CN105327398A - 抗菌涂层组合物、包含抗菌涂层的医用植入材料及其制备方法 - Google Patents

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杨云
张艳梅
丁希彧
林理文
唐佩福
张立海
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Abstract

本发明提供了一种抗菌涂层组合物，包括贻贝粘附蛋白和纳米银颗粒。本发明还提供了一种包含抗菌涂层的医用植入材料及其制备方法。本发明组合物形成的抗菌涂层，具有非常优秀的生物相容性和抗菌活性，无毒无副作用，无排斥反应，是一种性能优良、安全可靠的抗菌涂层。本发明提供的包含抗菌涂层的医用植入材料抗菌活性强，生物相容性好，可适用于多种基材材料，且制造工艺简单，普适性强，可实现批量生产和临床应用，具有重要的社会意义和经济意义。

Description

抗菌涂层组合物、包含抗菌涂层的医用植入材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及医用植入材料领域，具体涉及一种抗菌涂层组合物、包含抗菌涂层的医用植入材料及其制备方法。
背景技术
随着现代社会老年化和生活节奏的加快，骨伤病患者急剧增加，据统计全球每年人工假体置换病例超过200万例，预测到2030年，美国仅人工全膝关节假体置换一项将达到每年350万例。骨科植入体和内固定器械的细菌感染可引发灾难性并发症，是当前骨科治疗康复非常棘手的一大难题，不仅给病人带来巨大痛苦，而且浪费了大量医疗卫生资源，给国家和个人均造成巨大的经济损失。通过对医用植入体或内固定器械的表面抗菌修饰可赋予植入体抗菌性能，目前关于植入体表面各类抗菌涂层的研究已有大量报道，各种抗菌涂层技术层出不穷、发展快速。植入体表面抗菌技术涉及多个学科，发展高性能的抗菌医用植入材料对人类健康至关重要。
银是一种杀菌能力最强的广谱抗菌剂，而且细菌不对其产生耐药性。若将银颗粒的尺寸降至纳米级，其抗菌性能还可大大加强。然而，银离子同时也是一把双刃剑，在杀灭细菌的同时，对人体也存在一定的毒性。如何进一步加强银离子的抗菌性，又能大幅度降低其生物毒性，是当前研究的一大瓶颈。
海洋贻贝通过分泌贻贝粘附蛋白(MusselAdhesiveProtein,MAP)可牢固地粘附在海洋中各种固体表面(如礁石等)或任何海洋构筑物表面。贻贝粘附蛋白的粘附性几乎是万能的，具有粘附速度快、耐水、耐腐蚀、生物相容性好、无毒害作用等优点，不会引起人体免疫反应。随着科技的发展，天然贻贝粘附蛋白的提取与纯化已获得技术上的突破。WO2006/020594A2公布了贻贝黏附蛋白Mefp-1重组子的克隆与表达。美国专利US6,995,012B1公布了贻贝黏附蛋白Mefp-1重组子的克隆与表达。CN102433357A公布了植物表达贻贝粘合蛋白Mefp-5的方法。这些新技术为贻贝粘附蛋白的材料来源提供了多元化的途径。
发明内容
为改善现有医用植入材料的性能，提高其生物安全性和抗菌性能，本发明的一个目的是提供一种抗菌涂层组合物。
本发明的另一目的是提供一种包含抗菌涂层的医用植入材料。
本发明的另一目的是提供包含抗菌涂层的医用植入材料的制备方法。
本发明提供的抗菌涂层组合物包括贻贝粘附蛋白和纳米银颗粒。
其中，所述抗菌涂层组合物中的纳米银颗粒的质量百分比为1～50％。
其中，所述贻贝粘附蛋白选自Mefp-1、Mefp-2、Mefp-3、Mefp-4、Mefp-5、Mefp-6中的一种或多种。
