CN115920119A - 明胶酶响应性光热载氧水凝胶伤口敷料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于纳米医学材料领域，具体公开了一种明胶酶响应性光热载氧水凝胶伤口敷料及其制备方法，通过超声乳化将全氟十氢化萘包裹于纳米脂质体中，再通过固相法合成多肽序列，随后通过Cypate的羧基与多肽的氨基反应，合成AMP‑Cypate，最后使用谷氨酰胺转氨酶交联，通过一锅法，添加重组Ⅲ型胶原制备水凝胶。制备的水凝胶具有良好的成胶性能、载氧性能以及抗菌性能。在有效杀灭典型的革兰氏阳性菌金黄色葡萄糖球菌的同时，能够携带氧气，改善伤口创面细胞的缺氧环境，促进细胞增殖进而加速伤口愈合。通过生物安全性评价，证明该水凝胶具有良好的生物安全性和相容性，具有应用的基础。

Description

明胶酶响应性光热载氧水凝胶伤口敷料及其制备方法

技术领域

本发明属于纳米医学材料领域，具体涉及一种明胶酶响应性光热载氧水凝胶伤口敷料及其制备方法。

背景技术

皮肤作为人体的第一道防线，在抵抗细菌感染等方面有着无可替代的作用。因此皮肤破损带来的伤口感染，特别是耐药、耐抗生素的出现，严重威胁着人类的生命健康。抗生素的发现和随后在临床实践中的应用彻底改变了医学，改变了对细菌感染的治疗。随着抗生素的广泛应用，导致细菌的抗菌素耐药性增加。抗菌肽(AMPs)作为一种新型的广谱抗菌剂，因其抗菌效果好、抗菌机理独特等优点而备受研究者的关注。

Cypate为ICG(indocyaninegreen)的一种羧基衍生物，光热转换性能优异，是常用的光热化合物。ICG由于缺少活性基团，与蛋白之间只能以非共价键相连，稳定性较差。Cypate疏水性强，结构稳定性更好，而且结构中有两个羧基，可以与氨基酸结构中的氨基反应，形成共价连接。

氧气对于人体生命活动至关重要，它通过有氧糖酵解产生大量三磷酸腺苷(ATP)。氧在创面愈合中同样起着关键作用，因为修复过程，如在炎症阶段攻击细菌、细胞增殖、胶原合成等都需要大量能量。然而在伤口组织坏死区域氧含量通常小于10mmHg(正常组织的经皮氧含量可达40mmHg)。现有的方法，如高压氧治疗或局部氧治疗，都难以缓解伤口环境的缺氧。因此，迫切需要一种可应用于伤口，直接为伤口细胞提供氧气的新材料，以改善伤口组织缺氧的问题，为伤口愈合提供有利条件。

含氟原子的有机化合物由于可以在血液中替代血液来输送氧气，而全氟十氢化萘(perfluorodecalin FDC)就是可输送氧气的含氟化合物中的一种。全氟十氢化萘(FDC)是一种具有优越的载氧能力和适宜的体内半衰期(约6h)的全氟碳化合物，是一种出色的人工血液替代品。然而，由于FDC的极端疏水性，因此限制其应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种既能高效抗菌的同时，又能改善伤口缺氧微环境并促进伤口愈合的明胶酶响应性光热载氧水凝胶伤口敷料GCACF及其制备方法。本发明制备的水凝胶伤口敷料可以响应明胶酶的释放，同时协同光热和光动力疗法从而根除细菌，并在体外实验中能够明显改善细胞缺氧情况。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供的明胶酶响应性光热载氧水凝胶伤口敷料由脂质体包裹的全氟十氢化萘纳米粒(FL)、连接Cypate的抗菌肽(AC)和添加了重组Ⅲ型胶原的明胶组成。

其中，抗菌肽序列为KKLRLKIAFK，采用固相合成法合成；

Cypate最大吸收波段为780nm。

连接Cypate的抗菌肽是Cypate中的羧基与抗菌肽氨基酸游离的氨基通过共价键连接形成，其最大吸收峰为780nm，与Cypate的吸收峰一致。

脂质体包裹的全氟十氢化萘纳米粒通过超声乳液法制备，其水合粒径稳定在350nm，电位为-5mV，且具有优异的载氧能力。

单独脂质体纳米粒水合粒径为100nm，电位为-45mV。

明胶酶响应性光热载氧水凝胶伤口敷料GCACF通过一锅法制备，将AC、FL、ColⅢ和明胶(Gel)共同加热搅拌制得。具体制备方法为：

将A型明胶在40℃条件下溶于FL溶液，以300r/min的速度搅拌30min。随后，向上述溶液中加入AC、ColⅢ和10％谷氨酰胺转氨酶，搅拌15min，静置冷却成胶，保存于4℃冰箱备用。该方法所得水凝胶敷料简称GCACF。

