CN111592674B - 一种层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料及其制备方法与应用 - Google Patents

一种层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物纳米复合材料及骨组织修复材料领域，公开了一种层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料及其制备方法与应用。本发明的聚乳酸复合材料由基材、粘结层和修饰层构成，所述基材为聚乳酸，所述粘结层为聚多巴胺，所述修饰层由带正电的甲壳素晶须和带负电的甲壳素晶须层层交替自组装构成。其主要特征在于表面的甲壳素晶须层厚度及其带电性可控，从而可以灵活调控复合材料的力学性能及其表面的生物学功能。本发明还提供一种该复合材料的制备方法。本发明复合材料不仅具有良好的力学性能，优异的细胞亲和性、成骨活性和抗菌性能，而且，其力学性能和表面的生物功能性可调控，有望在骨组织修复等生物医学领域具有良好的应用前景。

Description

一种层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料及其制备 方法与应用
技术领域
本发明属于生物纳米复合材料及骨组织修复材料领域，具体涉及一种层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料及其制备方法与应用。
背景技术
骨组织缺损是骨科和整形外科中常见的问题，如何实现骨组织的高效修复成为医学研究的热点话题。在众多骨修复手段中，使用骨修复材料辅助治疗骨缺损已被证明具有可行性。聚乳酸(PLA)因其良好的生物相容性、可降解吸收性以及良好的加工性能，已经被批准用于临床骨修复。但随着对PLA材料的研究深入，其作为骨修复材料的局限性也随之凸显，如不理想的力学性能和成骨活性。
为了改善PLA材料的性能，使用纳米填料如羟基磷灰石、生物活性玻璃、碳纳米管、天然黏土等与PLA材料混合制备性能良好的复合材料是最常见的方法之一。甲壳素晶须(CHWs)，一种针棒状纳米单晶，可通过自然界产量第二的天然多糖甲壳素酸解制备。甲壳素晶须不仅具有优异的生物相容性、生物降解性、成骨活性以及抗菌和抗炎特性，而且具有超高强度、高模量和高轴向刚度。凭借以上优势，甲壳素晶须近年被大量报道作为纳米填料引入到聚合物基体中以提高聚合物的力学性能、抗菌性能等(CN103319739B)。本发明申请人前期也通过溶液共混法将甲壳素晶须引入聚乳酸基体，但纳米尺寸的甲壳素晶须在聚乳酸基体中易于团聚，且与基体的界面结合力不强，因此，甲壳素晶须优异的综合性能并不能在所制备的复合材料中得到充分体现。因此，寻求一种更有效的甲壳素晶须和聚乳酸的复合手段具有现实意义。
众所周知，生物材料的表面结构与性能直接影响其生物学性能的发挥，构建表面拓扑结构或修饰功能性物质是生物材料改性最常用的方法。本发明申请人前期针对甲壳素晶须和聚乳酸共混复合体系存在的不足，通过淋涂法在聚乳酸表面修饰一层有序化甲壳素晶须层，制备的复合材料在力学性能和成骨活性等方面显著优于甲壳素晶须/聚乳酸共混复合材料(CN201811374028.6)。
然而，通过淋涂工艺将甲壳素晶须悬浮液简单地涂在聚乳酸膜表面，既无法控制甲壳素晶须层的厚度，也难以保证甲壳素晶须层厚度的均匀性，而复合膜力学性能的变化直接和甲壳素晶须层的厚度相关，淋涂工艺不能控制甲壳素晶须层的厚度，复合膜的力学性能就无法灵活调控，从而难以满足不同骨组织修复对材料力学性能的个性化要求。此外，相同带电性质的甲壳素晶须简单的堆积在一起，将导致甲壳素晶须层内晶须与晶须之间的作用力较弱，难以保证晶须层稳定附着在膜表面，这势必会降低复合膜应用时的稳定性以及生物功能性的发挥。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的是提供一种层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料。
本发明涉及的复合材料采用聚乳酸为基材，聚多巴胺为粘结层，不同带电性的甲壳素晶须为修饰层，修饰层由带正电的甲壳素晶须和带负电的甲壳素晶须交替构成，基于静电层层自组装于粘结层表面，使得所制备的复合材料表面的晶须层厚度及其带电性可控，从而可以灵活调控复合材料的力学性能及其表面的生物学功能。
本发明的另一目的在于提供一种上述层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料，具体由基材、粘结层和修饰层组成，所述基材为聚乳酸，提供了复合材料基本的力学性能；粘结层为聚多巴胺，可连接基材和修饰层并提高修饰层在基材表面的稳定性；修饰层为带正电的甲壳素晶须和带负电的甲壳素晶须基于静电层层交替自组装构成，可实现复合材料表面的晶须层厚度及其带电性可控。
优选的，所述层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料，其修饰层即表面修饰的甲壳素晶须层的厚度范围为5-500nm，优选为70-200nm。
优选的，所述层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料，其表面的Zeta电位值为-16.14eV-+16.98eV。
所述的层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料的制备方法包括以下步骤：
