CN104225678B - 一种医用钛金属材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种医用钛金属材料及其制备方法，其具有抗细菌粘附和促成骨细胞生长功能，其包括：医用钛金属基体、第一附着层和第二附着层。本发明所述第一附着层为3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，第二附着层为聚乙二醇类化合物附着层，引入这两个附着层既提高聚乙二醇类化合物在钛金属表面的附着能力，防止脱落，又利用聚乙二醇类化合物提高钛金属抗细菌粘附能力，避免细菌在钛金属表面粘附繁殖。本发明在引入聚乙二醇类化合物附着层的过程中利用分子印迹方法，使钛金属材料具有对成骨细胞分子有效识别的功能，有利于成骨细胞在该材料表面固定生长。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料的表面改性领域，尤其涉及一种医用钛金属材料及其制备方法。
技术背景
随着医疗技术发展，医用钛金属被作为牙种植体和骨种植体等种植材料广泛应用在牙列缺损、骨头损失等疾病治疗，在挽救人的生命方面发挥了重要作用。然而该类手术的感染率很高，可能会导致大量抗生素治疗、去除种植体甚至死亡等严重后果。种植体相关感染高发的主要原因有两点：菌斑在种植体表面聚集和种植体骨结合界面抵抗能力低下。因此，需要提高钛金属的抗菌性能和促进成骨细胞生长功能。
细菌在材料表面的生长，分成三步：首先是细菌在材料表面的粘附，然后是细菌的繁殖，最后形成稳定的生物膜。一旦细菌在材料表面形成生物膜，杀菌剂就很难对细菌发挥作用。因此，具备抵抗细菌粘附功能的材料，可有效避免细菌产生的感染问题。乙二醇类化合物对材料表面修饰被认为是抵抗细菌粘附最有效的方法。但是这种修饰方法不能提供成骨细胞在材料表面的固定和生长。
分子印迹的概念由Southern在1975年首先提出，近年来分子印迹技术发展极为迅速。当模板分子(印迹分子)与聚合物单体接触时会形成多重作用点，通过聚合过程这种作用就会被记忆下来，当模板分子除去后，聚合物中就形成了与模板分子空间构型相匹配的具有多重作用点的空穴，这样的空穴将对模板分子及其类似物具有选择识别特性。
因此，开发一种新的医用钛金属材料及其制备方法，在引入乙二醇类化合物提高材料抗细菌粘附能力的同时，利用分子印迹的技术在钛金属材料表面引入与成骨细胞相匹配的作用点提高材料促成骨细胞功能非常重要。
发明内容
本发明的目的在于针对一般生物医用材料的不足，提供一种医用钛金属材料及其制备方法，通过在钛金属表面先引入3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷附着层，再引入聚乙二醇类化合物附着层，既提高聚乙二醇类化合物在钛金属表面的附着能力，防止脱落，又利用聚乙二醇类化合物提高钛金属抗细菌粘附能力，避免细菌在钛金属表面粘附繁殖。
本发明的另一个目的是，在引入聚乙二醇类化合物附着层的过程中利用分子印迹方法，使钛金属材料具有对成骨细胞分子有效识别的功能，有利于成骨细胞在该材料表面固定生长。
本发明提供的技术方案是：
一种医用钛金属材料，其具有抗细菌粘附和促成骨细胞生长功能，其中，所述包括：
医用钛金属基体；
第一附着层，其为3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷附着层，其附着在所述基体的表面，通过共价键与所述基体相连；
第二附着层，其为聚乙二醇类化合物附着层，其附着在所述第一附着层的表面，通过化学键与第一附着层相连；
其中，所述第二附着层中还具有与成骨细胞空间构型相匹配的空穴。
优选的是，所述的医用钛金属材料中，所述聚乙二醇类化合物由甲基丙烯酸聚乙二醇甲基醚脂和双甲基丙烯酸乙二醇脂在乙醇环境下发生交联反应得到。
优选的是，所述的医用钛金属材料中，所述甲基丙烯酸聚乙二醇甲基醚脂的分子量为：900-1100，所述双甲基丙烯酸乙二醇脂的分子量为：200-300。
优选的是，所述的医用钛金属材料中，所述空穴是使用分子印迹方法，在所述甲基丙烯酸聚乙二醇甲基醚脂和双甲基丙烯酸乙二醇脂发生交联反应的过程中引入成骨细胞，然后再使用胶原酶去除成骨细胞得到的。