上述明胶酶响应性光热载氧水凝胶伤口敷料GCACF不仅能够在金黄色葡萄球存在的微环境中降解释放抗菌组分AC，同时可在近红外作用下利用Cypate的光热特性和光动力疗法协同杀菌。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明所得的水凝胶伤口敷料不仅可以响应微环境释放，在高效抗菌的同时，改善伤口缺氧微环境，促进细胞增殖和组织再生，进而加速伤口愈合。

(2)本发明所得的水凝胶伤口敷料可以响应微环境释放，同时有光热和光动力协同抗菌，降低了抗菌肽的用量，水凝胶的缓释作用使得抗菌肽的生物毒性大大降低。

(3)本发明的水凝胶伤口敷料制备过程简单，成本低廉，可以进行大规模生产。

附图说明

图1为抗菌短肽KKLRLKIAFK的结构式；

图2为不同体积10％谷氨酰胺转氨酶处理后，不同温度的GCACF的成胶性；

图3为AMP、Cypate和AC的HPLC分析谱图；

图4为AMP和AC的质谱图；

图5为FL的透射电镜(TEM)图；

图6为Lip和FDC@Lip的水合粒径(其中，左侧为Lip，右侧为FDC@Lip)；

图7为FL第一天和第七天水合粒径变化；

图8为Lip和FDC@Lip的电位变化图和溶液外观变化图；

图9为添加ColⅢ的明胶水凝胶(GC)扫描电镜(SEM)图；

图10为GCACF的扫描电镜(SEM)图；

图11为不同组分水凝胶成胶性图片；

图12为GC和GCACF的流体力学性能图片；

图13为AC的紫外-可见光吸收谱图；

图14为AC浓度的标准曲线；

图15为AC同一浓度不同光热功率的升温曲线；

图16为AC同一光热功率不同浓度的升温曲线；

图17为GCACF的光热升温曲线；

图18为AC在近红外光照下产生活性氧的图(从上到下，依次为0～10min)；

图19为水、Lip和FL载氧能力对比图；

图20为不同浓度AC对S.aureus的杀菌效果图；

图21为不同浓度AC对E.coil的杀菌效果图；

图22为经过近红外光照后，不同浓度AC对S.aureus的杀菌效果图；

图23为经过近红外光照后，不同浓度AC对E.coil的杀菌效果图；

图24为AC对S.aureus和E.coil的生长曲线抑制图；

图25为AC对S.aureus生物膜的抑制和破坏图；

图26为不同材料组分对S.aureus和E.coil的杀菌效果图；

图27为GCACF对S.aureus作用前后的Live/Dead染色图；

图28为溶血率图；

图29为细胞毒性实验数据图；

图30为材料对缺氧细胞活力恢复图；

图31为Western Blot实验数据图；

图32为GCACF对S.aureus感染小鼠伤口模型的治疗图；

图33为小鼠伤口组织涂板图；

图34为伤口组织的H&E、Masson、CD31免疫组化染色；

图35为小鼠的心、肝、脾、肺、肾组织切片；

图36为对比实施例1载药水凝胶(4mg AMP-Cypate)对L929细胞的生物相容性测定结果；

图37为对比实施例1不同浓度载药水凝胶对S.aureus的杀菌效果图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行详细阐述，但这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为对本发明实施的限制。

实施例1

1.酶响应性光热载氧水凝胶伤口敷料GCACF的制备

1)Cypate偶联抗菌肽(AC)的合成

Cypate与抗菌肽的结合是通过Cypate上的羧基与抗菌肽上的氨基反应，生成共价键得到。其中，HoBt在肽合成中起抑制外消旋作用，EDC作为羧基活化剂，催化反应进行。具体的操作步骤如下：