步骤一：制备聚乳酸膜，并在聚乳酸膜表面引入聚多巴胺层，制备聚多巴胺/聚乳酸复合膜；
步骤二：分别制备带正电的甲壳素晶须和带负电的甲壳素晶须，并分别配制成水悬浮液；
步骤三：将聚多巴胺/聚乳酸复合膜依次浸泡于步骤二制备的带正电的甲壳素晶须和带负电的甲壳素晶须的水悬浮液中，重复该浸泡过程，实现层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料的制备。
优选的，步骤一中，所述聚乳酸膜的制备方法为常规方法即可，如可采用常规溶液浇铸法。所述聚乳酸可以为左旋聚乳酸或外消旋聚乳酸，重均分子量优选为8-50万。所述溶液浇铸法采用的有机溶剂可为氯仿、二氯甲烷、甲苯或四氢呋喃，配制聚乳酸溶液的浓度范围优选为0.2-3mg/mL。
优选的，步骤一中，所述聚多巴胺/聚乳酸复合膜的制备可参考CN109575338A，可包括以下具体步骤：将聚乳酸膜浸泡于浓度为0.2-5.0g/L的盐酸多巴胺溶液中，反应0.5-24h，得到聚多巴胺/聚乳酸复合膜。
所述盐酸多巴胺溶液通过将盐酸多巴胺溶于Tris缓冲溶液得到。所述Tris缓冲溶液的pH为8.5。上述反应在室温下进行即可，优选在避光条件下进行。所述反应后的膜可用水进行冲洗，除去表面多余的溶液，并进行干燥，得到干燥后的聚多巴胺/聚乳酸复合膜。
优选的，步骤二中，所述带正电的甲壳素晶须可采用酸解法制备，可由包括以下具体步骤的方法制备得到：将甲壳素粉末加入到0.5-5mol/L的HCl水溶液中，惰性气氛下加热至60-110℃搅拌反应0.5-6h，分离，透析，得到带正电的甲壳素晶须。
所述的惰性气氛可为氮气、氩气等常规惰性气氛氛围。
所述分离可采用离心分离等。所述透析用水进行透析，优选透析至透析液pH为7.透析后产物可通过冷冻干燥，并进行研磨，得到最终产物。
优选的，步骤二中，所述带负电的甲壳素晶须可采用包括甲壳素和马来酸酐反应制备，可由包括以下具体步骤的方法制备得到：将甲壳素和马来酸酐在惰性气氛下于55-110℃下反应0.5-8h，分离得到带负电的甲壳素晶须。
所述反应后产物可用乙醇洗涤、水离心、冷冻干燥并研磨处理。
优选的，所述水悬浮液的浓度可相同或不同的分别为0.5-10wt％。
所述水悬浮液通过分别将带正电的甲壳素晶须和带负电的甲壳素晶须加入水中均化即可获得。
所述均化的时间优选为0.5-8h。所述均化可采用细胞粉碎机在150-1000w功率下进行。
所述均化后悬浮液优选调节pH为2.0-7.0。
优选的，步骤三中，所述浸泡的时间可为0.5-10h。所述复合膜浸泡一种水悬浮液后优选干燥再用于浸泡另一种水悬浮液。
进一步的，步骤三包括以下具体操作：将步骤一制备的聚多巴胺/聚乳酸复合膜先浸泡到步骤二制备的带正电的甲壳素晶须的水悬浮液中，0.5-10h后取出，干燥后，再浸泡于带负电的甲壳素晶须的水悬浮液中，0.5-10h后取出；根据需要可以多次重复上述操作，从而可以制备不同层数和厚度的甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料。
本发明采用静电层层自组装甲壳素晶须修饰聚乳酸材料表面，不同电性的甲壳素晶须交替构成修饰层，其稳定性显著增加，所制备的复合材料的力学性能显著优于共混法以及淋涂方式制备的甲壳素晶须/聚乳酸复合材料的力学性能，其不仅具有良好的力学性能，且力学性能可控，还具有优异的亲水性、细胞亲和性、成骨活性和抗菌性能，预期在生物医学领域具有良好的应用前景，特别是骨组织修复。
相比于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：
1.本发明设计制备不同带电性的甲壳素晶须，并基于静电层层自组装技术将不同带电性的甲壳素晶须交替修饰到聚乳酸材料表面，制备过程简单实用，易于规模化生产。
2.本发明采用静电层层自组装甲壳素晶须修饰聚乳酸材料表面，不同电性的甲壳素晶须交替构成修饰层，其稳定性显著增加，所制备的复合材料的力学性能显著优于共混法以及淋涂方式制备的甲壳素晶须/聚乳酸复合材料的力学性能。
3.本发明制备的层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料，实现了甲壳素晶须层的层数、厚度及其带电性可控，从而可以灵活调控复合材料的力学性能及其表面的生物学功能。
4.本发明制备的层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料，不仅具有良好的力学性能，且力学性能可控；还具有优异的亲水性、细胞亲和性、成骨活性和抗菌性能，预期在骨组织修复等生物医学领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中制备的两种甲壳素晶须的透射电镜照片；其中，A为带正电的甲壳素晶须CHWs；B为带负电的甲壳素晶须mCHWs。
图2为本发明实施例2中PDLLA、PPDA以及两种甲壳素晶须修饰的聚乳酸膜材料表面的Zeta电位的变化情况。
图3为本发明实施例2中制备的BP@CHW1+和BP@CHW2-复合膜表面的原子力显微镜照片。
图4为本发明实施例3中CP@CHW1+、CP@CHW2-和CP@CHW8-复合膜的断面扫描电镜照片。
图5为本发明实施例3中PDLLA、PPDA、CP@CHW1+和CP@CHW8-膜表面的小鼠前成骨细胞(MC3T3-E1)增殖情况图。
图6为本发明实施例3中PDLLA、PPDA、CP@CHW1+和CP@CHW8-膜表面的MC3T3-E1细胞的铺展和黏附行为。