一种医用钛金属材料的制备方法，其中，所述包括以下步骤：
步骤一、预处理：将基体钛金属用丙酮、乙醇和蒸馏水依次超声30分钟，80℃真空干燥，然后将钛片浸泡于体积分数为5％的3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，浸泡1小时，蒸馏水洗净，干燥，得到处理过的钛片；
步骤二、分子印迹方法结合表面引发原子转移自由基聚合法进行表面改性：将甲基丙烯酸聚乙二醇甲基醚酯、双甲基丙烯酸乙二醇酯加入水和乙醇中，搅拌均匀，加入成骨细胞，搅拌均匀；加入面积为1×1cm2钛片，加入CuBr和α-溴代苯乙酸甲酯，通氮气保护下100℃反应30分钟；
步骤三、后处理：反应结束后，取出钛片，蒸馏水洗净后放入装有1％I型胶原酶2ml的瓶中，消化30秒；取出钛片，蒸馏水洗净后超声10分钟，取出于80℃真空干燥，得到本发明的产品。
优选的是，所述的医用钛的制备方法中，所述甲基丙烯酸聚乙二醇甲基醚酯的用量为70-90mmol，所述甲基丙烯酸乙二醇酯用量为20-40mmol，所述水的用量为40-60ml，所述乙醇用量为10-20ml。
优选的是，所述的医用钛的制备方法中，所述成骨细胞的密度为2×104/ml，用量为0.5-2ml。
优选的是，所述的医用钛的制备方法中，所述CuBr和α-溴代苯乙酸甲酯的用量分别为0.05-0.1mol和0.01-0.05mol。
本发明具有以下有益效果：首先，本发明在钛金属表面先引入3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷附着层，再引入聚乙二醇类化合物附着层，既提高了聚乙二醇类化合物在钛金属表面的附着能力，防止脱落，又利用聚乙二醇类化合物提高了钛金属抗细菌粘附能力，避免细菌在钛金属表面粘附繁殖。
其次，本发明在引入聚乙二醇类化合物附着层的过程中利用分子印迹方法，先将成骨细胞引入聚乙二醇类化合物附着层中，再利用胶原酶将成骨细胞去除，使聚乙二醇类化合物附着层形成与成骨细胞空间构型相匹配的空穴，使钛金属材料具有对成骨细胞分子有效识别的功能。利用该方法制备的材料在作为植入体植入体内后，有利于成骨细胞在该材料表面固定生长。
再次，本发明先用去离子水和丙酮对钛金属基体表面进行超声清洗，减少钛金属表面氧化膜对附着层的影响，增大附着层和钛金属表面的接触面积，提高附着层和钛金属基体的结合力。
附图说明
图1为本发明所述钛金属材料与传统钛片对成骨细胞增殖活性影响的比较结果对照图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做详细说明，以令本领域普通技术人员参阅本说明书后能够据以实施。
如图1、表1和表2所示，
一种医用钛金属材料，其具有抗细菌粘附和促成骨细胞生长功能，其中，所述包括：
医用钛金属基体，先对其表面进行去除氧化膜和去油处理后得到备用的钛金属基体；
第一附着层，其为3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷附着层，其附着在所述基体的表面，通过共价键与所述基体相连，偶联剂3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷与钛金属基体表面形成化学键，而所述偶联剂端基为双键，在自由基聚合时双键打开跟下一步的聚乙二醇类化合物反应；
第二附着层，其为聚乙二醇类化合物附着层，其附着在所述第一附着层的表面，通过化学键与第一附着层相连；
其中，所述第二附着层中还具有与成骨细胞空间构型相匹配的空穴。
所述的医用钛金属材料中，所述聚乙二醇类化合物由甲基丙烯酸聚乙二醇甲基醚脂和双甲基丙烯酸乙二醇脂在乙醇环境下发生交联反应得到，在这里交联剂为双甲基丙烯酸乙二醇脂。
所述的医用钛金属材料中，所述甲基丙烯酸聚乙二醇甲基醚脂的分子量为：900-1100，所述双甲基丙烯酸乙二醇脂的分子量为：200-300。
