CN104005016A - 一种兼具抗菌及促成骨细胞功能的医用钛合金及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种具有抗菌性能和促成骨细胞功能的纳米层医用钛合金的制备方法。首先通过酯化反应制备出不同浓度的壳聚糖-月桂酸(1%,1.67%,2.5%)偶联物;其次,利用物理吸附法及化学固定法,聚多巴胺作为中间层,将壳聚糖-月桂酸偶联物固定在钛植入体表面,从而在钛材表面构建出一种具有抗菌-促成骨细胞增殖双重性能的纳米结构层,以调控成骨细胞的生物学功能,并提高钛植入体短期抗菌的能力。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域,涉及一种功能性钛合金界面的制备方法。
背景技术
钛及钛合金移植体,因为其出色的力学性质和良好的生物相容性,被广泛应用于骨修复等外科手术中。然后,钛移植体植入体内后,与骨以机械整合的方式结合,这种被动的方式将会引发炎症、移位,最终导致移植失败。为了解决这一难题,对钛材进行表面改性以提高其骨整合性成为医用材料研究领域的重要内容。
钛基表面自发形成一层TiO2钝化层,可以提高钛金属的生物相容性和抗腐蚀性,但是自发形成的钝化层无规则的表面形貌,当植入人体后,新生骨组织与植入体只能接触生长,无法形成牢固的骨性键合。要想获得理想的生物材料,使植入时间更长,效果持久,与机体有机结合,钛材料的抗菌、生物相容性等性能仍有待提高。
发明内容
本发明的目的在于提供的一种具有抗菌性能和促成骨细胞功能的纳米层医用钛合金的制备方法。利用该方法制备的功能性的钛合金界面有利于提高钛合金的抗菌性能,并且提高其骨整合性,对于钛植入体的成功植入以及在体内长期稳定的存在具有重要意义。
本发明的目的是通过以下措施实现的:
上述医用钛合金制备方法,包括以下步骤:
1)在钛材表面固定聚多巴胺作为连接层;
2)在聚多巴胺固定的钛合金表面结合壳聚糖-月桂酸偶联物构建Ti-PDOP-Chi-LA偶联物。所述壳聚糖-月桂酸偶联物采用酯化反应制得,包括以下步骤:①壳聚糖加入醋酸溶液配制壳聚糖溶液;以甲醇配制月桂酸溶液,EDC水溶液加入月桂酸溶液,用以激活月桂酸的羧基;②将加有EDC的月桂酸溶液逐滴加入到壳聚糖溶液中,搅拌生成白色悬浊液;再将悬浊液转入透析袋中透析,冷冻,干燥,得到壳聚糖-月桂酸偶联物。
在制备过程中,诸多因素会影响壳聚糖-月桂酸偶联物的合成以及钛材表面层状薄膜的构建,例如酯化反应合成壳聚糖-月桂酸偶联物的时间、月桂酸的浓度、聚多巴胺的浓度和浸泡时间等,不同的控制条件将影响到功能化钛材界面薄膜的形成状况。
步骤1)中聚多巴胺优选浓度为2mg/ml,浸泡时间为12h,表面形成均匀的单层膜,有利于壳聚糖-月桂酸偶联物的进一步吸附和固定。
步骤1)中壳聚糖-月桂酸偶联物浸泡24h,表面形成均匀且厚度适当的薄膜,从而得到功能化钛材界面的薄膜。
制备上述壳聚糖-月桂酸偶联物时月桂酸的浓度为1~2.5%,优选为1%、1.67%、2.5%,反应完成后不易形成白色颗粒状物质,反应更彻底,有利于更好地检测抗菌及骨整合性能。
优选的,上述壳聚糖-月桂酸偶联物采用酯化反应制得。具体地,包括以下步骤:1)以0.5%醋酸溶液配制壳聚糖(浓度为1%),磁力搅拌过夜,以甲醇配制月桂酸溶液,浓度分别为0.5~5%,以双蒸水配制EDC(125mM)溶液,加入梯度的月桂酸溶液(体积比为1:5),用以激活月桂酸的羧基,磁力搅拌4h;2)将梯度的月桂酸溶液逐滴加入到壳聚糖溶液中,体积比为3:5,磁力搅拌20~26h,生成白色悬浊液;再将悬浊液转入透析袋中,透析三天,冷冻,干燥,得到壳聚糖-月桂酸偶联物。更优选的,上述壳聚糖-月桂酸偶联物的制备方法包括以下步骤:1)以0.5%醋酸溶液配制壳聚糖(浓度为1%),磁力搅拌过夜,以甲醇配制月桂酸溶液,浓度分别为1%,1.67%,2.5,以双蒸水配制EDC(125mM)溶液,加入梯度的月桂酸溶液(体积比为1:5),用以激活月桂酸的羧基,磁力搅拌4h;2)将梯度的月桂酸溶液逐滴加入到壳聚糖溶液中(体积比为3:5),磁力搅拌24h,生成白色悬浊液;再将悬浊液转入透析袋中,透析三天,冷冻,干燥,得到梯度壳聚糖-月桂酸偶联物。
