CN112121226B - 一种促伤口愈合的复合水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种促伤口愈合的复合水凝胶及其制备方法和应用，该复合水凝胶由：明胶、抗菌光动力肽、重组人III型胶原蛋白组成。通过引入光敏剂Ce6进行光动力抗菌化学疗法抗菌，利用它在激光的照射下产生活性氧导致微生物分子氧化并导致细菌细胞损伤和死亡，与抗菌肽产生协同作用。该抗菌复合水凝胶具有良好的生物相容性，并在创面周围保持湿润环境，能稳定的将负载的抗菌光动力肽及重组人胶原蛋白输送到创口表面，在真皮修复过程中，引导成纤维细胞迁移增殖，增加新胶原沉积于血管重建，从而加速伤口愈合，提高伤口愈合质量。

Description

一种促伤口愈合的复合水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种具有促伤口愈合的复合水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
皮肤作为人体天然的保护屏障，可使体内各种组织和器官免受外界物理性、化学性和病原微生物的伤害。皮肤损伤后，往往存在细菌感染的风险。在正常的创面愈合过程中，止血，炎症，增殖和重塑等阶段都是有序有效地进行的。但由于反复的组织损伤或者潜在的生理状况，比如金黄色葡萄球菌感染后导致肉芽肿或者脓肿形成，导致持续感染。
水凝胶作为伤口敷料在治疗皮肤创伤方面具有广阔的应用前景。水凝胶是自然或合成的具有三维(3D)网络的聚合物，可以量身定制以模仿物理人体组织的化学性质，其具备良好的生物相容性，能在体内或者皮肤表面稳定降解。水凝胶基敷料也吸收伤口渗出液，继而促进成纤维细胞增殖，角质形成细胞迁移以及最终促进伤口部位的上皮再形成。以水凝胶为基础的敷料，可以整合不同类型的杀菌剂，包括金属纳米粒子，阳离子聚合物和抗菌剂肽(AMP)。
尽管基于水凝胶的敷料具有许多生物学优势，但是，它们通常表现出较弱的机械和粘合性能。与常规伤口闭合相比，在伤口区域使用氰基丙烯酸酯基粘合剂，蓝藻-胶乳和醛系胶粘剂已在很大程度上显示出组织炎症，细胞坏死和细胞毒性。生物纤维蛋白胶已显示对组织粘附力差，并且无法支持组织再生。另外，现有粘合剂的机械性能和延长的固化时间通常会导致性能和组织粘合下降。伤口闭合和治疗的理想敷料应：(i)具有生物相容性和可生物降解性，无免疫反应；(ii)提供气体交换，帮助排出和清除碎屑；(iii)保护伤口免受继发感染；(iv)易于移除而不会造成创伤；(v)促进组织再生和伤口愈合。
因此，需开发一种能够快速抗菌减少感染，同时促进伤口快速愈合的生物活性敷料，对于细菌感染的伤口愈合具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足，提供了一种抗菌活性高且促伤口愈合的复合水凝胶及其制备方法和应用，开发了一种负载抗菌肽及重组人胶原蛋白Ⅲ的复合水凝胶敷料，本发明制备的复合水凝胶具有较好的促伤口愈合效果，在抑菌、细菌感染伤口的光动力治疗方面均有广泛的应用前景。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供的复合水凝胶的组分包括：组分A：明胶；组分B：抗菌光动力肽(AMP2-Ce6)；组分C:重组人III型胶原蛋白。
采用固相合成法合成双链抗菌肽AMP2，其氨基酸序列为：
(GKRWWKWWRR)2KGGKG。
抗菌光动力肽的制备方法为，采用光敏剂二氢卟吩e6(Ce6)与双链抗菌肽AMP2复合偶联合成AMP2-Ce6：(GKRWWKWWRR)2KGGK(Ce6)G。