其中，所述纳米银颗粒的粒径为1～30nm。
本发明提供的包含抗菌涂层的医用植入材料，包括植入材料基材，所述植入材料基材表面具有以上技术方案任一项所述抗菌涂层组合物形成的抗菌涂层。
其中，所述抗菌涂层的厚度为10～200nm。
其中，所述植入材料基材选自乳胶、聚乳酸、聚氨酯、硅胶、生物陶瓷、不锈钢、金属钛、钛合金、镁合金或钽合金。
本发明提供的所述医用植入材料的制备方法为：首先在所述植入材料基材表面形成贻贝粘附蛋白膜层，然后置于含有银离子的溶液中浸渍即得。
进一步地，所述制备方法包括以下步骤：
S1：将植入材料基材置于贻贝粘附蛋白水溶液中浸渍，清洗，干燥，得到包含贻贝粘附蛋白膜层的基材；
S2：将步骤S1所得的基材置于银离子溶液中浸渍，清洗，干燥后即得。
所述步骤S1中，所述贻贝粘附蛋白水溶液的浓度为0.05～5mg/ml，pH值为3.0～9.0，浸渍时间为5～120分钟。
所述步骤S2中，所述银离子溶液为硝酸银溶液，其浓度为0.0001～1M，浸渍时间为5分钟～48小时。
本发明的技术方案中，充分利用了贻贝粘附蛋白的粘附性、生物相容性和生物还原性。通过贻贝粘附蛋白的粘附性，可将纳米银颗粒固定于基材表面使其发挥抗菌功能，而且，当涂层基材为金属或合金时，还可以抑制金属或合金的腐蚀，进一步提高了基材材料的安全性和耐用性。贻贝粘附蛋白还具有良好的生物相容性，可促进细胞粘附、铺展和增殖，尤其适用于医学领域的使用。而贻贝粘附蛋白的生物还原性可以在制备涂层时将银离子还原成纳米级的银颗粒，使得制备过程更加简单，制造成本极低。
采用本发明组合物形成的抗菌涂层，无色透明，对于基材的颜色没有明显影响，涂层粘合性极强，可使纳米银颗粒牢固附着于基材上，具有非常优秀的生物相容性和抗菌活性，相比于普通的纳米银涂层，生物毒性大大降低，因此特别适合用于医用植入材料。经检测发现，本发明所述的涂层无毒无副作用，无排斥反应，是一种性能优良、安全可靠的抗菌涂层。
本发明提供的包含抗菌涂层的医用植入材料表面颜色无明显变化，相比于未包含涂层的植入材料而言，抗菌活性大大增强，而且抗腐蚀能力也有明显改善，通过调整蛋白膜厚度以及纳米银颗粒的用量，可使植入材料满足不同的治疗要求。本发明提供的医用植入材料可适用于多种基材材料，且工艺简单，条件温和，普适性强，可实现批量生产和临床应用，具有重要的社会意义和经济意义。
附图说明
图1是实施例1所得含有抗菌涂层的金属钛片的X射线光电子能谱谱图；
图2表示小鼠颅顶骨前成骨细胞(MC3T3-E1)在不同材料表面孵育20h后的荧光染色情况，其中，(a)钛板；(b)实施例1材料样品；(c)实施例2材料样品；(d)实施例3材料样品；
图3表示金黄色葡萄球菌在不同材料表面孵育4h后的荧光染色情况，其中，(a)钛板；(b)实施例1材料样品；(c)实施例2材料样品；(d)实施例3材料样品；
图4是实施例1-3所得材料样品以及未经处理钛片的大肠杆菌抑菌圈照片。
具体实施方式
本发明的一个方面提供了一种抗菌涂层组合物，该抗菌涂层组合物包括贻贝粘附蛋白和纳米银颗粒。
利用贻贝粘附蛋白的粘附性和生物相容性、以及纳米银的抗菌性，可得到粘附性、生物相容性、抗菌性优异的涂层组合物，可适用于各种不同材质的涂覆基材，对于金属、合金的基材而言，使用该涂层组合物后还能改善其抗腐蚀性能。
本发明的抗菌涂层组合物中，贻贝粘附蛋白和纳米银颗粒的用量可以为任意比例，通常由本领域普通技术人员根据粘附基材和抗菌要求进行调整即可。
