CN103360613B - 一种采用微生物转谷氨酰胺酶修饰的明胶/纳米银复合材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物材料、高分子化学和生物化学的交叉学科领域,公开了一种采用微生物转谷氨酰胺酶修饰的明胶/纳米银复合材料及其制备方法和应用。本发明以明胶/纳米银复合材料为主体材料,微生物转谷氨酰胺酶为修饰剂,制备得到微生物转谷氨酰胺酶修饰的明胶/纳米银复合材料,该材料具有良好的生物相容性,无细胞毒性,抗菌活性强,材料的力学性能和水体系稳定性好,同时该材料的制备工艺简单,反应条件温和,易于控制,生产成本低廉,在降低感染和炎症反应、抗菌、保护伤口、可生物降解的皮肤敷料和伤口愈合剂、以及人工皮肤等生物医用材料和生物医学领域具有很好的应用前景和十分广泛的用途。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料、高分子化学和生物化学领域,特别是涉及一种采用微生物转谷氨酰胺酶修饰的明胶/纳米银复合材料及其制备方法和用途。
背景技术
明胶作为自然界来源丰富的蛋白质类天然高分子和生物大分子材料,它具有良好的生物相容性、在生理条件下无抗原性、在体内可被完全吸收以及对人体无毒等优点,在人造皮肤、伤口敷料以及愈合剂等方面具有广泛的应用价值。然而,明胶材料脆性大、易破碎,极易吸水溶胀;此外,明胶是蛋白质类物质能够为细菌提供丰富的营养,因此它在潮湿环境中容易滋生细菌;并且明胶在较高的温度下会发生溶解,这些都限制了明胶在生物材料和医疗领域的应用。因此,改善明胶材料的力学机械性能和抗菌性能以扩展其在生物医学领域的应用具有十分重要的意义。
近年来,纳米银因为具有制备简单方便、生物相容性好、比表面积大、以及优异的抗菌活性(可以有效地杀灭细菌、真菌、支原体等致病微生物)的优点,受到人们极大的关注,在生物医用材料领域成为一种被广泛应用的抗菌材料。钟金栋等为了确定纳米银材料的抗菌效果及其使用安全性,进行了纳米银材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌杀灭实验效果的观察,并通过小鼠急性毒性实验和家兔皮肤刺激性实验以评价其使用安全性。实验结果发现,制备的纳米银材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有很好的抗菌活性;小鼠急性毒性实验和家兔皮肤刺激性实验证实了材料的使用安全性。Madhumathi等制备了用于伤口愈合的甲壳素与纳米银复合膜,研究发现治疗效果显著。此外,有研究还发现纳米银与聚合物复合可以提高材料的机械性能。因此,将明胶和纳米银复合可以达到将两种材料取长补短、优势互补的效果,不仅有利于提高明胶基材料的力学机械性能,特别是有利于改善明胶基材料容易滋生和感染细菌的问题。
然而,明胶基材料的力学性能并不理想,因此通常需要进行进一步的交联修饰来改善材料的力学性能。常用的化学修饰剂包括醛类(甲醛,戊二醛)、环氧化合物以及碳化二亚胺等,但是化学修饰剂往往具有细胞毒性,从而导致所修饰的生物材料在植入体内以后会影响组织和细胞的正常生长。鉴于上述原因,在材料的制备过程中使用天然的和无毒性的修饰剂,对于制备生物相容性良好的生物材料具有十分重要的意义。
发明内容
本发明针对现有技术的不足,提供一种采用微生物转谷氨酰胺酶修饰的明胶/纳米银复合材料及其制备方法和应用。
一种采用微生物转谷氨酰胺酶修饰的明胶/纳米银复合材料,其特征在于以明胶/纳米银复合材料为主体材料,利用微生物转谷氨酰胺酶对明胶/纳米银复合材料进行修饰制备得到。
一种采用微生物转谷氨酰胺酶修饰的明胶/纳米银复合材料的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)纳米银分散液的制备:将0.03~0.08g纳米银加入到10~20mL去离子水中,超声20~40分钟得到纳米银分散液;