本发明还提供了上述复合水凝胶的制备方法，具体为：
(1)将明胶溶于去离子水中配置成质量浓度为10％的溶液，加热搅拌使其完全溶解；
(2)向步骤(1)溶液中加入重组人III型胶原蛋白混合，再加AMP2-Ce6配制成含有抗菌肽的明胶-胶原蛋白混合溶液；
其中，明胶是胶原蛋白的5-10倍当量；AMP2-Ce6在混合溶液中的浓度为0.4-4μM；
(3)配置1mL质量浓度为10％的转谷氨酰胺酶水溶液，将配好的酶溶液加入到10mL含有抗菌肽的明胶-胶原蛋白混合液中进行生物酶交联1分钟；
(4)倒入模具中，放置30分钟即可成胶。4℃保存备用。
本发明复合水凝胶使用两种细胞外基质ECM衍生的生物聚合物，明胶和重组人胶原蛋白，以及抗菌光动力肽(GKRWWKWWRR)2KGGK(Ce6)G，该基质明胶具有良好的生物相容性，并在创面周围保持湿润环境，能稳定的将负载的抗菌肽及重组人胶原蛋白输送到创口表面，在真皮修复过程中，引导皮细胞迁移增殖和胶原排列的支架，帮助完成细胞外基质(ECM)的重构，增加新胶原沉积与血管重建，从而加快创面愈合速度，改善创面愈合质量，显示出其作为伤口敷料的巨大潜力。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明复合水凝胶制备简单，成本低廉，为大规模制备奠定了基础。
(2)本发明包含的双链抗菌肽在细菌菌株表面上具有更高的亲和力，引入光敏剂Ce6进行PACT抗菌，利用它在激光的照射下，产生活性氧(ROS)，导致微生物生物分子的氧化并导致细胞损伤和死亡，与抗菌肽(AMP)产生协同作用。
(3)本发明包含的重组人III型胶原蛋白安全性高，成本低，能大规模产业化生产。此外，重组胶原蛋白增加了亲水基团，水溶性提高，可制备出胶原蛋白浓度较高的水凝胶。
附图说明
图1为小鼠模型中治疗葡萄球菌皮肤感染和皮肤损伤的抗菌光动力疗法的示意图；
图2为不同浓度复合水凝胶(其中，AMP2-Ce6(终浓度为4μM)，明胶是胶原蛋白的5倍当量)对L929细胞存活的影响；
图3为各时间点各组小鼠皮肤创面情况(其中，AMP2-Ce6(终浓度为4μM)，明胶是胶原蛋白的5倍当量)；
图4为各组皮肤创伤处理后不同时间点的创面面积(其中，AMP2-Ce6(终浓度为4μM)，明胶是胶原蛋白的5倍当量)；
图5为不同浓度抗菌肽AMP2-Ce6制得的水凝胶(其中，明胶是胶原蛋白的5倍当量)对L929细胞存活的影响；
图6为不同用量重组人III型胶原蛋白制备的水凝胶各时间点大鼠皮肤创面情况。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细阐述，但这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为对本发明实施的限制。
实施例1复合水凝胶制备
将1g明胶溶于10mL的超纯水中配制成10％的溶液，将溶液加热至40℃搅拌30分钟。加入0.2g重组人III型胶原蛋白混合搅拌5分钟后再加入抗菌光动力肽AMP2-Ce6(终浓度为0.4μM、0.8μM、1.6μM、2.4μM、3.2μM、4μM)配制成含有抗菌肽的明胶-胶原蛋白混合溶液。将1ml 10％转谷氨酰胺酶水溶液，加入到10ml明胶-胶原蛋白混合液中进行生物酶交联1分钟。分装至一次性使用凝胶推注器模具中，放置30分钟即可成胶(4℃保存备用)。
实施例2复合水凝胶毒性测试
采用MTT法对小鼠成纤维细胞(L929)进行生物相容性实验。首先，收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，按104个细胞/孔的密度接种在96孔板上，过夜培养后，用不同浓度的复合水凝胶(0、0.5、1、2、4、8、16μM)处理，孵育24h后加入MTT溶液处理后，通过酶标仪测定评估细胞存活率(见图2)。