在本发明一个优选的实施方式中，纳米银颗粒在所述抗菌涂层组合物中的质量百分比可以为1～50％。在一个更优选的实施方式中，纳米银颗粒在所述抗菌涂层组合物中的质量百分比可以为5～30％。
本发明的抗菌涂层组合物中，贻贝粘附蛋白可以为现有的任意种类，包括商品化的产品或根据生物法所制得的产品。在本发明一个优选的实施方式中，贻贝粘附蛋白选自Mefp-1、Mefp-2、Mefp-3、Mefp-4、Mefp-5、Mefp-6中的一种或多种。
在本发明一个优选的实施方式中，纳米银颗粒的粒径可以为1～30nm。
本发明的第二个方面提供了一种包含抗菌涂层的医用植入材料，其包括植入材料基材，植入材料基材表面具有以上本发明所述抗菌涂层组合物形成的抗菌涂层。
其中，植入材料基材可以为任意种类的医用材料，如无机材料、有机高分子材料、金属或合金材料等等。在本发明一个优选的实施方式中，植入材料基材包括但不限于乳胶、聚乳酸、聚氨酯、硅胶、生物陶瓷、不锈钢、金属钛、钛合金、镁合金、钽合金等。
在本发明一个优选的实施方式中，植入材料基材在使用前进行清洁处理。
在本发明一个优选的实施方式中，医用植入材料的抗菌涂层厚度、所含纳米银颗粒的含量等都没有特别限定，可根据实际使用需要进行调整，且不会对人体造成毒害即可。
在本发明一个优选的实施方式中，抗菌涂层厚度可以为10～200nm，在一个优选的实施方式中，抗菌涂层厚度可以为20～50nm。
本发明的第三个方面提供了包含抗菌涂层的医用植入材料的制备方法，该方法为：首先在植入材料基材表面形成贻贝粘附蛋白膜层，然后置于含有银离子的溶液中浸渍即得。
进一步地，所述制备方法包括以下步骤：
S1：将植入材料基材置于贻贝粘附蛋白水溶液中浸渍，清洗，干燥，得到包含贻贝粘附蛋白膜层的基材；
S2：将步骤S1所得的基材置于银离子溶液中浸渍，清洗，干燥后即得。
步骤S1中，贻贝粘附蛋白水溶液的浓度和浸渍时间可根据所需蛋白膜层进行调整，在本发明一个优选的实施方式中，贻贝粘附蛋白水溶液的浓度可以为0.05～5mg/ml，浸渍时间可以为5～120分钟。
步骤S1中，贻贝粘附蛋白水溶液的pH值可以为酸性，也可以为碱性，优选的pH值为3.0～9.0，可通过常用的稀酸、稀碱溶液或缓冲溶液调节至所需的pH值，例如，稀氢氧化钠、稀盐酸等。
步骤S2中，银离子溶液优选使用硝酸银溶液，硝酸银溶液的浓度和浸渍时间可根据所需的纳米银的量进行调整，在本发明一个优选的实施方式中，硝酸银溶液的浓度可以为0.0001～1M(摩尔/升)，浸渍时间可以为5分钟～48小时。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将进一步描述本发明的示例性实施例的技术方案。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。其中，贻贝粘附蛋白来源于瑞典生物聚合产品研发公司(BiopolymerProductsAB,Gothenburg,Sweden)，硝酸银为市售产品，其它试剂、材料等如未特别说明均为市售产品。
Calcein-AM活细胞染色流程：Calcein-AM由于在Calcein(钙黄绿素)的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein(钙黄绿素)留在细胞内，发出强绿色荧光。将实施例所得的包含抗菌涂层的医用植入材料与细胞共培养20h，采用Calcein-AM对材料表面活细胞进行荧光标记。调整细胞浓度至1×104/ml，酒精消毒后置于24孔板内，按每孔1ml的量加入细胞悬液，5％二氧化碳培养箱37℃下培养20h后，PBS漂洗3遍，加入500μl终浓度1μMCalcein-AM(sigmaC1359)溶液，孵育15min，荧光显微镜下进行观察。