AMPs(KKLRLKIAFK)以Rink Amide-MBHA树脂为载体，采用Fmoc固相合成法合成。合成多肽序列后，使用20％哌啶溶液切除Fmoc保护基团，加入5倍当量的Cypate和1.2倍当量的EDC、HoBT，以DMF作为溶剂，室温避光反应过夜。之后加入切割液(TFA、EDT、H₂O和TIS(94:2.5:2.5:1，v/v/v/v))。反应三小时，将多肽从树脂上切割下来。随后加入冰乙醚，将AMP-Cypate沉淀出来，离心，取沉淀通过HPLC纯化沉淀物并通过LC-MS测定。

2)FDC@Lip(FL)的制备

FL纳米粒的制备采用超声乳液法，通过控制大豆卵磷脂和胆固醇的用量比来探究纳米粒的粒径大小及稳定性。具体实施过程如下：

a)将大豆卵磷脂和胆固醇按(12:1m/m)分别溶于5mL氯仿后混合均匀，随后用旋转蒸发仪将氯仿去除，加入适量水(3mg/mL)、水量0.08倍的乙醇和0.16倍的FDC。将体系置于细胞超声破碎仪，低温氮气保护，超声15min。

b)将大豆卵磷脂和胆固醇按(10:1m/m)分别溶于5mL氯仿后混合均匀，随后用旋转蒸发仪将氯仿去除，加入适量水(3mg/mL)、水量0.08倍的乙醇和0.16倍的FDC。将体系置于细胞超声破碎仪，低温氮气保护，超声15min。

c)将大豆卵磷脂和胆固醇按(8:1m/m)分别溶于5mL氯仿后混合均匀，随后用旋转蒸发仪将氯仿去除，加入适量水(3mg/mL)、水量0.08倍的乙醇和0.16倍的FDC。将体系置于细胞超声破碎仪，低温氮气保护，超声15min。

d)将大豆卵磷脂和胆固醇按(6:1m/m)分别溶于5mL氯仿后混合均匀，随后用旋转蒸发仪将氯仿去除，加入适量水(3mg/mL)、水量0.08倍的乙醇和0.16倍的FDC。将体系置于细胞超声破碎仪，低温氮气保护，超声15min。

表1

通过对a,b,c,d方案制得的FL纳米粒用马尔文粒径仪测量粒径，每个样平行测定三次，取平均值。得到结果如表1所示，可以看出大豆卵磷脂和胆固醇的质量比在10:1时所得纳米粒的粒径与PDI最小。表明纳米粒分散性较好，尺寸合适。

3)GCACF的制备

取1g A型明胶，加入10mL FDC@Lip，40℃水浴使明胶融化。随后加入0.2g重组三型胶原(ColⅢ)，继续搅拌使其溶解，加入100μL浓度为1000μM的AC溶液和1mL 10％谷氨酰胺转氨酶搅拌均匀，保证整个体系中AC的最终浓度为10μM，静置1h使其自行成胶，得到ACGCF，保存于4℃冰箱备用。因为是通过酶联成胶，在此之前探究了谷氨酰胺转氨酶的用量对成胶性影响，最终选择1mL用量。结果如表3和图2所示。

表2为10％谷氨酰胺转氨酶的用量

序号	用量/mL
		①	1.2
②	1
		③	0.5
④	0.2
		⑤	0

表3为不同配比的GCACF水凝胶在不同温度下的成胶情况

温度/℃	①	②	③	④	⑤
						25	√	√	√	√	√
30	√	√	√	√	√
						35	√	√	√	√	×
40	√	√	√	×	×
						45	√	√	×	×	×
50	√	√	×	×	×
						55	√	√	×	×	×

(√：成胶×：未成胶)

2.未载药水凝胶GC和Gel@ColⅢ+FDC@Lip(GCF)的制备。

按照载药水凝胶用量，添加1g A型明胶和0.2g ColⅢ，在40℃溶解于10mL水中，添加1mL 10％谷氨酰胺转氨酶，静置1h自行交联成胶(未载药水凝胶GC)。

Gel@ColⅢ+FDC@Lip(GCF)的制备。

取1g A型明胶，加入10mL FDC@Lip，40℃水浴使明胶融化。随后加入0.2g重组三型胶原(ColⅢ)和1mL 10％谷氨酰胺转氨酶搅拌均匀使其溶解，静置1h，使其成胶(Gel@ColⅢ+FDC@Lip)。

