二甲基亚砜的反应瓶中，在25℃下搅拌16小时，再以3mL/分钟的速度缓慢逐滴滴加18mL吡啶，继续搅拌35分钟，然后将反应瓶置于冰浴中，搅拌下用恒压漏斗以1mL/分钟的速度缓慢逐滴滴加3.7mL氯磺酸（其中氯磺酸与吡啶的摩尔比为1：4），然后升温至80℃继续搅拌反应120分钟，反应停止后冷却至室温，用浓度为10wt%的NaOH调节pH至7.0，得到反应液；再将所得反应液注入再生纤维素透析袋（36mm，Mw：8000-14000）中，在pH为10的NaOH溶液中透析16小时，再用自来水流水透析5天，蒸馏水透析4天，然后将透析液旋转蒸发浓缩，最后经冷冻干燥得到黄色粉末状的香菇多糖硫酸酯（LS）；

2)聚乳酸膜片的制备：

3）聚乳酸膜片表面氨基化：

将8g上述的聚乳酸膜片放入60mL浓度为0.09g/mL乙二胺的异丙醇溶液中，在45℃下搅拌反应5分钟，得到表面带有氨基官能团的聚乳酸膜片，再用大量蒸馏水冲洗聚乳酸膜片，以除去其表面物理粘附的乙二胺，然后在室温下将表面带有氨基官能团的聚乳酸膜片用浓度为0.012mol/L的 HCl溶液浸泡30分钟，再用蒸馏水洗涤膜片8次，得到表面氨基化的聚乳酸膜片基材；

4）香菇多糖硫酸酯溶液、溶菌酶溶液的制备：

将200mg香菇多糖硫酸酯溶解于100mL浓度为0.15mol/L 的NaCl溶液中，得到香菇多糖硫酸酯溶液，其中香菇多糖硫酸酯的浓度为2.0 mg/mL；

将200mg溶菌酶溶解于100mL浓度为0.15mol/L 的NaCl溶液中，得到溶菌酶溶液，其中溶菌酶的浓度2.0 mg/mL；

实施例4：

与实施例3基本相同，不同之处在于：步骤3）中：聚乳酸膜片的用量为6g，膜片在50℃下，在含乙二胺的异丙醇溶液中搅拌反应3分钟。

实施例5：

与实施例3基本相同，不同之处在于：步骤3）中：聚乳酸膜片的用量为6g，膜片在50℃下，在含乙二胺的异丙醇溶液中搅拌反应4分钟。

实施例6：

与实施例3基本相同，不同之处在于：步骤3）中：聚乳酸膜片的用量为6g，膜片在50℃下，在含乙二胺的异丙醇溶液中搅拌反应5分钟。

Claims

1.一种溶菌酶与香菇多糖硫酸酯自组装修饰的聚乳酸材料，其特征在于：它由基材和修饰层组成，基材由表面氨基化的聚乳酸材料构成，修饰层是在所述基材的表面利用层层自组装技术进行表面修饰而得到；其中，修饰层中含有在所述基材表面交替层层自组装的溶菌酶和香菇多糖硫酸酯。

2.如权利要求1所述的溶菌酶与香菇多糖硫酸酯自组装修饰的聚乳酸材料的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：

1）香菇多糖硫酸酯衍生物的制备：

按香菇多糖: 二甲基亚砜: 吡啶: 氯磺酸＝（0.6～1.2）g:（50～100）mL:（9～18）mL:（3.7～7.4）mL，选取香菇多糖、二甲基亚砜、吡啶和氯磺酸，备用；

2）聚乳酸膜片的制备：

3）聚乳酸膜片表面氨基化：

按聚乳酸膜片: 含乙二胺的异丙醇溶液＝（4～8）g: 60mL，选取上述聚乳酸膜片和含乙二胺的异丙醇溶液，含乙二胺的异丙醇溶液的浓度为0.09g/mL；

4）香菇多糖硫酸酯溶液、溶菌酶溶液的制备：

按溶菌酶:香菇多糖硫酸酯＝（100～200）mg:（100～200）mg，选取溶菌酶和香菇多糖硫酸酯；

再将该膜片加入到溶菌酶溶液中浸泡15～20分钟，分离出膜片用0.15 mol/L NaCl溶液洗涤4～6次，然后再加入到香菇多糖硫酸酯溶液中浸泡15～20分钟，分离出膜片用0.15mol/L NaCl溶液洗涤4～6次，完成聚乳酸表面的第一个双分子层的自组装；按上述步骤，在溶菌酶溶液和香菇多糖硫酸酯溶液中分别交替自组装5次后，即得到香菇多糖硫酸酯为最外层的含5个双分子层的表面层层自组装修饰的聚乳酸膜片，再用去离子水洗涤4～6次后，再将聚乳酸膜片在室温的条件下干燥24～48小时，得到所述溶菌酶与香菇多糖硫酸酯自组装修饰的聚乳酸材料。