细菌染色流程：吖啶橙(AO)能对细菌进行染色，在蓝光激发下使之发出明亮的绿色荧光。调整细菌浓度为1×107/ml，将实施例所得的包含抗菌涂层的医用植入材料与菌液37℃下共孵育4h后，取出，PBS漂洗3遍，加入500μlPBS配制的吖啶橙染料，终浓度为100μg/ml，孵育10min取出，荧光显微镜下进行观察。
实施例1含有抗菌涂层的金属钛片的制备
(1)配制Mefp-1水溶液，调整蛋白浓度为0.5mg/ml，pH值为4.0。将洁净的钛片(纯度>99％)浸渍在Mefp-1水溶液2h，取出钛片清洗干燥，获得负载有Mefp-1蛋白膜层的钛片。
(2)将负载有Mefp-1蛋白膜层的钛片浸入0.01M的硝酸银溶液中处理6h后，取出，超声清洗后干燥，即在钛片表面得到均匀分布的贻贝粘附蛋白/纳米银颗粒抗菌涂层，涂层厚度约为30nm。
所得含有抗菌涂层的钛片的X射线光电子能谱谱图如图1所示，表明钛片表面存在贻贝粘附蛋白组分和单质银。
由图2的b图可知，所得含有抗菌涂层的钛片对于MC3T3-E1细胞具有良好的促粘附及增殖作用，因而具有良好的生物相容性。而通过图3的b图以及图4可知，所得含有抗菌涂层的钛片相对于未含涂层的钛片而言，抗菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)效果优异。
实施例2含有抗菌涂层的钛合金片的制备
(1)配制Mefp-2水溶液，调整蛋白浓度为1mg/ml，pH值为6.0。将洁净的钛合金片(Ti6Al4V)浸渍在Mefp-2水溶液1h，取出钛合金片清洗干燥，获得负载有Mefp-2蛋白膜层的钛合金片。
(2)将负载有Mefp-2蛋白膜层的钛合金片浸入0.005M的硝酸银溶液中处理8h后，取出，超声清洗后干燥，即在钛合金片表面得到均匀分布的贻贝粘附蛋白/纳米银颗粒抗菌涂层，涂层厚度约为50nm。
所得含有抗菌涂层的钛合金片兼具良好生物相容性(图2c)和抗菌性能(图3c、图4)。
实施例3含有抗菌涂层的不锈钢片的制备
(1)配制Mefp-3水溶液，调整蛋白浓度为1mg/ml，pH值为7.0。将洁净的316L不锈钢片(纯度>99％)浸渍在Mefp-3水溶液1h，取出不锈钢片清洗干燥，获得负载有Mefp-3蛋白膜层的不锈钢片。
(2)将负载有Mefp-3蛋白膜层的316L不锈钢片浸入0.01M的硝酸银溶液中处理4h后，取出，超声清洗后干燥，即在不锈钢片表面得到均匀分布的贻贝粘附蛋白/纳米银颗粒抗菌涂层，涂层厚度约为45nm。
所得含有抗菌涂层的不锈钢片兼具良好生物相容性(图2d)和抗菌性能(图3d、图4)。
实施例4含有抗菌涂层的镁钙合金片的制备
(1)配制Mefp-4水溶液，调整蛋白浓度为1mg/ml，pH值为8.0。将洁净的镁钙合金片浸渍在Mefp-4水溶液1h，取出镁钙合金片清洗干燥，获得负载有Mefp-4蛋白膜层的镁钙合金片。
(2)将负载有Mefp-4蛋白膜层的镁钙合金片浸入0.01M的硝酸银溶液中处理4h后，取出，超声清洗后干燥，即在镁钙合金片表面得到均匀分布的贻贝粘附蛋白/纳米银颗粒抗菌涂层，涂层厚度约为50nm。
所得含有抗菌涂层的镁钙合金片兼具良好生物相容性和抗菌性能。
实施例5含有抗菌涂层的硅橡胶膜的制备