优选的,所述步骤1)利用化学固定法,在钛材表面固定聚多巴胺复合物作为连接层,包括以下步骤:以双蒸水配制Tris-Buffer溶液(10mM,pH 8.5),用配好的Tris-Buffer溶液溶解聚多巴胺(1~2mg/mL),避光过滤;将钛片浸入20ml聚多巴胺溶液中(避光操作),包锡箔纸反应10-16h,双蒸水清洗三遍,形成Ti-PDOP。更优选的,以双蒸水配制Tris-Buffer溶液(10mM,pH 8.5),用配好的Tris-Buffer溶液溶解聚多巴胺(2mg/mL),避光过滤;将钛片浸入20ml聚多巴胺溶液中(避光操作),包锡箔纸反应12h,双蒸水清洗三遍,形成Ti-PDOP。
优选的,所述步骤2)利用物理吸附法及化学固定法,在钛合金表面构建钛-多巴胺-壳聚糖-月桂酸(1%,1.67%,2.5%)偶联物,包括以下步骤:以0.5%醋酸配制壳聚糖-月桂酸偶联物,将固定有多巴胺的钛片浸入其中,浸泡20-28h,双蒸水清洗三次,干燥,最终形成Ti-PDOP-Chi-LA(1%,1.67%,2.5%)偶联物。更优选的,所述步骤2)利用物理吸附法及化学固定法,在钛合金表面构建钛-聚多巴胺-壳聚糖-月桂酸(1%,1.67%,2.5%)偶联物。以0.5%醋酸配制壳聚糖-月桂酸偶联物,将固定有多巴胺的钛片浸入其中,浸泡24h,双蒸水清洗三次,干燥,最终形成Ti-PDOP-Chi-LA(1%,1.67%,2.5%)偶联物。
Ti-PDOP-Chi-LA表示钛-聚多巴胺-壳聚糖-月桂酸。Ti为钛,PDOP为聚多巴胺,Chi为壳聚糖,LA为月桂酸。
有益效果
1.本发明提供的钛合金界面有利于提高钛合金的抗菌性能,并且提高其骨整合性,对于钛植入体的成功植入以及在体内长期稳定的存在具有重要意义。制备方法不需要特殊器材,操作简单,价格低廉,可控性强。
2.本发明首先采用化学合成法(酯化反应)制备壳聚糖-月桂酸偶联物,聚多巴胺作为连接层固定在钛合金表面,利用物理吸附和化学合成法,将固定有聚多巴胺的钛合金表面进一步固定壳聚糖-月桂酸偶联物,制备出具有良好骨整合性及抗菌能力的功能化钛材界面。本发明的钛合金表面形成均匀且厚度适当的薄膜,反应完成后不易形成白色颗粒状物质,反应更彻底,有利于更好地检测抗菌及骨整合性能。
3.本发明提供的钛合金界面细胞活性高,无副作用,且具有良好的生物相容性。可提高碱性磷酸酶活性,有利于早期骨生成,提高矿化能力,具有良好的短期抗菌性能。本发明为成骨细胞提供了良好的微环境,增加了钛材的生物相同性,提高钛合金移植体的骨整合性,另一方面,赋予了钛合金移植物短期抗菌性能,为之后的长期和体内的抗菌研究奠定基础。
附图说明
图1不同修饰表面形态观察--SEM;a为Ti组,b为Ti-PDOP组,c为Ti-PDOP-Chi-1%LA组,d为Ti-PDOP-Chi-1.67%LA组,e为Ti-PDOP-Chi-2.5%LA组。
图2不同修饰表面成骨细胞培养4天、7天后细胞活性,n=6,**p<0.01。
图3不同修饰表面成骨细胞培养4天、7天后碱性磷酸酶活性,n=6,**p<0.01。
图4不同修饰表面成骨细胞培养14天后矿化定量检测,n=6,**p<0.01。