3.酶响应性光热载氧水凝胶伤口敷料GCACF的表征

1)AC的表征

取5mg AMP、AC用超纯水溶解，Cypate用乙腈和水溶解后，使用高效液相色谱仪和质谱仪，对化合物AC进行验证。结果如图3、图4所示：通过图3可以看出单独的AMP在700nm没有吸收峰，Cypate在700纳米有吸收峰，而偶联Cypate的AMP在700nm有吸收峰，且吸收峰位置发生偏移。结合图4的质谱图，可以证明AMP与Cypate成功偶联。

2)FL的水合粒径以及外貌测定

将合成的FL使用超纯水稀释10倍后，每个样平行测定三次，取平均值，用马尔文粒径仪以及透射电镜测量其水合粒径的分布以及外观形貌。结果如图5、图6所示：FL纳米粒分散性良好，且粒径分布在350nm处左右。同时可以发现，单独的脂质体粒径较小为100nm左右，包裹全氟十氢化萘后增大，再结合图8体系的电位和外观变化，可以初步证明，全氟十氢化萘包裹于脂质体。图7则表明FL纳米粒的稳定性较好。

3)GCACF的表征

将GCACF冷冻干燥后，使用扫描电镜观察GCACF的形貌。结果如图9、图10所示：水凝胶表明呈孔隙状，载药后，孔隙状现象明显减弱。通过外观观察(图11)，可以发现，各个组分相互融合。通过流变仪来评价GCACF水凝胶的成胶性能。测试结果如图12，无论是单独的GC还是载药后，水凝胶的储能模量始终大于损耗模量，表明水凝胶具有良好的成胶性。

4.AC与GCACF的光热和光动力性能探究

分别取300μL10μM的AC水溶液于2mL离心管中，在距离液面2cm处使用不同功率(0.5W/cm²、1.0W/cm²、1.5W/cm²、2.0W/cm²)近红外激光照射5min。不同浓度的升温曲线方法类似，在功率为1.5W/cm²时，测试不同浓度(0μM、2μM、4μM、6μM、8μM、10μM)的AC水溶液的升温曲线。结果如图15、图16所示，表明AC具有良好的光热特性。随后采用同样方法验证GCACF的光热特性，结果如图17所示，表明GCACF同样具有优异的光热特性。随后利用DPBF测定AC的光动力特性。DPBF(1,3-二苯基异苯并呋喃)在415nm左右处有吸收峰。DPBF对单线态氧具有高特异性，可形成内过氧化物并分解成1,2-联苯甲酰苯，导致吸其收峰降低。取1mL AC与1mL DPBF混合于石英皿中使用锡箔纸包裹避光，用808nm近红外激光器照射(1.5W/cm²)，每隔1min检测一次。结果如图18所示，在前两分钟，DPBF的吸收峰显著降低，表明有大量单线态氧生成，AC具有明显的光动力特性，进而可以协同杀菌。

5.FL的载氧能力探究

使用手持式电极溶氧仪来检测FL的氧含量变化，具体步骤如下：分别取5mL水、5mLLip溶液、5mL FL于10mL离心管中。同时向三个溶液中通入纯氧5min，随后使用手持式电极溶氧仪测量氧含量变化，连续检测5h。结果如图19所示，无论是最初的载氧量还是稳定后载氧量，FL均高于对照组，表明FL具有相对的载氧能力。

6.AC的体外抗菌实验

1)不进行近红外光热AC细菌涂板实验

用无菌水分别配制AC浓度分别为4、8、12、16、20μM的溶液，取10⁸CFU/mL的S.aureus菌液100μL分别与100μL不同浓度的AC溶液共同孵育1h(AC的实际工作浓度约为2、4、6、8、10μM)。用100μL的PBS溶液作为阴性对照，孵育结束后稀释2万倍后取100μL涂板，放入生化培养箱(37℃)培养过夜，对TSA板上长出的菌落数计数，每个样平行测三次。其中大肠杆菌与上述处理步骤一致。结果如图20、图21所示。可以看出AC对S.aureus的MIC90在8μM左右，对E.coil的MIC值在15μM左右。