图7为本发明实施例4中PDLLA、PPDA以及修饰多层甲壳素晶须的聚乳酸复合膜材料的力学性能。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。如无特别说明，本发明中所有原料和试剂均为市购常规的原料、试剂。实施例中各组分的用量以质量体积份计，g、mL。
实施例1：自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料的制备
步骤一：称量1.0质量份重均分子量为15w的外消旋聚乳酸(PDLLA)颗粒，倒入15体积份氯仿中溶解。搅拌溶解8h后，对溶液进行超声处理5min以除去溶液中的气泡，再倒入聚四氟乙烯培养皿内成型。在室温下挥发12h后，将其放入真空干燥箱中以40℃真空干燥6h以完全去除有机溶剂，得到PDLLA膜。将PDLLA膜进一步浸入1.0g/L盐酸多巴胺的Tris缓冲溶液(pH＝8.5)中，反应12h后取出冲洗、干燥，得到聚多巴胺/聚乳酸复合膜(PPDA)。
步骤二：将5质量份甲壳素粉末加入到1mol/L的HCl水溶液中，在N2气氛中加热至95℃并搅拌1.5h。随后，将上述悬浮液以3000r/min的速度离心10min，获得的沉淀物用去离子水稀释。重复离心-稀释过程3次。将所得产物用去离子水渗析，直至透析液的pH为7.0。最后，将所得产物冷冻干燥并研磨以获得带正电的甲壳素晶须(CHWs)。图1A为CHWs的透射电镜照片，可以看到CHWs为纳米尺寸的针须状，且具有较高的长径比。
称取100质量份马来酸酐放入三口烧瓶中，加热使马来酸酐固体熔融，将5质量份甲壳素粉末加入三口烧瓶中，在N2气氛下加热至100℃反应2h，将所得沉淀物用乙醇洗涤，并用去离子水离心10次以完全除去残留的马来酸酐。随后，将获得的沉淀物冷冻干燥并研磨以获得带负电的甲壳素晶须(mCHWs)。图1B为mCHWs的透射电镜照片，可以看到mCHWs同样为纳米尺寸的针须状，且具有较高的长径比。
将上述制备的晶须——CHWs和mCHWs，分别用去离子水配制成悬浮液，质量浓度选为4％。用细胞粉碎机在300w的功率下均化2h，分散均匀后调节两种悬浮液的pH值为4.3，得到用于自组装的两种甲壳素晶须水悬浮液。
步骤三：将干燥后的PPDA膜浸入步骤二制备的CHWs悬浮液中6h，然后用去离子水冲洗膜材料，以去除PPDA膜表面吸附的CHWs，最后室温干燥，获得表面修饰带正电甲壳素晶须的复合膜，标记为AP@CHW1+；通过将AP@CHW1+膜浸入步骤二制备的mCHWs悬浮液中6h，可以将带负电的mCHWs组装在AP@CHW1+膜的表面上。在洗涤和干燥之后，获得表面带负电的复合膜，标记为AP@CHW2-。重复上述步骤，在CHWs和mCHWs水悬浮液中分别交替自组装5次后，制备得到甲壳素晶须厚度为130±10nm的甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料。
实施例2：自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料的制备
步骤一：称量5.0质量份重均分子量为20w的外消旋聚乳酸(PDLLA)颗粒，倒入80体积份四氢呋喃中溶解。搅拌溶解10h后，对溶液进行超声处理10min以除去溶液中的气泡，再倒入聚四氟乙烯培养皿内成型。在室温下挥发24h后，将其放入真空干燥箱中以40℃真空干燥6h以完全去除有机溶剂，得到PDLLA膜。将PDLLA膜浸入1.5g/L盐酸多巴胺的Tris缓冲溶液(pH＝8.5)中，反应6h后取出冲洗、干燥，得到聚多巴胺/聚乳酸复合膜(PPDA)。
步骤二：将10质量份甲壳素粉末加入到3mol/L的HCl水溶液中，在N2气氛中加热至105℃并搅拌3h。随后，将上述悬浮液以3000r/min离心10min，获得的沉淀物用去离子水稀释。重复离心-稀释过程5次。将所得产物用去离子水渗析，直至透析液的pH为7.0。最后，将所得产物冷冻干燥并研磨以获得带正电的甲壳素晶须(CHWs)。
称取80质量份马来酸酐放入三口烧瓶中，加热至100℃使马来酸酐固体熔融，将4.0质量份甲壳素粉末放入三口烧瓶中，在N2气氛下加热至85℃反应5h，将所得沉淀物用乙醇洗涤，并用去离子水离心8次以完全除去残留的马来酸酐。随后，将获得的沉淀物冷冻干燥并研磨以获得带负电的甲壳素晶须(mCHWs)。
将上述制备的晶须——CHWs和mCHWs，分别用去离子水配制成悬浮液，质量浓度选为2％。用细胞粉碎机在400w的功率下均化1.5h，分散均匀后调节两种悬浮液的pH值为3.0左右，得到用于自组装的两种甲壳素晶须水悬浮液。
步骤三：将干燥后的PPDA膜浸入步骤二制备的CHWs悬浮液中8h，然后用去离子水冲洗膜材料，以去除PPDA膜表面吸附的CHWs，最后室温干燥，获得表面修饰带正电甲壳素晶须的复合膜，标记为BP@CHW1+，表面电位可以达到+16.98eV；通过将BP@CHW1+膜浸入步骤二制备的mCHWs悬浮液中8h，可以将带负电的mCHWs组装在BP@CHW1+膜的表面上。在洗涤和干燥之后，获得表面带负电的复合膜，标记为BP@CHW2-，电位为-16.14eV。
重复上述步骤，可以制备出具有不同甲壳素晶须层数的自组装复合膜。图2为修饰前后膜材料表面的Zeta电位值，可以看到在静电组装之后膜的带电性质发生了变化，证明了静电自组装方法的可行性。
此外，对BP@CHW1+和BP@CHW2-复合膜表面进行原子力显微镜观察，从图3的原子力显微镜照片可以清晰的观察到CHWs和mCHWs，且在复合膜表面分布规整，特别是CHWs的分布还具有一定的取向。
实施例3：自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合膜的制备