(2)明胶溶液的制备:将4~8g明胶加入到50~150mL去离子水中,45~60℃的水浴条件下搅拌至明胶充分溶解后得到明胶溶液;
(3)微生物转谷氨酰胺酶溶液的制备:将0.48~1.2g微生物转谷氨酰胺酶加入到20~50mL去离子水中,微生物转谷氨酰胺酶比活力为130U/g,在室温下搅拌至充分溶解,再用滤纸过滤后,得到微生物转谷氨酰胺酶溶液;
(4)取上述明胶溶液50~150mL,纳米银溶液6~10mL,将明胶溶液和纳米银溶液混合,在40~60℃条件下搅拌20~30分钟,使两溶液混合均匀,得到明胶与纳米银混合溶液;再向明胶与纳米银混合溶液中加入微生物转谷氨酰胺酶20~40U,在35~50℃,搅拌条件下,反应20~30分钟;然后将反应液倒入培养皿中,在30~50℃的条件下,静置36~72小时,制备得到所述采用微生物转谷氨酰胺酶修饰的明胶/纳米银复合材料。
上述方案中,所述纳米银通过如下步骤制备得到:(1)将0.1~0.2gAgNO3溶解到100~300mL去离子水中,制备得到AgNO3溶液;(2)将0.15~0.3gNaBH4溶解在20~40mL去离子水中,在室温下超声3~8分钟得到NaBH4溶液;(3)向上述AgNO3溶液中加入0.04~0.08g柠檬酸钠,在20~30℃恒温磁力搅拌下,再向溶液中以2~4滴/秒的速度滴加上述NaBH4溶液,至溶液变成黄褐色停止滴加,继续搅拌反应6~10小时;(4)最后将反应后的溶液进行离心分离,用乙醇、丙酮洗涤沉淀物2~4次,于35~45℃真空干燥得到纳米银粒子。
一种采用微生物转谷氨酰胺酶修饰的明胶/纳米银复合材料的应用,在降低感染和炎症反应、抗菌、保护伤口、可生物降解的皮肤敷料和伤口愈合剂、及人工皮肤的生物医用材料和生物医疗领域的用途。
本发明的技术原理:利用微生物转谷氨酰胺酶修饰明胶/纳米银复合材料,微生物转谷氨酰胺酶作为修饰剂,通过催化酰氨基转移,可以使明胶分子中的谷氨酰胺上的γ-羟酰胺基和赖氨酸上的ε-氨基之间发生结合反应从而达到交联,使明胶分子内或分子之间形成共价连接。这种采用生物酶修饰明胶/纳米银复合材料的方法不仅安全无毒,而且高效。本发明中,明胶是自然界来源丰富的蛋白质类生物大分子材料,具有生物相容性好、无毒、可生物降解、可被人体吸收以及价格低廉等优点,纳米银具有制备简单,生物相容性好,比表面积大以及优异的抗菌活性等特点。这种由蛋白质和纳米材料复合制备的材料,可以使材料各组分之间形成优劣互补,不仅有利于提高明胶基材料的机械性能,还有利于改善明胶基材料易滋生和感染细菌的问题,此外,生物酶作为生物修饰剂,避免了采用传统化学修饰剂存在的生物相容性差、毒性大的问题,能有效改善明胶/纳米银复合材料的力学机械性能和稳定性。
本发明的有益效果:
(1)本发明以明胶和纳米银为主体材料,采用微生物转谷氨酰胺酶为修饰剂,制备得到的明胶/纳米银复合材料具有良好的生物相容性,无细胞毒性,抗菌活性强。
(2)本发明中,明胶/纳米银复合材料经过微生物转谷氨酰胺酶修饰后,其材料的力学性能和稳定性得到有效改善。
(3)本发明制备工艺简单,反应设备简易,反应条件温和,酶反应具有专一性和高效性,并且微生物转谷氨酰胺酶价廉易得,因此生产成本低。
(4)本发明中采用微生物转谷氨酰胺酶修饰的明胶/纳米银复合材料作为降低感染和炎症反应、抗菌、保护伤口、可生物降解的皮肤敷料、伤口愈合剂以及人工皮肤在生物医用材料和生物医疗领域具有很好的应用前景和十分广泛的用途。
附图说明
图1为明胶材料、明胶/纳米银复合材料、以及实施例1采用微生物转谷氨酰胺酶修饰得到的明胶/纳米银复合材料的拉伸强度,其中G代表明胶材料,G/nAg代表未采用酶修饰的明胶/纳米银复合材料,m-G/nAg代表采用微生物转谷氨酰胺酶修饰得到的明胶/纳米银复合材料。
图2为明胶材料(G),以及实施例1采用微生物转谷氨酰胺酶修饰得到的明胶/纳米银复合材料(m-G/nAg)在水体系中的稳定性。