2)近红外光热AC细菌涂板实验

用无菌水分别配制AC浓度分别为4、8、12、16、20μM的溶液，取10⁸CFU/mL的S.aureus菌液100μL分别与100μL不同浓度的AC溶液混合，随后使用808nm激光器进行近红外光照5min后共同孵育1h(AC的实际工作浓度约为2、4、6、8、10μM)。用100μL的PBS溶液作为阴性对照，孵育结束后稀释2万倍后取100μL涂板，放入生化培养箱(37℃)培养过夜，对TSA板上长出的菌落数计数，每个样平行测三次。其中大肠杆菌与上述处理步骤一致。结果如图22、图23所示。经过光热后，AC对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性明显提高，AC对S.aureus的MIC90在2μM左右，对E.coil的MIC值在5μM左右。抗菌效果显著提升。

3)AC的生长曲线测定

为了研究AC对两种细菌生长的影响，将过夜培养的S.aureus、E.coli细菌稀释至10⁵CFU/mL，分别向96孔板内加100μL的菌液，并分别加入100μL浓度为4μM和10μM的AC溶液(实际工作浓度为2μM和5μM)，分为6组：S.aureus+PBS组、S.aureus+AC组、S.aureus+AC+IR组、E.coli+PBS组、E.coli+AC组、E.coli+AC+IR组)，每组五孔作平行样。用808nm的激光器(1.5W/cm²)照射光照组5min，不经激光照射和加PBS溶液的作为对照组。使用酶标仪每隔一小时检测记录每孔在600nm处的吸光度，连续监测12h，根据测出的数据作图观察实验组和对照组细菌的生长曲线变化。结果见图24。结果与涂板结果相一致，在加近红外光照后，细菌生长收到明显抑制。

4)AC对金黄色葡萄球菌生物膜的抑制与破坏

a.生物膜的抑制

选取平底96孔板，向选定的9个孔中加入100μL的处于对数生长期的S.aureus菌液，分为3组：PBS对照组、AC组、AC+NIR(808nm激光照射5min)组，每组终体积200μL且AC实际工作浓度为4μM，每组共设立3个平行样。光照组使用808nm激光器(1.5W/cm²)照射5min。将96孔板置于37℃的生化培养箱中孵育48h，培养完成后使用移液枪缓慢吸出上层培养液，用PBS清洗孔2-3次，风干10min，再向每个孔内加100μL浓度为1％的结晶紫溶液染色20min。染色结束后，缓慢轻柔地用移液枪沿壁吸走结晶紫溶液，用灭菌PBS清洗选定孔3次，再风干10min后向每个实验孔加200μL的80％浓度的乙醇，将96孔板置于恒温摇床振荡至结晶紫完全溶解，使用酶标仪检测每个孔在590nm处的吸光度，取平均值并记录数据。结果如图25(左)所示，可以看出AC能抑制S.aureus的生物膜形成，经过近红外光照后，效果更加明显，这与先前的实验结果趋势一致。

b.生物膜的破坏

选取平底96孔板，向选定的9个孔中加入100μL的处于对数生长期的S.aureus菌液，将96孔板置于37℃的生化培养箱中孵育48h，使其长出生物膜。随后将生物膜分为3组：PBS对照组、AC组、AC+NIR(808nm 1.5W/cm²激光照射5min)组，每组终体积200μL且AC实际工作浓度为4μM，每组共设立3个平行样。光照组使用808nm激光器(1.5W/cm²)照射5min。将96孔板置于37℃的生化培养箱中孵育1h，培养完成后使用移液枪缓慢吸出上层培养液，用PBS清洗孔2-3次，风干10min，再向每个孔内加100μL浓度为1％的结晶紫溶液染色20min。染色结束后，缓慢轻柔地用移液枪沿壁吸走结晶紫溶液，用灭菌PBS清洗选定孔3次，再风干10min后向每个实验孔加200μL的80％浓度的乙醇，将96孔板置于恒温摇床振荡至结晶紫完全溶解，使用酶标仪检测每个孔在590nm处的吸光度，取平均值并记录数据。结果如图25(右)所示，AC同样对已生成的生物膜具有破坏作用，经过近红外光照后，效果更加明显。

5)GCACF抗菌涂板

取10⁸CFU/mL的S.aureus菌液100μL分别与100μL的GCACF和AC溶液共同孵育3h(AC的实际工作浓度约为4μM)。用100μL的PBS溶液作为阴性对照，光照组使用808nm激光器光照5min(功率为1.5W/cm²)。孵育结束后稀释2万倍后取100μL涂板，放入生化培养箱(37℃)培养过夜，对TSA板上长出的菌落数计数，每个样平行测三次。其中大肠杆菌与上述处理步骤一致。结果如图26所示。相对于大肠杆菌，金黄色葡萄球菌对GCACF水凝胶更为敏感，这与金黄色葡萄球菌能够分泌明胶酶有关，明胶酶可以降解明胶，使其中的抗菌材料AC释放出来，达到杀菌目的。