步骤一：称量2.0质量份重均分子量为30w的外消旋聚乳酸(PDLLA)颗粒，倒入40体积份二氯甲烷中溶解。搅拌溶解12h后，对溶液进行超声处理15min以除去溶液中的气泡，再倒入聚四氟乙烯培养皿内成型。在室温下挥发12h后，将其放入真空干燥箱中以40℃真空干燥6h以完全去除有机溶剂，得到PDLLA膜。将PDLLA膜进一步浸入3.0g/L盐酸多巴胺的Tris缓冲溶液(pH＝8.5)中，反应18h后取出冲洗、干燥，得到聚多巴胺/聚乳酸复合膜(PPDA)。
步骤二：将8质量份甲壳素粉末加入到2mol/L的HCl水溶液中，在N2气氛中加热至95℃并搅拌3.0h。随后，将上述悬浮液以5000r/min的速度离心5min，获得的沉淀物用去离子水稀释。重复离心-稀释过程5次。将所得产物用去离子水渗析，直至透析液的pH为7.0。最后，将所得产物冷冻干燥并研磨以获得带正电的甲壳素晶须(CHWs)。
称取30质量份马来酸酐放入三口烧瓶中，加热使马来酸酐固体熔融，将1.5质量份甲壳素粉末加入三口烧瓶中，在N2气氛下加热至75℃反应4h，将所得沉淀物用乙醇洗涤，并用去离子水离心6次以完全除去残留的马来酸酐。随后，将获得的沉淀物冷冻干燥并研磨以获得带负电的甲壳素晶须(mCHWs)。
将上述制备的晶须——CHWs和mCHWs，分别用去离子水配制成悬浮液，质量浓度选为10％。用细胞粉碎机在300w的功率下均化2.5h，分散均匀后调节两种悬浮液的pH值为6.0，得到用于自组装的两种甲壳素晶须水悬浮液。
步骤三：将干燥后的PPDA膜浸入步骤二制备的CHWs悬浮液中5h，然后用去离子水冲洗膜材料，以去除PPDA膜表面吸附的CHWs，最后室温干燥，获得表面修饰带正电甲壳素晶须的复合膜，标记为CP@CHW1+；通过将CP@CHW1+膜浸入步骤二制备的mCHWs悬浮液中5h，可以将带负电的mCHWs组装在CP@CHW1+膜的表面上。在洗涤和干燥之后，获得表面带负电的复合膜，标记为CP@CHW2-。重复8次组装的步骤，获得复合材料标记为CP@CHW8-。获得的CP@CHW1+材料表面甲壳素晶须层厚度为70±9nm，CP@CHW2-表面的甲壳素晶须层厚度为87±11nm，CP@CHW8-的表面甲壳素晶须层厚度为136±10nm。
对制备出来的复合膜材料进行液氮冷冻制样，获得各种复合膜材料的断面样品。图4表现的是CP@CHW1+、CP@CHW2-和CP@CHW8-复合膜的断面扫描电镜，展现了随着组装次数的增加，甲壳素层的厚度是稳定增加的。
将材料统一裁剪为10mm左右直径的圆形样品，对样品进行紫外灭菌后用于细胞培养。然后，利用CCK-8法测试盒来检测不同时间段的MC3T3-E1细胞在复合膜表面的增殖能力。如图5结果显示，随着时间的延长，所有材料表面上的MC3T3-E1细胞的OD值均增加，对比PDLLA膜的增殖数据，改性后的膜材料明显促进了细胞增殖。
细胞在膜材料表面的黏附和铺展行为也通过扫描电镜观察，结果见图6。图中展现了细胞在不同甲壳素晶须层上的铺展行为，可以看到CP@CHW1+膜表面出现了明显且大量的细胞伪足，说明CHWs修饰的膜表面更有利于细胞的黏附和铺展。
实施例4：自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合膜的制备
步骤一：称量1.0质量份重均分子量为25w的外消旋聚乳酸(PDLLA)颗粒，倒入15体积份甲苯中溶解。搅拌溶解12h后，对溶液进行超声处理15min以除去溶液中的气泡，再倒入聚四氟乙烯培养皿内成型。在室温下挥发36h后，将其放入真空干燥箱中以40℃真空干燥6h以完全去除有机溶剂，得到PDLLA膜。将PDLLA膜进一步浸入2.0g/L盐酸多巴胺的Tris缓冲溶液(pH＝8.5)中，反应12h后取出冲洗、干燥，得到聚多巴胺/聚乳酸复合膜(PPDA)。
步骤二：将20质量份甲壳素粉末加入到5mol/L的HCl水溶液中，在N2气氛中加热至110℃并搅拌4.5h。随后，将上述悬浮液以3000r/min的速度离心10min，获得的沉淀物用去离子水稀释。重复离心-稀释过程8次。将所得产物用去离子水渗析，直至透析液的pH为7.0。最后，将所得产物冷冻干燥并研磨以获得带正电的甲壳素晶须(CHWs)。
称取60质量份马来酸酐放入三口烧瓶中，加热使马来酸酐固体熔融，将3质量份甲壳素粉末加入三口烧瓶中，在N2气氛下加热至60℃反应8h，将所得沉淀物用乙醇洗涤，并用去离子水离心6次以完全除去残留的马来酸酐。随后，将获得的沉淀物冷冻干燥并研磨以获得带负电的甲壳素晶须(mCHWs)。
将上述制备的晶须——CHWs和mCHWs，分别用去离子水配制成悬浮液，质量浓度选为6％。用细胞粉碎机在600w的功率下均化1h，分散均匀后调节两种悬浮液的pH值为5.0，得到用于自组装的两种甲壳素晶须水悬浮液。
步骤三：将干燥后的PPDA膜浸入步骤二制备的CHWs悬浮液中10h，然后用去离子水冲洗膜材料，以去除PPDA膜表面吸附的CHWs，最后室温干燥，获得表面修饰带正电甲壳素晶须的复合膜，标记为DP@CHW1+；通过将DP@CHW1+膜浸入步骤二制备的mCHWs悬浮液中10h，可以将带负电的mCHWs组装在DP@CHW1+膜的表面上。在洗涤和干燥之后，获得表面带负电的复合膜，标记为DP@CHW2-。重复上述步骤，在CHWs和mCHWs水悬浮液中分别交替自组装8次后，制备得到甲壳素晶须厚度为141±9nm的甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料。重复组装步骤，制备出20层甲壳素晶须层的自组装复合膜，甲壳素晶须层厚度可达200±14nm。