所述的医用钛金属材料中，所述空穴是使用分子印迹方法，在所述甲基丙烯酸聚乙二醇甲基醚脂和双甲基丙烯酸乙二醇脂发生交联反应的过程中引入成骨细胞，然后再使用胶原酶去除成骨细胞得到的，所述醚脂和醇脂交联反应后形成一种网络结构的较稳定的聚乙二醇类化合物分子，在反应的过程中引入成骨细胞，待反应完毕后将成骨细胞去除，即可在聚乙二醇类化合物的结构中留下能与成骨细胞空间构型相匹配的空穴。
一种医用钛金属材料的制备方法，其中，所述包括以下步骤：
步骤一、预处理：将基体钛金属用丙酮、乙醇和蒸馏水依次超声30分钟，去除基体表面的油膜和氧化膜，丙酮和乙醇都能去除基体表面的油膜和氧化膜，蒸馏水为去离子蒸馏水，其作为清洗基体表面化学药剂的清洗剂，接着80℃真空干燥，然后将钛片浸泡于体积分数为5％的3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，浸泡1小时，蒸馏水洗净，干燥，得到处理过的钛片；
步骤二、分子印迹方法结合表面引发原子转移自由基聚合法进行表面改性：将甲基丙烯酸聚乙二醇甲基醚酯、双甲基丙烯酸乙二醇酯加入水和乙醇中，搅拌均匀，加入成骨细胞，搅拌均匀；加入面积为1×1cm2钛片，加入CuBr和α-溴代苯乙酸甲酯，通氮气保护下100℃反应30分钟，在这里选用分子量为1000的甲基丙烯酸聚乙二醇甲基醚酯；
步骤三、后处理：反应结束后，取出钛片，蒸馏水洗净后放入装有1％I型胶原酶2ml的瓶中，消化30秒；取出钛片，蒸馏水洗净后超声10分钟，取出于80℃真空干燥，得到本发明的产品。
所述的医用钛的制备方法中，所述甲基丙烯酸聚乙二醇甲基醚酯的用量为70-90mmol，所述甲基丙烯酸乙二醇酯用量为20-40mmol，所述水的用量为40-60ml，所述乙醇用量为10-20ml。
所述的医用钛的制备方法中，所述成骨细胞的密度为2×104/ml，用量为0.5-2ml。
所述的医用钛的制备方法中，所述CuBr和α-溴代苯乙酸甲酯的用量分别为0.05-0.1mol和0.01-0.05mol。
实施例1
一、产品制备
将基体钛金属用丙酮、乙醇和蒸馏水依次超声30分钟，80℃真空干燥，然后将钛片浸泡于体积分数为5％的3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，浸泡1小时，蒸馏水洗净，干燥，得到处理过的钛金属基体。将80mmol分子量为1000的甲基丙烯酸聚乙二醇甲基醚酯、30mmol双甲基丙烯酸乙二醇酯加入50ml水和15ml乙醇中，搅拌均匀，加入1mL密度为2×104/ml的成骨细胞，搅拌均匀。加入面积为1×1cm2钛片，加入0.05molCuBr，0.01molα-溴代苯乙酸甲酯，通氮气保护下100℃反应30分钟。反应结束后，取出钛片，蒸馏水洗净后放入装有1％I型胶原酶2ml的瓶中，消化30秒。取出钛片，蒸馏水洗净后超声10分钟，取出于80℃真空干燥，得到本发明的产品。
二、抗细菌粘附性能实验
实验过程：每个试样表面接种1ml浓度为105的菌液在37℃培养1d后，试样用PBS轻轻漂洗3次以去除未粘附的细菌，然后试样上粘附的细菌用超声振荡(40W)5min洗脱到1ml蒸馏水中，洗脱液用来检测试样表面粘附细菌中的活菌数。用倍比稀释和涂布培养法检测活菌数。
实验结果：
表1本发明产物对各细菌的抗粘附率
| 细菌 | ATCC 6538 | ATCC 25922 | ATCC 10231 | ATCC 9372 |
| 抗细菌粘附率 | 99.99％ | 99.98％ | 100％ | 99.98％ |
表1表明，由本发明制得的产品对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、大肠埃希氏菌(ATCC25922)、白假丝酵母(ATCC10231)、枯草芽孢杆菌黑色变种(ATCC9372)都具有很强的抗粘附性能，其抗细菌粘附率达99％以上。
三、细胞活性检测