(1)配制Mefp-1和Mefp-5的混合水溶液，调整蛋白浓度分别为0.5mg/ml和1mg/ml，pH值为8.5。将洁净的硅橡胶膜浸泡在混合水溶液中1h，取出硅橡胶膜清洗干燥，获得负载有Mefp-1，5蛋白膜层的硅橡胶膜。
(2)将负载有Mefp-1和Mefp-5蛋白膜层的硅橡胶膜浸入0.01M的硝酸银溶液中处理5h后，取出，超声清洗后干燥，即在硅橡胶膜表面得到均匀分布的贻贝粘附蛋白/纳米银颗粒抗菌涂层，涂层厚度约为20nm。
所得含有抗菌涂层的硅橡胶膜兼具良好生物相容性和抗菌性能。
实施例6-16含有抗菌涂层的医用植入材料的制备
采用表1所示原料制备含有抗菌涂层的医用植入材料，制备过程同实施例1，所得材料均具有良好的生物相容性和抗菌性能。
表1
实施例18
蛋白类型为Mefp-1，浓度为1mg/ml，AgNO3浓度分别为0.0001、0.001、0.01、0.1、1M，其余步骤同实施例1，所得含有抗菌涂层的钛片的XPS数据如表2所示。
表2
通过以上实施例以及生物性能测试可知，含有本发明所述抗菌涂层的材料抗菌性能和生物相容性优异，以此作为医用植入材料可明显提高抗菌性，且不会对人体产生不良反应。
虽然为了说明本发明，已经公开了本发明的优选实施方案，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离权利要求书所限定的本发明构思和范围的情况下，可以对本发明做出各种修改、添加和替换。

Claims (11)

1.一种抗菌涂层组合物，其特征在于，所述抗菌涂层组合物包括贻贝粘附蛋白和纳米银颗粒。
2.根据权利要求1所述的抗菌涂层组合物，其特征在于，所述抗菌涂层组合物中，纳米银颗粒的质量百分比为1～50％。
3.根据权利要求1或2所述的抗菌涂层组合物，其特征在于，所述贻贝粘附蛋白选自Mefp-1、Mefp-2、Mefp-3、Mefp-4、Mefp-5、Mefp-6中的一种或多种。
4.根据权利要求1或2所述的抗菌涂层组合物，其特征在于，所述纳米银颗粒的粒径为1～30nm。
5.一种包含抗菌涂层的医用植入材料，包括植入材料基材，其特征在于，所述植入材料基材表面具有权利要求1-4任一项所述抗菌涂层组合物形成的抗菌涂层。
6.根据权利要求5所述的医用植入材料，其特征在于，所述抗菌涂层的厚度为10～200nm。
7.根据权利要求5或6所述的医用植入材料，其特征在于，所述植入材料基材选自乳胶、聚乳酸、聚氨酯、硅胶、生物陶瓷、不锈钢、金属钛、钛合金、镁合金或钽合金。
8.权利要求5-7任一项所述医用植入材料的制备方法，其特征在于，首先在所述植入材料基材表面形成贻贝粘附蛋白膜层，然后置于含有银离子的溶液中浸渍即得。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将植入材料基材置于贻贝粘附蛋白水溶液中浸渍，清洗，干燥，得到包含贻贝粘附蛋白膜层的基材；
S2：将步骤S1所得的基材置于银离子溶液中浸渍，清洗，干燥后即得。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述贻贝粘附蛋白水溶液的浓度为0.05～5mg/ml，pH值为3.0～9.0，浸渍时间为5～120分钟。
11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述银离子溶液为硝酸银溶液，其浓度为0.0001～1M，浸渍时间为5分钟～48小时。
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