步骤四：根据传统淋涂法制备对照样品，详细的，将步骤二所得到的PPDA膜材料竖直放置，随后将6％CHWs水悬浮液竖直淋涂到膜上。将所得的复合膜室温下竖直晾干，再真空干燥6h，得到CHWs修饰的聚乳酸复合膜材料，膜材料表面的甲壳素晶须层厚度为235.14±20nm。
将上述步骤中制备的复合膜分割成10mm×40mm的矩形样品用于拉伸性能测试。图7为不同膜的拉伸性能数据。其中，组装20层甲壳素晶须的复合膜拉伸强度和杨氏模量可以分别可以达到30.2±2.1MPa和0.38±0.025GPa，横向对比PDLLA组的强度和模量分别提高了302.7％和137.5％，改善效果显著。纵向对比传统的淋涂制备方法，虽然淋涂法制备的复合膜表面甲壳素晶须层的厚度略大于自组装20层甲壳素晶须层的厚度，但淋涂法所制备的复合膜的拉伸强度和杨氏模量相对于纯PDLLA膜仅有略微的改善，并不能实现复合膜力学性能上的突越，为了达到相当于自组装20层甲壳素晶须复合膜同样的力学性能，传统淋涂法则需要实现表面修饰1.2μm左右的甲壳素晶须层厚度，这表明新型的静电自组装方法在改善PDLLA材料的力学性能上更加高效，这就要可能归因于淋涂法修饰的甲壳素晶须层中晶须与晶须之间的作用力较弱，晶须排列较为分散；而且，静电自组装法可以通过稳定增加甲壳素晶须的层数控制晶须厚度的增加，从而实现材料力学性能的可控性。
实施例5：自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合膜的制备
步骤一：称量4.0质量份重均分子量为20w的外消旋聚乳酸(PDLLA)颗粒，倒入75体积份二氯甲烷中溶解。搅拌溶解6h后，对溶液进行超声处理10min以除去溶液中的气泡，再倒入聚四氟乙烯培养皿内成型。在室温下挥发12h后，将其放入真空干燥箱中以40℃真空干燥6h以完全去除有机溶剂，得到PDLLA膜。将PDLLA膜进一步浸入1.5g/L盐酸多巴胺的Tris缓冲溶液(pH＝8.5)中，反应24h后取出冲洗、干燥，得到聚多巴胺/聚乳酸复合膜(PPDA)。
步骤二：将12质量份甲壳素粉末加入到4mol/L的HCl水溶液中，在N2气氛中加热至100℃并搅拌3.5h。随后，将上述悬浮液以5000r/min的速度离心8min，获得的沉淀物用去离子水稀释。重复离心-稀释过程10次。将所得产物用去离子水渗析，直至透析液的pH为7.0。最后，将所得产物冷冻干燥并研磨以获得带正电的甲壳素晶须(CHWs)。
称取40质量份马来酸酐放入三口烧瓶中，加热使马来酸酐固体熔融，将2质量份甲壳素粉末加入三口烧瓶中，在N2气氛下加热至80℃反应6h，将所得沉淀物用乙醇洗涤，并用去离子水离心6次以完全除去残留的马来酸酐。随后，将获得的沉淀物冷冻干燥并研磨以获得带负电的甲壳素晶须(mCHWs)。
将上述制备的晶须——CHWs和mCHWs，分别用去离子水配制成悬浮液，质量浓度选为8％。用细胞粉碎机在700w的功率下均化0.5h，分散均匀后调节两种悬浮液的pH值为4.3，得到用于自组装的两种甲壳素晶须水悬浮液。
步骤三：将干燥后的PPDA膜浸入步骤二制备的CHWs悬浮液中10h，然后用去离子水冲洗膜材料，以去除PPDA膜表面吸附的CHWs，最后室温干燥，获得表面修饰带正电甲壳素晶须的复合膜，标记为EP@CHW1+；通过将EP@CHW1+膜浸入步骤二制备的mCHWs悬浮液中10h，可以将带负电的mCHWs组装在EP@CHW1+膜的表面上。在洗涤和干燥之后，获得表面带负电的复合膜，标记为EP@CHW2-。
实施例6：自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合膜的制备
步骤一：称量3.0质量份重均分子量为20w的外消旋聚乳酸(PDLLA)颗粒，倒入35体积份二氯甲烷中溶解。搅拌溶解11h后，对溶液进行超声处理11min以除去溶液中的气泡，再倒入聚四氟乙烯培养皿内成型。在室温下挥发14h后，将其放入真空干燥箱中以40℃真空干燥4h以完全去除有机溶剂，得到PDLLA膜。将PDLLA膜进一步浸入4.0g/L盐酸多巴胺的Tris缓冲溶液(pH＝8.5)中，反应14h后取出冲洗、干燥，得到聚多巴胺/聚乳酸复合膜(PPDA)。
步骤二：将30质量份甲壳素粉末加入到5mol/L的HCl水溶液中，在N2气氛中加热至110℃并搅拌5.0h。随后，将上述悬浮液以5000r/min的速度离心10min，获得的沉淀物用去离子水稀释。重复离心-稀释过程9次。将所得产物用去离子水渗析，直至透析液的pH为7.0。最后，将所得产物冷冻干燥并研磨以获得带正电的甲壳素晶须(CHWs)。
称取90质量份马来酸酐放入三口烧瓶中，加热使马来酸酐固体熔融，将4.5质量份甲壳素粉末加入三口烧瓶中，在N2气氛下加热至95℃反应8h，将所得沉淀物用乙醇洗涤，并用去离子水离心7次以完全除去残留的马来酸酐。随后，将获得的沉淀物冷冻干燥并研磨以获得带负电的甲壳素晶须(mCHWs)。
将上述制备的晶须——CHWs和mCHWs，分别用去离子水配制成悬浮液，质量浓度选为9％。用细胞粉碎机在1000w的功率下均化1h，分散均匀后调节两种悬浮液的pH值为4.0，得到用于自组装的两种甲壳素晶须水悬浮液。
步骤三：将干燥后的PPDA膜浸入步骤二制备的CHWs悬浮液中4h，然后用去离子水冲洗膜材料，以去除PPDA膜表面吸附的CHWs，最后室温干燥，获得表面修饰带正电甲壳素晶须的复合膜，标记为FP@CHW1+；通过将FP@CHW1+膜浸入步骤二制备的mCHWs悬浮液中4h，可以将带负电的mCHWs组装在FP@CHW1+膜的表面上。在洗涤和干燥之后，获得表面带负电的复合膜，标记为FP@CHW2-。重复3次组装的步骤，获得复合材料标记为FP@CHW3+，此时表面甲壳素晶须层厚度为95±7nm，此时复合膜表面为正电势。