实施例3创面修复实验
具体实验步骤为：
(1)小鼠背部创伤模型
共35只小鼠，其种类、年龄、体格等各方面均相似，每个小鼠一个创口。首先使用外科手术的方法在Balb/c小鼠背部创建一个直径约1cm的全层伤口，然后在伤口上接种细菌(105CFU/mL的金黄色葡萄球菌)2天，原位感染形成生物膜。造模期间小鼠单笼饲养，放置玩具陪伴，自由饮水、进食。造模结束后，每个小鼠创口无明显区别，细菌感染部位发黄，外周发红，周围组织水肿明显。
(2)动物分组
将35个小鼠随机分为7组：
A组为对照组，给药剂量为200μL PBS/伤口，外敷；
B组为单纯明胶组，给药剂量为200μL/伤口，外敷；
C组为单纯抗菌肽AMP2-Ce6(浓度为4μM)，给药剂量为200μL/伤口，外敷；
D组为抗菌肽AMP2-Ce6(浓度为4μM)，加光照，给药剂量为200μL/伤口，外敷；
E组为明胶-胶原蛋白组，给药剂量为200μL/伤口，外敷；
F组为明胶-胶原蛋白@AMP2-Ce6(实施例1)，给药剂量为200μL/伤口，外敷；
G组为明胶-胶原蛋白@AMP2-Ce6(实施例1)，加光照，给药剂量为200μL/伤口，外敷。
(3)在伤口造模后，分别将A组、B组、C组、D组、E组、F组、G组所用的敷料涂抹到小鼠的创口上，并于造模后第0、2、4、6、8、10日观察每组创面情况(见图3和图4)。
经观察，造模后第2天，G组逐渐变硬且结痂，随着修复时间的延长，各组均逐渐呈现伤口缩小的趋势。结果如附图所示，可以看出使用本发明水凝胶，并进行光照的小鼠背部愈合速度明显大于其他对照组。
实施例4
将1g明胶溶于10mL的超纯水中配制成10％的溶液，将溶液加热至40℃搅拌30分钟。加入0.1g或0.2g重组人III型胶原蛋白混合搅拌5分钟后配制明胶-胶原蛋白混合溶液。将1ml 10％转谷氨酰胺酶水溶液，加入到10ml明胶-胶原蛋白混合液中进行生物酶交联1分钟。分装至一次性使用凝胶推注器模具中，放置30分钟即可成胶(4℃保存备用)，并测试制备的水凝胶各时间点大鼠皮肤创面情况。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术范围。

Claims (3)

1.一种促伤口愈合的复合水凝胶，其特征在于，所述复合水凝胶由：组分A：明胶；组分B：抗菌光动力肽AMP2-Ce6；组分C：重组人III型胶原蛋白组成；
所述的促伤口愈合的复合水凝胶的制备方法为：将1 g明胶溶于10 mL的超纯水中配制成10%的溶液，将溶液加热至40 ℃搅拌30分钟；加入0.2g重组人III型胶原蛋白混合搅拌5分钟后再加入终浓度为4 μM的抗菌光动力肽AMP2-Ce6，配制成含有抗菌肽的明胶-胶原蛋白混合溶液；将1ml 10%转谷氨酰胺酶水溶液，加入到10ml明胶-胶原蛋白混合液中进行生物酶交联1 分钟，分装至一次性使用凝胶推注器模具中，放置30分钟即可成胶。
2.如权利要求1所述的促伤口愈合的复合水凝胶，其特征在于，采用固相合成法合成双链抗菌肽AMP2，其氨基酸序列为：(GKRWWKWWRR)2KGGKG。
3.如权利要求1所述的促伤口愈合的复合水凝胶，其特征在于，所述抗菌光动力肽的制备方法为，采用光敏剂二氢卟吩e6（Ce6）与双链抗菌肽AMP2复合偶联合成AMP2-Ce6：(GKRWWKWWRR)2KGGK(Ce6)G。
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