实验过程：试样置于24孔板中(每组设三个平行孔)。1ml密度为2×104/ml的细胞悬液接种于试样表面，然后培养1、4和7d。到预定时间点后，试样用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液轻柔漂洗三次后转移到新的24孔板内。每孔加入200μl浓度为5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐和800μl无血清无酚红DMEM培养基。37℃孵育4h后吸弃上清，加入1ml二甲基亚砜溶解生成的结晶物，每孔取200μl溶解液转到96孔培养板，用分光光度计于490nm处测其OD值。取传统的钛片重复上述实验并记录下其OD的值。
实验结果：如图1所示，本发明的产物的OD值和传统钛片的OD值都随天数的增长而增加，但很明显本发明的产物的OD值增加的幅度更大，说明本产品具有更强的细胞增殖活性。
四、细胞毒性分析
实验过程：以乳酸脱氢酶(LDH)的活性作为细胞毒性指标来评估本发明产物的细胞毒性大小。试样置于24孔板中，将1×104个细胞的成骨细胞接种到24孔板中，并培育1天。收集培养液，离心后取上清用于LDH活性检测。
实验结果：
表2本发明产物和传统钛片的LDH活性(U/L)
| 钛片 | 本发明产物 | |
| LDH活性 | 236 | 205 |
如表2所示，本发明产物的LDH活性比传统钛片的LDH活性低，说明本发明产物对细胞没有毒性。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (7)
1.一种医用钛金属材料，其具有抗细菌粘附和促成骨细胞生长功能，其特征在于，包括：
医用钛金属基体；
第一附着层，其为3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷附着层，其附着在所述基体的表面，通过共价键与所述基体相连；
第二附着层，其为聚乙二醇类化合物附着层，其附着在所述第一附着层的表面，通过化学键与第一附着层相连，所述聚乙二醇类化合物由甲基丙烯酸聚乙二醇甲基醚脂和双甲基丙烯酸乙二醇脂在乙醇环境下发生交联反应得到；
其中，所述第二附着层中还具有与成骨细胞空间构型相匹配的空穴。
2.如权利要求1所述的医用钛金属材料，其特征在于，所述甲基丙烯酸聚乙二醇甲基醚脂的分子量为：900-1100，所述双甲基丙烯酸乙二醇脂的分子量为：200-300。
3.如权利要求1所述的医用钛金属材料，其特征在于，所述空穴是使用分子印迹方法，在所述甲基丙烯酸聚乙二醇甲基醚脂和双甲基丙烯酸乙二醇脂发生交联反应的过程中引入成骨细胞，然后再使用胶原酶去除成骨细胞得到的。
4.一种如权利要求1所述的医用钛金属材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、预处理：将基体钛金属用丙酮、乙醇和蒸馏水依次超声30分钟，80℃真空干燥，然后将钛金属浸泡于体积分数为5％的3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，浸泡1小时，蒸馏水洗净，干燥，得到处理过的钛金属；
步骤二、分子印迹方法结合表面引发原子转移自由基聚合法进行表面改性：将甲基丙烯酸聚乙二醇甲基醚酯、双甲基丙烯酸乙二醇酯加入水和乙醇中，搅拌均匀，加入成骨细胞，搅拌均匀；加入面积为1×1cm2的处理过的钛金属，加入CuBr和α-溴代苯乙酸甲酯，通氮气保护下100℃反应30分钟；
步骤三、后处理：反应结束后，取出钛金属，蒸馏水洗净后放入装有1％I型胶原酶2ml的瓶中，消化30秒；取出钛金属，蒸馏水洗净后超声10分钟，取出于80℃真空干燥，得到本发明所述的钛金属材料。
5.如权利要求4所述的医用钛金属材料的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸聚乙二醇甲基醚酯的用量为70-90mmol，所述甲基丙烯酸乙二醇酯用量为20-40mmol，所述水的用量为40-60ml，所述乙醇用量为10-20ml。
6.如权利要求4所述的医用钛金属材料的制备方法，其特征在于，所述成骨细胞的密度为2×104/ml，用量为0.5-2ml。
7.如权利要求4所述的医用钛金属材料的制备方法，其特征在于，所述CuBr和α-溴代苯乙酸甲酯的用量分别为0.05-0.1mol和0.01-0.05mol。
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