实施例7：自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合膜的制备
步骤一：称量5.0质量份重均分子量为10w的左旋聚乳酸(PLLA)颗粒，倒入55体积份二氯甲烷中溶解。搅拌溶解7h后，对溶液进行超声处理4min以除去溶液中的气泡，再倒入聚四氟乙烯培养皿内成型。在室温下挥发16h后，将其放入真空干燥箱中以40℃真空干燥7h以完全去除有机溶剂，得到PLLA膜。将PLLA膜进一步浸入3.5g/L盐酸多巴胺的Tris缓冲溶液(pH＝8.5)中，反应17h后取出冲洗、干燥，得到聚多巴胺/聚乳酸复合膜(PPDA)。
步骤二：将15质量份甲壳素粉末加入到2.5mol/L的HCl水溶液中，在N2气氛中加热至104℃并搅拌4.0h。随后，将上述悬浮液以4000r/min的速度离心8min，获得的沉淀物用去离子水稀释。重复离心-稀释过程7次。将所得产物用去离子水渗析，直至透析液的pH为7.0。最后，将所得产物冷冻干燥并研磨以获得带正电的甲壳素晶须(CHWs)。
称取70质量份马来酸酐放入三口烧瓶中，加热使马来酸酐固体熔融，将3.5质量份甲壳素粉末加入三口烧瓶中，在N2气氛下加热至75℃反应6h，将所得沉淀物用乙醇洗涤，并用去离子水离心4次以完全除去残留的马来酸酐。随后，将获得的沉淀物冷冻干燥并研磨以获得带负电的甲壳素晶须(mCHWs)。
将上述制备的晶须——CHWs和mCHWs，分别用去离子水配制成悬浮液，质量浓度选为7％。用细胞粉碎机在700w的功率下均化1.5h，分散均匀后调节两种悬浮液的pH值为5.0，得到用于自组装的两种甲壳素晶须水悬浮液。
步骤三：将干燥后的PPDA膜浸入步骤二制备的CHWs悬浮液中7h，然后用去离子水冲洗膜材料，以去除PPDA膜表面吸附的CHWs，最后室温干燥，获得表面修饰带正电甲壳素晶须的复合膜，标记为GP@CHW1+；通过将GP@CHW1+膜浸入步骤二制备的mCHWs悬浮液中7h，可以将带负电的mCHWs组装在GP@CHW1+膜的表面上。在洗涤和干燥之后，获得表面带负电的复合膜，标记为GP@CHW2-。重复上述步骤，在CHWs和mCHWs水悬浮液中分别交替自组装4次后，制备得到甲壳素晶须厚度为98±9nm的甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料，标记为GP@CHW4-，此时复合膜表面为负电势。
实施例8：自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合膜的制备
步骤一：称量1.5质量份重均分子量为15w的外消旋聚乳酸(PDLLA)颗粒，倒入20体积份二氯甲烷中溶解。搅拌溶解5h后，对溶液进行超声处理5min以除去溶液中的气泡，再倒入聚四氟乙烯培养皿内成型。在室温下挥发15h后，将其放入真空干燥箱中以40℃真空干燥5h以完全去除有机溶剂，得到PDLLA膜。将PDLLA膜进一步浸入5.0g/L盐酸多巴胺的Tris缓冲溶液(pH＝8.5)中，反应15h后取出冲洗、干燥，得到聚多巴胺/聚乳酸复合膜(PPDA)。
步骤二：将24质量份甲壳素粉末加入到4.0mol/L的HCl水溶液中，在N2气氛中加热至110℃并搅拌5.5h。随后，将上述悬浮液以5000r/min的速度离心9min，获得的沉淀物用去离子水稀释。重复离心-稀释过程11次。将所得产物用去离子水渗析，直至透析液的pH为7.0。最后，将所得产物冷冻干燥并研磨以获得带正电的甲壳素晶须(CHWs)。
称取50质量份马来酸酐放入三口烧瓶中，加热使马来酸酐固体熔融，将2.5质量份甲壳素粉末加入三口烧瓶中，在N2气氛下加热至80℃反应2h，将所得沉淀物用乙醇洗涤，并用去离子水离心8次以完全除去残留的马来酸酐。随后，将获得的沉淀物冷冻干燥并研磨以获得带负电的甲壳素晶须(mCHWs)。
将上述制备的晶须——CHWs和mCHWs，分别用去离子水配制成悬浮液，质量浓度选为5％。用细胞粉碎机在500w的功率下均化2.5h，分散均匀后调节两种悬浮液的pH值为4.3，得到用于自组装的两种甲壳素晶须水悬浮液。
步骤三：将干燥后的PPDA膜浸入步骤二制备的CHWs悬浮液中3h，然后用去离子水冲洗膜材料，以去除PPDA膜表面吸附的CHWs，最后室温干燥，获得表面修饰带正电甲壳素晶须的复合膜，标记为HP@CHW1+；通过将HP@CHW1+膜浸入步骤二制备的mCHWs悬浮液中3h，可以将带负电的mCHWs组装在HP@CHW1+膜的表面上。在洗涤和干燥之后，获得表面带负电的复合膜，标记为HP@CHW2-。重复上述步骤，在CHWs和mCHWs水悬浮液中分别交替自组装10次后，制备得到甲壳素晶须厚度为150±11nm的甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料，标记为HP@CHW10-，复合膜表面为负电势。
实施例9：自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合膜的制备
步骤一：称量2.5质量份重均分子量为20w的外消旋聚乳酸(PDLLA)颗粒，倒入35体积份二氯甲烷中溶解。搅拌溶解10h后，对溶液进行超声处理13min以除去溶液中的气泡，再倒入聚四氟乙烯培养皿内成型。在室温下挥发13h后，将其放入真空干燥箱中以40℃真空干燥6h以完全去除有机溶剂，得到PDLLA膜。将PDLLA膜进一步浸入3.0g/L盐酸多巴胺的Tris缓冲溶液(pH＝8.5)中，反应13h后取出冲洗、干燥，得到聚多巴胺/聚乳酸复合膜(PPDA)。