图5不同修饰钛材表面材料耐受性实验——CCK-8检测,n=6,**p<0.01。
具体实施方式
为了使本研究发明的技术方案以及优点更为清晰,下面将根据附图对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1
钛合金表面促进成骨细胞功能-抗菌性能的功能化结构构建,包括以下步骤:
a.壳聚糖-月桂酸偶联物的制备:首先,以0.5%醋酸溶液配制壳聚糖(浓度为1%),磁力搅拌过夜,以甲醇配制月桂酸溶液,浓度分别为1%,1.67%,2.5%,以双蒸水配制EDC(125mM)溶液,加入梯度的月桂酸溶液(体积比为1:5),用以激活月桂酸的羧基,磁力搅拌4h;其次,将梯度的月桂酸溶液逐滴加入到壳聚糖溶液中(体积比为3:5),磁力搅拌24h,生成白色悬浊液;再将悬浊液转入透析袋中,透析三天,冷冻,干燥,得到壳聚糖-梯度月桂酸偶联物。
b.聚多巴胺的固定:利用化学固定法,在钛材表面固定聚多巴胺复合物作连接间层。以双蒸水配制Tris-Buffer溶液(10mM,pH 8.5),用配好的Tris-Buffer溶液溶解聚多巴胺(2mg/mL),避光过滤;将钛片浸入20ml聚多巴胺溶液中(避光操作),包锡箔纸反应12h,双蒸水清洗三遍,形成Ti-PDOP。
c.功能化钛合金表面的构建:是利用物理吸附法及化学固定法,在钛合金表面构建钛-多巴胺-壳聚糖-月桂酸(1%,1.67%,2.5%)偶联物。以0.5%醋酸配制壳聚糖-月桂酸偶联物,将固定有多巴胺的钛片浸入其中,浸泡24h,双蒸水清洗三次,干燥,最终形成Ti-PDOP-Chi-LA(Ti-PDOP-Chi-1%LA,Ti-PDOP-Chi-1.67%LA,Ti-PDOP-Chi-2.5%LA)偶联物。
钛合金性能验证:
1)改性后钛合金表面的细胞活性,探究成骨细胞在不同修饰的钛合金表面的细胞活性。
以CCK-8表征不同修饰的钛合金表面的生物相容性。取生长状态良好的第三代成骨细胞,密度为2×104/cm2接种在不同修饰的钛合金表面及对照组TCPS上,分别培养4天和7天,吸弃培养基,每孔加入200ul新鲜培养基及20ulCCK-8溶液,继续培养1.5h。每孔吸取50μL培养液,测定各孔在450nm处的吸光值。
CCK-8法是一种方便快捷、灵敏度高、重复性好的细胞活性检测法,CCK-8可以被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原成有色的甲瓒,而死细胞无此功能。因此,活细胞量与颜色深浅成正比,活细胞越多,颜色越深,OD值也就越高。如图2所示,接种4天后,在修饰有壳聚糖-月桂酸(1.67%,2.5%)的钛材表面生成的甲瓒量与纯钛相比,具有显著性差异(p<0.01);在接种7天后,在修饰有多巴胺以及壳聚糖-月桂酸的钛材表面生成的甲瓒量与纯钛相比,均具有显著性差异(p<0.01),对照组(TCPS)表现出最高的甲瓒生成量,细胞活性最高。由此,结果表明本实验中不同浓度的月桂酸-壳聚糖偶联物无无副作用,且具有良好的生物相容性。
2)成骨细胞在改性钛合金表面的碱性磷酸酶活性
取长势良好的3代细胞以2×104cell/孔的密度接种于各修饰钛片表面以及TCPS上,分别培养4天和7天,以1%TritonX-100裂解细胞,得到细胞裂解液。BCA蛋白检测试剂盒根据标准曲线检测裂解液中的蛋白总量,进而利用ALP试剂盒得到相应的碱性磷酸酶活性,490nm处检测吸光值。