图3为微生物转谷氨酰胺酶修饰得到的明胶材料,以及实施例1采用微生物转谷氨酰胺酶修饰得到的明胶/纳米银复合材料对金黄色葡萄球菌的抑菌效果,其中Control代表未加入样品的空白对照组,m-G代表采用微生物转谷氨酰胺酶修饰得到的明胶材料,m-G/nAg代表采用微生物转谷氨酰胺酶修饰得到的明胶/纳米银复合材料。
具体实施方式
为了更好地理解本发明,下面结合附图及实施例进一步阐明本发明的内容,但本发明的内容不仅仅局限于下面的实例。
实施例1
一种采用微生物转谷氨酰胺酶修饰的明胶/纳米银复合材料,通过如下方法制备得到:
(1)纳米银的制备:称取0.14gAgNO3加入到200mL去离子水中,在室温下搅拌溶解;称取0.19gNaBH4加入到25mL去离子水中,在室温下超声5分钟得到NaBH4溶液;向上述AgNO3溶液中加入0.06g柠檬酸钠,在25℃恒温磁力搅拌下,再向溶液中以2滴/秒的速度滴加NaBH4溶液,至溶液变成黄褐色停止滴加,继续搅拌反应8小时;最后将反应后的溶液进行离心分离,用乙醇、丙酮洗涤沉淀物3次,于40℃真空干燥得到纳米银粒子;
(2)溶液的配制:称取6g明胶加入到100mL去离子水中,在50℃的水浴中搅拌2小时以上至明胶完全溶解得到浓度为0.06g/mL的明胶溶液;称取0.05g纳米银加入到15mL去离子水中,在室温下超声30分钟得到浓度为0.003g/mL的纳米银分散液;称取0.72g微生物转谷氨酰胺酶(酶活力为130U/g)加入30mL去离子水中,室温下搅拌至充分溶解,再用滤纸过滤得到2U/mL的微生物转谷氨酰胺酶溶液,冷藏备用;
(3)微生物转谷氨酰胺酶修饰的明胶与纳米银复合材料的制备:向上述配制的100mL明胶溶液中加入8mL纳米银溶液,在50℃的条件下搅拌15分钟,使两溶液混合均匀,得到明胶与纳米银混合溶液;再向明胶与纳米银混合溶液中加入30U微生物转谷氨酰胺酶,在40℃的条件下搅拌反应25分钟;最后将反应液倒入培养皿中,在40℃的条件下静置48小时,制备得到所述采用微生物转谷氨酰胺酶修饰的明胶与纳米银复合材料。
以明胶材料(G)、未经过酶修饰的明胶/纳米银复合材料(G/nAg),和本实施例采用微生物转谷氨酰胺酶修饰得到的明胶/纳米银复合材料(m-G/nAg)进行材料拉伸强度测试。其中上述明胶材料的制备过程为:将100mL明胶溶液倒入培养皿中,40℃下静置48小时,得到明胶材料。上述未经过酶修饰的明胶/纳米银复合材料的制备过程为:向100mL明胶溶液中加入8mL纳米银溶液,50℃下搅拌15分钟,使溶液混合均匀,将溶液倒入培养皿中,40℃下静置48小时,得到未经过酶修饰的明胶/纳米银复合材料。
拉伸强度的测试方法为:选取平整、洁净、无缺陷的材料薄膜,将其裁成70mm×1Omm的横条,测量薄膜厚度,每个试样在标距内测量3个点,取其平均值,作为膜的厚度;将试样置于相对湿度约为30%的干燥器中,放置于25℃条件下平衡24小时;然后采用万能试验机(CMT-6503,深圳新三思材料检测有限公司)进行力学性能测定,原始标距为30mm,拉伸速率为40mm/min。每个试样测试6片取其平均值,结果见图1。从图1中可以看出,G膜的拉伸强度为59.52MPa,G/nAg膜的拉伸强度为67.81MPa,说明纳米银的引入使明胶膜的拉伸强度略有升高;而采用微生物转谷氨酰胺酶修饰的m-G/nAg膜的拉伸强度为74.19MPa,与G膜相比提高了24.66%,这表明采用微生物转谷氨酰胺酶进行修饰能够有效提高明胶/纳米银复合材料的拉伸强度。
进一步测试明胶材料(G),和本实施例采用微生物转谷氨酰胺酶修饰得到的明胶/纳米银复合材料(m-G/nAg)在水中的溶解情况,测试过程为:首先选取平整洁净的经过微生物转谷氨酰胺酶修饰的以及未经过修饰的明胶/纳米银膜材料,分别裁成10mm×10mm的膜片,然后将其在37℃的蒸馏水中浸泡,观察膜片的溶解情况,结果见图2。从图可知,明胶材料膜在37℃的蒸馏水中浸泡3小时之后完全溶解;而经过微生物转谷氨酰胺酶修饰的明胶/纳米银复合膜在同样的条件下浸泡3小时之后未发生溶解,只产生溶胀;说明通过微生物转谷氨酰胺酶的作用,能够在明胶分子中形成共价键交联,从而使材料在上述蒸馏水中不发生溶解,增加了明胶/纳米银复合材料在水体系中的稳定性。