步骤二：将5质量份甲壳素粉末加入到0.5mol/L的HCl水溶液中，在N2气氛中加热至60℃并搅拌0.5h。随后，将上述悬浮液以3000r/min的速度离心4min，获得的沉淀物用去离子水稀释。重复离心-稀释过程3次。将所得产物用去离子水渗析，直至透析液的pH为7.0。最后，将所得产物冷冻干燥并研磨以获得带正电的甲壳素晶须(CHWs)。
称取20质量份马来酸酐放入三口烧瓶中，加热使马来酸酐固体熔融，将1质量份甲壳素粉末加入三口烧瓶中，在N2气氛下加热至55℃反应0.5h，将所得沉淀物用乙醇洗涤，并用去离子水离心3次以完全除去残留的马来酸酐。随后，将获得的沉淀物冷冻干燥并研磨以获得带负电的甲壳素晶须(mCHWs)。
将上述制备的晶须——CHWs和mCHWs，分别用去离子水配制成悬浮液，质量浓度选为1％。用细胞粉碎机在150w的功率下均化0.5h，分散均匀后调节两种悬浮液的pH值为4.3，得到用于自组装的两种甲壳素晶须水悬浮液。
步骤三：将干燥后的PPDA膜浸入步骤二制备的CHWs悬浮液中4h，然后用去离子水冲洗膜材料，以去除PPDA膜表面吸附的CHWs，最后室温干燥，获得表面修饰带正电甲壳素晶须的复合膜，标记为IP@CHW1+；通过将IP@CHW1+膜浸入步骤二制备的mCHWs悬浮液中4h，可以将带负电的mCHWs组装在IP@CHW1+膜的表面上。在洗涤和干燥之后，获得表面带负电的复合膜，标记为IP@CHW2-。重复上述步骤，在CHWs和mCHWs水悬浮液中分别交替自组装13次后，制备得到甲壳素晶须厚度为160±17nm的甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料，标记为IP@CHW13+，复合膜表面为正电势。
实施例10：自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合膜的制备
步骤一：称量3质量份重均分子量为50w的外消旋聚乳酸(PDLLA)颗粒，倒入60体积份二氯甲烷中溶解。搅拌溶解8h后，对溶液进行超声处理18min以除去溶液中的气泡，再倒入聚四氟乙烯培养皿内成型。在室温下挥发12h后，将其放入真空干燥箱中以40℃真空干燥12h以完全去除有机溶剂，得到PDLLA膜。将PDLLA膜进一步浸入3.0g/L盐酸多巴胺的Tris缓冲溶液(pH＝8.5)中，反应24h后取出冲洗、干燥，得到聚多巴胺/聚乳酸复合膜(PPDA)。
步骤二：将50质量份甲壳素粉末加入到5mol/L的HCl水溶液中，在N2气氛中加热至110℃并搅拌6h。随后，将上述悬浮液以7000r/min的速度离心8min，获得的沉淀物用去离子水稀释。重复离心-稀释过程8次。将所得产物用去离子水渗析，直至透析液的pH为7.0。最后，将所得产物冷冻干燥并研磨以获得带正电的甲壳素晶须(CHWs)。
称取120质量份马来酸酐放入三口烧瓶中，加热使马来酸酐固体熔融，将6质量份甲壳素粉末加入三口烧瓶中，在N2气氛下加热至110℃反应8h，将所得沉淀物用乙醇洗涤，并用去离子水离心10次以完全除去残留的马来酸酐。随后，将获得的沉淀物冷冻干燥并研磨以获得带负电的甲壳素晶须(mCHWs)。
将上述制备的晶须——CHWs和mCHWs，分别用去离子水配制成悬浮液，质量浓度选为10％。用细胞粉碎机在1000w的功率下均化8h，分散均匀后调节两种悬浮液的pH值为4.3，得到用于自组装的两种甲壳素晶须水悬浮液。
步骤三：将干燥后的PPDA膜浸入步骤二制备的CHWs悬浮液中10h，然后用去离子水冲洗膜材料，以去除PPDA膜表面吸附的CHWs，最后室温干燥，获得表面修饰带正电甲壳素晶须的复合膜，标记为JP@CHW1+；通过将JP@CHW1+膜浸入步骤二制备的mCHWs悬浮液中10h，可以将带负电的mCHWs组装在JP@CHW1+膜的表面上。在洗涤和干燥之后，获得表面带负电的复合膜，标记为JP@CHW2-。重复上述步骤，在CHWs和mCHWs水悬浮液中分别交替自组装14次后，制备得到甲壳素晶须厚度为170±11nm的甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料，标记为JP@CHW14-，复合膜表面为负电势。
实施例11：自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合膜的制备
步骤一：称量3质量份重均分子量为15w的左旋聚乳酸(PLLA)颗粒，倒入60体积份氯仿中溶解。搅拌溶解7h后，对溶液进行超声处理15min以除去溶液中的气泡，再倒入聚四氟乙烯培养皿内成型。在室温下挥发18h后，将其放入真空干燥箱中以40℃真空干燥6h以完全去除有机溶剂，得到PLLA膜。将PLLA膜进一步浸入2.5g/L盐酸多巴胺的Tris缓冲溶液(pH＝8.5)中，反应24h后取出冲洗、干燥，得到聚多巴胺/聚乳酸复合膜(PPDA)。
步骤二：将50质量份甲壳素粉末加入到1mol/L的HCl水溶液中，在N2气氛中加热至110℃并搅拌6h。随后，将上述悬浮液以3000r/min的速度离心3min，获得的沉淀物用去离子水稀释。重复离心-稀释过程8次。将所得产物用去离子水渗析，直至透析液的pH为7.0。最后，将所得产物冷冻干燥并研磨以获得带正电的甲壳素晶须(CHWs)。