碱性磷酸酶(ALP)是骨生成的早期标志,较高的碱性磷酸酶活性有助于提高骨组织的矿化能力。图3显示了各修饰钛材表面培养4天和7天后成骨细胞的碱性磷酸酶活性。经过4天的培养,与纯钛和壳聚糖-月桂酸修饰的钛材相比,多巴胺修饰的钛材表面具有更高的碱性磷酸酶活性(p<0.01)。这个结果说明,培养4天后,多巴胺由于自身的邻苯二酚和氨基基团,有利于早期骨的形成。与此同时,培养7天后,和纯钛相比,在聚多巴胺和壳聚糖-(1.67%,2.5%)月桂酸组表现出更高的碱酶性磷酸活性(p<0.01),其中,壳聚糖-1.67%月桂酸组表现出最高的ALP活性。结果表明,壳聚糖-月桂酸修饰的钛材表面可提高碱性磷酸酶活性,有利于早期骨生成,进而提高矿化能力。
(3)成骨细胞在改性钛合金表面的矿化能力
为了进一步检测不同修饰钛合金表面对成骨细胞骨整合性的促进作用,本实验研究了成骨细胞的矿化能力。矿化被认为是成骨细胞晚期分化的标志。本实验采用茜素红染色的方法,此方法是矿化沉积时对钙盐沉积定性定量检测常用的方法。茜素红与钙盐之间的颜色反应,导致形成深红色的钙盐结节,因此可以生成通过钙结节颜色的深浅来判断其矿化能力。图4是成骨细胞培养14天后矿化能力的定量检测。由图可知,经过多巴胺修饰的钛材表面及壳聚糖-月桂酸修饰的钛材表面与纯钛相比都具有显著性差异(p<0.01),尤其是壳聚糖-1.67%月桂酸修饰的钛材表面,表现了最高的钙沉积量,此结果与ALP的结果一致。因此,研究表明,壳聚糖-月桂酸修饰的钛材表面有助于提高成骨细胞的矿化能力。
(4)不同修饰钛合金表面短期抗菌性能的研究
将金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌接种在不同修饰的钛合金表面,密度为1×106cells/mL,在37℃培养箱中静止培养12h和24h;吸弃培养基,PBS缓冲液清洗3次,洗去悬浮的细菌;每孔加入200ul新的无菌MHB肉汤培养基,10ulCCK-8试剂,37℃培养箱中继续培养1.5h;每孔吸取50ul培养基,酶标仪450nm波段检测吸光值。
本实验采用CCK-8试剂盒定量检测细菌培养12h和24h后的细菌活性。如图5所示,培养12h和24h后,两种细菌在壳聚糖-月桂酸偶联物(1%,1.67%,2.5%)修饰的钛基材表面的活性明显低于纯钛和壳聚糖修饰的钛基材表面,并有极显著差异(p<0.01)。这种现象归因于:壳聚糖和月桂酸的协同抗菌作用。壳聚糖本身具有抗菌活性,虽然其分子中的部分氨基和月桂酸分子中的羧基发生酯化反应形成壳聚糖-月桂酸偶联物而被消耗掉,但并没有因此影响其抗菌效果,此外,月桂酸本身也具有抗菌效果。结果表明,固定有壳聚糖-月桂酸偶联物的钛合金表面具有良好的短期抗菌性能。
因此,本研究一方面,为成骨细胞提供了良好的微环境,增加了钛材的生物相同性,提高钛合金移植体的骨整合性,另一方面,赋予了钛合金移植物短期抗菌性能,为之后的长期和体内的抗菌研究奠定基础。
最后说明的是,以上实施例仅用于说明本发明的技术方案,并不构成对本发明内容的限制。尽管通过上述实施例已经对本发明做了较为详细的例举,但本领域技术人员仍然可以根据发明内容部分和实施例部分所描述的技术内容,在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (10)
1.一种具有抗菌性能和促成骨细胞功能的纳米层医用钛合金的制备方法,包括以下步骤:
1)在钛材表面固定聚多巴胺作为连接层;
2)在聚多巴胺固定的钛合金表面结合壳聚糖-月桂酸偶联物构建Ti-PDOP-Chi-LA偶联物;
所述壳聚糖-月桂酸偶联物采用酯化反应制得,包括以下步骤:①壳聚糖加入醋酸溶液配制壳聚糖溶液;以甲醇配制月桂酸溶液,EDC水溶液加入月桂酸溶液,用以激活月桂酸的羧基;②将加有EDC的月桂酸溶液逐滴加入到壳聚糖溶液中,搅拌生成白色悬浊液;再将悬浊液转入透析袋中透析,冷冻,干燥,得到壳聚糖-月桂酸偶联物。