对采用微生物转谷氨酰胺酶修饰得到的明胶材料(m-G),和本实施例采用微生物转谷氨酰胺酶修饰得到的明胶/纳米银复合材料(m-G/nAg)进行金黄色葡萄球菌的抑菌性能测试,其中上述采用微生物转谷氨酰胺酶修饰得到的明胶材料(m-G)制备过程为:将100mL明胶溶液倒入培养皿中,加入30U微生物转谷氨酰胺酶,在40℃的条件下搅拌反应25分钟;最后将反应液倒入培养皿中,在40℃的条件下静置48小时。抑菌性能测试过程参考中华人民共和国轻工行业标准QB与T2591-2003《抗菌塑料-抗菌性能测试方法和抗菌效果》,具体测试过程为:将新鲜细菌培养物(12小时内转接的),加入培养液中,依次做10倍递增稀释,选择菌液浓度为(1.0~5.0)×105CFU/mL的稀释液作为试验用菌液。在每个培养管中加入2mL菌液,分别加入1片明胶膜片,1片采用微生物转谷氨酰胺酶修饰的明胶/纳米银复合膜片,而不加入膜片的培养管作为空白对照组,在37℃恒温振荡培养12小时后,用平板计数法计算出菌落数目。每组数据做两次平行实验,每个样品做三个平行抗菌测试。其中抗菌率(%)=(空白对照样品平均回收菌数-抗菌样品平均回收菌数)/空白对照样品平均回收菌数×100%,结果见图3,从图中可以看出,经过12小时培养后,m-G膜的金黄色葡萄球菌浓度为4.04×107CFU/mL,相对于Control(金黄色葡萄球菌浓度2.96×107CFU/mL)具有更高的金黄色葡萄球菌浓度,这说明不加入纳米银的明胶材料不具有对金黄色葡萄球菌的抑制作用,相反它能够作为蛋白质类营养物质促进金黄色葡萄球菌的生长;而m-G/nAg膜的金黄色葡萄球菌浓度(2.32×107CFU/mL)与m-G膜相比下降了42.50%,说明经过微生物转谷氨酰胺酶修饰得到的明胶/纳米银复合材料对金黄色葡萄球菌具有非常好的抑菌效果。
实施例2
一种采用微生物转谷氨酰胺酶修饰的明胶/纳米银复合材料,通过如下方法制备得到:
(1)纳米银的制备:称取0.1gAgNO3加入到100mL去离子水中,在室温下搅拌溶解,得到AgNO3溶液;称取0.15gNaBH4加入到20mL去离子水中,在室温下超声3分钟溶解NaBH4溶液;向上述AgNO3溶液中加入0.04g柠檬酸钠,20℃恒温磁力搅拌下,再向溶液中以3滴/秒的速度滴加NaBH4溶液,至溶液变成黄褐色停止滴加,继续搅拌反应6小时。最后将反应后的溶液进行离心分离,用乙醇、丙酮洗涤沉淀物2次,于35℃真空干燥得到纳米银粒子;
(2)溶液的配制:称取4g明胶加入到50mL去离子水中,在45℃的水浴中搅拌1.5小时以上至明胶完全溶解得到浓度为0.08g/mL的明胶溶液;称取0.03g纳米银加入到10mL去离子水中,在室温下超声20分钟得到浓度为0.003g/mL的纳米银分散液;称取0.48g微生物转谷氨酰胺酶(酶活力为130U/g)加入到20mL去离子水中,室温下搅拌至充分溶解,再用滤纸过滤得到2U/mL的微生物转谷氨酰胺酶溶液,冷藏备用;
(3)微生物转谷氨酰胺酶修饰的明胶与纳米银复合材料的制备:向上述配制的50mL明胶溶液中加入6mL纳米银溶液,在40℃条件下搅拌20分钟,使两溶液混合均匀,得到明胶与纳米银混合溶液;再向明胶与纳米银混合溶液中加入20U微生物转谷氨酰胺酶,在35℃下搅拌反应30分钟;然后将反应液倒入培养皿中,在30℃的条件下静置72小时,制备得到所述采用微生物转谷氨酰胺酶修饰的明胶/纳米银复合材料。
实施例3
一种采用微生物转谷氨酰胺酶修饰的明胶与纳米银复合材料,通过如下方法制备得到:
(1)纳米银的制备:称取0.2gAgNO3加入到300mL去离子水中,在室温下搅拌溶解;称取0.3gNaBH4加入到40mL去离子水中,在室温下超声8分钟溶解;向上述AgNO3溶液中加入0.08g柠檬酸钠,在30℃恒温磁力搅拌下,再向溶液中以4滴/秒的速度滴加NaBH4溶液,至溶液变成黄褐色停止滴加,继续搅拌反应10小时。最后将反应后的溶液进行离心分离,用乙醇、丙酮洗涤沉淀物4次,于45℃真空干燥得到纳米银粒子。
(2)溶液的配制:称取8g明胶加入到150mL去离子水中,在60℃的水浴中搅拌3小时以上至明胶完全溶解得到浓度为0.05g/mL的明胶溶液;称取0.08g纳米银粉末溶于20mL去离子水中,超声40分钟分散溶解得到浓度为0.004g/mL的纳米银分散液;称取1.2g微生物转谷氨酰胺酶加入到50mL去离子水中,室温下搅拌至充分溶解,再用滤纸过滤得到2U/mL的微生物转谷氨酰胺酶溶液,冷藏备用。
(3)微生物转谷氨酰胺酶修饰的明胶与纳米银复合材料的制备:向上述配制的150mL明胶溶液中加入10mL纳米银溶液,60℃下搅拌30分钟,使溶液混合均匀;再向明胶与纳米银混合溶液中加入40U微生物转谷氨酰胺酶,在50℃下搅拌反应20分钟;然后将反应液倒入培养皿中,在50℃的条件下静置36小时,制备得到所述采用微生物转谷氨酰胺酶修饰的明胶/纳米银复合材料。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例,而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种采用微生物转谷氨酰胺酶修饰的明胶/纳米银复合材料的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)纳米银分散液的制备:将0.03~0.08g纳米银加入到10~20mL去离子水中,超声20~40分钟得到纳米银分散液;
(2)明胶溶液的制备:将4~8g明胶加入到50~150mL去离子水中,在45~60℃的水浴条件下搅拌至明胶充分溶解后得到明胶溶液;
(3)微生物转谷氨酰胺酶溶液的制备:将0.48~1.2g的微生物转谷氨酰胺酶加入到20~50mL去离子水中,微生物转谷氨酰胺酶的比活力为130U/g,在室温下搅拌至充分溶解,再用滤纸过滤后,得到微生物转谷氨酰胺酶溶液;
(4)采用微生物转谷氨酰胺酶修饰的明胶/纳米银复合材料的制备:取上述明胶溶液50~150mL,纳米银分散液6~10mL,将明胶溶液和纳米银分散液混合,在40~60℃条件下搅拌20~30分钟,使两溶液混合均匀,得到明胶与纳米银混合溶液;再向明胶与纳米银混合溶液中加入微生物转谷氨酰胺酶20~40U,在30~50℃,搅拌条件下,反应20~30分钟;然后将反应液倒入培养皿中,在30~50℃的条件下,静置36~72小时,制备得到所述采用微生物转谷氨酰胺酶修饰的明胶/纳米银复合材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于所述纳米银通过如下步骤制备得到:(1)将0.1~0.2gAgNO3溶解到100~300mL去离子水中,制备得到AgNO3溶液;(2)将0.15~0.3gNaBH4溶解在20~40mL去离子水中,在室温下超声3~8分钟得到NaBH4溶液;(3)向上述AgNO3溶液中加入0.04~0.08g柠檬酸钠,在20~30℃恒温磁力搅拌下,再向溶液中以2~4滴/秒的速度滴加上述NaBH4溶液,至溶液变成黄褐色停止滴加,继续搅拌反应6~10小时;(4)最后将反应后的溶液进行离心分离,用乙醇、丙酮洗涤沉淀物2~4次,于35~45℃真空干燥得到纳米银粒子。
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CN103360613A (zh) | 2013-10-23 |
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