称取120质量份马来酸酐放入三口烧瓶中，加热使马来酸酐固体熔融，将6质量份甲壳素粉末加入三口烧瓶中，在N2气氛下加热至110℃反应5h，将所得沉淀物用乙醇洗涤，并用去离子水离心5次以完全除去残留的马来酸酐。随后，将获得的沉淀物冷冻干燥并研磨以获得带负电的甲壳素晶须(mCHWs)。
将上述制备的晶须——CHWs和mCHWs，分别用去离子水配制成悬浮液，质量浓度选为2％。用细胞粉碎机在600w的功率下均化4h，分散均匀后调节两种悬浮液的pH值为4.3，得到用于自组装的两种甲壳素晶须水悬浮液。
步骤三：将干燥后的PPDA膜浸入步骤二制备的CHWs悬浮液中2h，然后用去离子水冲洗膜材料，以去除PPDA膜表面吸附的CHWs，室温干燥得到甲壳素晶须厚度为13±8nm的甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料，获得表面修饰带正电甲壳素晶须的复合膜，标记为KP@CHW1+；通过将KP@CHW1+膜浸入步骤二制备的mCHWs悬浮液中2h，可以将带负电的mCHWs组装在KP@CHW1+膜的表面上，在洗涤和干燥之后，获得表面带负电的复合膜，其表面甲壳素晶须厚度为30±7nm，标记为KP@CHW2-。
上述实施例为本发明探索的最优实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料，其特征在于：由基材、粘结层和修饰层构成，所述基材为聚乳酸，所述粘结层为聚多巴胺，所述修饰层由带正电的甲壳素晶须和带负电的甲壳素晶须层层交替自组装构成；
所述聚乳酸复合材料由以下方法制备得到：
步骤一：制备聚乳酸膜，并在聚乳酸膜表面引入聚多巴胺层，制备聚多巴胺/聚乳酸复合膜；
步骤二：分别制备带正电的甲壳素晶须和带负电的甲壳素晶须，并分别配制成水悬浮液；
步骤三：将聚多巴胺/聚乳酸复合膜依次浸泡于步骤二制备的带正电的甲壳素晶须和带负电的甲壳素晶须的水悬浮液中，重复该浸泡过程，实现层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料的制备；
所述水悬浮液调节pH为3~6。
2.根据权利要求 1所述的层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料，其特征在于：所述的修饰层的厚度为 5-500nm。
3.根据权利要求 1所述的层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料，其特征在于：所述聚乳酸复合材料表面的 Zeta 电位值为-16.14eV-+16.98eV。
4.根据权利要求 1-3任一项所述的层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一：制备聚乳酸膜，并在聚乳酸膜表面引入聚多巴胺层，制备聚多巴胺/聚乳酸复合膜；
步骤二：分别制备带正电的甲壳素晶须和带负电的甲壳素晶须，并分别配制成水悬浮液；
步骤三：将聚多巴胺/聚乳酸复合膜依次浸泡于步骤二制备的带正电的甲壳素晶须和带负电的甲壳素晶须的水悬浮液中，重复该浸泡过程，实现层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料的制备。
5.根据权利要求 4所述的层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料的制备方法，其特征在于所述聚多巴胺/聚乳酸复合膜由包括以下具体步骤方法制备得到：将聚乳酸膜浸泡于浓度为0.2-5.0g/L的盐酸多巴胺溶液中，反应 0.5-24h，得到聚多巴胺/聚乳酸复合膜。
6.根据权利要求 4所述的层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料的制备方法，其特征在于所述带正电的甲壳素晶须由包括以下具体步骤的方法制备得到：将甲壳素粉末加入到 0.5-5mol/L 的 HCl 水溶液中，惰性气氛下加热至 60-110℃搅拌反应 0.5-6h，分离，透析，得到带正电的甲壳素晶须。
7.根据权利要求 4 所述的层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料的制备方法，其特征在于：所述带负电的甲壳素晶须采用包括甲壳素和马来酸酐反应制备，由包括以下具体步骤的方法制备得到：将甲壳素和马来酸酐在惰性气氛下于 55-110℃下反应 0.5-8h，分离得到带负电的甲壳素晶须。
8. 根据权利要求 4所述的层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料的制备方法，其特征在于：所述水悬浮液通过分别将带正电的甲壳素晶须和带负电的甲壳素晶须加入水中均化获得。
9.根据权利要求 4所述的层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料的制备方法，其特征在于步骤三包括以下具体步骤：将步骤一制备的聚多巴胺/聚乳酸复合膜先浸泡到步骤二制备的带正电的甲壳素晶须的水悬浮液中，0.5-10h后取出，干燥后，再浸泡于带负电的甲壳素晶须的水悬浮液中，0.5-10h后取出；多次重复上述操作，得到层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料。
10.权利要求 1-3 任一项所述的层层自组装甲壳素晶须修饰的聚乳酸复合材料在制备骨组织修复材料中的应用。
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