2.如权利要求1所述的具有抗菌性能和促成骨细胞功能的纳米层医用钛合金的制备方法,步骤1)中钛材表面固定聚多巴胺是将钛材浸泡于聚多巴胺溶液,溶液浓度为2mg/ml,浸泡时间为12h。
3.如权利要求1或2所述的具有抗菌性能和促成骨细胞功能的纳米层医用钛合金的制备方法,步骤2)中聚多巴胺固定的钛合金表面结合壳聚糖-月桂酸偶联物是将聚多巴胺固定的钛合金在壳聚糖-月桂酸偶联物溶液浸泡24h。
4.如权利要求1所述的具有抗菌性能和促成骨细胞功能的纳米层医用钛合金的制备方法,酯化反应中月桂酸溶液浓度为1~2.5%。
5.如权利要求1所述的具有抗菌性能和促成骨细胞功能的纳米层医用钛合金的制备方法,所述壳聚糖-月桂酸偶联物的制备包括以下步骤:1)以0.5wt%醋酸溶液配制1wt%壳聚糖溶液,磁力搅拌过夜,以甲醇配制0.5~5%wt月桂酸溶液,浓度为,以双蒸水配制125mM的EDC溶液,加入月桂酸溶液,EDC溶液与月桂酸溶液的体积比为1:5,用以激活月桂酸的羧基,磁力搅拌4h;2)将加有EDC溶液的月桂酸溶液逐滴加入到壳聚糖溶液中,体积比为3:5,磁力搅拌20~26h,生成白色悬浊液;再将悬浊液转入透析袋中,透析三天,冷冻,干燥,得到壳聚糖-月桂酸偶联物。
6.如权利要求5所述的具有抗菌性能和促成骨细胞功能的纳米层医用钛合金的制备方法,包括以下步骤:1)以0.5wt%醋酸溶液配制1wt%壳聚糖溶液,磁力搅拌过夜,以甲醇配制月桂酸溶液,浓度分别为1%,1.67%,2.5,以双蒸水配制125mM的EDC溶液,加入月桂酸溶液,体积比为1:5,用以激活月桂酸的羧基,磁力搅拌4h;2)将月桂酸溶液逐滴加入到壳聚糖溶液中,体积比为3:5,磁力搅拌24h,生成白色悬浊液;再将悬浊液转入透析袋中,透析三天,冷冻,干燥,得到梯度壳聚糖-月桂酸偶联物。
7.如权利要求1所述的具有抗菌性能和促成骨细胞功能的纳米层医用钛合金的制备方法,所述步骤1)利用化学固定法,在钛材表面固定聚多巴胺复合物作为连接层,包括以下步骤:以双蒸水配制10mM,pH 8.5的Tris-Buffer溶液,用配好的Tris-Buffer溶液溶解聚多巴胺,配成浓度为1~2mg/mL的聚多巴胺溶液,避光过滤;避光将钛片浸入20ml聚多巴胺溶液中,包锡箔纸反应10-16h,双蒸水清洗三遍,形成Ti-PDOP。
8.如权利要求7所述的具有抗菌性能和促成骨细胞功能的纳米层医用钛合金的制备方法,所述步骤1)包括以下步骤:以双蒸水配制10mM,pH 8.5的Tris-Buffer溶液,用配好的Tris-Buffer溶液溶解聚多巴胺,浓度为2mg/mL,避光过滤;避光将钛片浸入20ml聚多巴胺溶液中,包锡箔纸反应12h,双蒸水清洗三遍,形成Ti-PDOP。
9.如权利要求1所述的具有抗菌性能和促成骨细胞功能的纳米层医用钛合金的制备方法,所述步骤2)利用物理吸附法及化学固定法,在钛合金表面构建钛-多巴胺-壳聚糖-月桂酸偶联物,包括以下步骤:以0.5%醋酸配制壳聚糖-月桂酸偶联物,将固定有多巴胺的钛片浸入其中,浸泡20-28h,双蒸水清洗三次,干燥,最终形成1%,1.67%或2.5%的Ti-PDOP-Chi-LA偶联物。
10.如权利要求9所述的具有抗菌性能和促成骨细胞功能的纳米层医用钛合金的制备方法,所述步骤2)利用物理吸附法及化学固定法,在钛合金表面构建钛-多巴胺-壳聚糖-月桂酸偶联物,以0.5%醋酸配制壳聚糖-月桂酸偶联物,将固定有多巴胺的钛片浸入其中,浸泡24h,双蒸水清洗三次,干燥,最终形成质量浓度为1%,1.67%,2.5%的Ti-PDOP-Chi-LA偶联物。
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