6)细菌活死染色

通过活/死菌染色法研究了GCACF光热前后对金黄色葡萄球菌的生存能力影响。取100μL GCACF分别加入到100μL浓度为10⁸CFU/mL的S.aureus中，共同孵育30min后光照组用近红外激光器(808nm，1.5W/cm²)照射细菌10min。将三组样品，5000rpm离心10min，弃上清，沉淀用30μL live/dead试剂染色，吹打均匀、涡旋后避光静置20min，最后取20μL样品滴在载玻片上，用倒置荧光显微镜观察。根据制造商的说明书，活的细菌细胞用SYTO 9染料染色(绿色)，而死的细菌细胞由于细胞壁和细胞膜受损，用碘化丙啶染料标记(红色)。结果如图27所示，在近红外光辐照下，发出的红色荧光最多，而PBS组尽管加了近红外辐照也几乎只显示出绿光。这表明GCACF可以进行光热光动力协同作用具有优异的光热抗菌效果。

7.GCACF的溶血实验

将新鲜小鼠血液离心(300rmp/min)5min后采集红细胞，离心后用无菌PBS(0.1M，pH＝7.4)离心洗3次。纯化后的红细胞再用PBS稀释至浓度为20％。然后将吸取20μL红细胞与不同浓度的AC、GCACF在离心管中于培养箱(37℃)中孵育。PBS和1％的曲拉通溶液分别为阴性和阳性对照。为了消除AC对血液吸收的干扰，将PBS与AC混合，按下述方法测量吸光度。溶血率计算公式如下：

溶血率(％)＝(A₁-A₂-A₃)/(A₄-A₃)

其中A₁、A₂、A₃、A₄分别为待测样品、同浓度的AC、阴性对照和阳性对照的吸光度值。

结果如图28所示，结果表明，在AC浓度为2.5μM时，溶血率已达10％左右，但AC浓度为10μM的GCACF的溶血率为3％左右，说明GCACF水凝胶能明显改善AC的溶血率和生物毒性。

8.GCACF的细胞毒性实验

以L929细胞为实验材料，采用MTT法检测GCACF水凝胶及其各组分的细胞毒性。首先，将L929细胞经过复苏、换液以及传代等操作，在细胞活力状态良好时进行实验。正式实验时，将L929细胞接种在96孔微孔板上(每孔10⁴个细胞)过夜，并分别用不同材料对细胞进行处理。该过程未接种的孔隙使用无菌PBS进行填充。孵育24h后，进行MTT检测，用酶标仪测量L929细胞在490nm处的吸光度，以评估水凝胶及其各组分的细胞毒性，从而研究细胞的活力。结果如图29所示，单独的AC对细胞有较大的毒性，细胞存活仅为对照组的60％左右，而GC组和GCACF组的细胞不受影响，存活率相对于对照组无明显变化。FL组，细胞的存活率相对于对照组有明显提高，这与FL携带氧气，促进细胞生长有关。这些结果说明GCACF具有良好的生物相容性。

9.GCACF对缺氧细胞恢复实验

本实验以L929细胞为实验材料，采用MTT法检测GCACF水凝胶及其各组分对缺氧细胞的影响。首先将L929细胞接种在96孔板上(每孔10⁴个细胞)过夜，随后加入工作浓度为600μM的CoCl₂，培养12h，诱导细胞缺氧。而后加入GCACF水凝胶及其各组分，37℃孵育24h。进行MTT检测，用酶标仪测量L929细胞在490nm处的吸光度，以评估水凝胶及其各组分对缺氧细胞的影响。结果如图30所示，AC组对缺氧细胞无改善作用。FL组和GCACF组由于含有FL纳米粒，对缺氧细胞有一定改善作用，GC组由于添加了重组胶原，对细胞生长具有促进作用。

10.Western Blot(WB)实验

为了进一步探究水凝胶及其组分对缺氧细胞的影响，使用WB实验技术，对缺氧细胞所表达的缺氧诱导因子(HIF)进行定性和定量分析。具体实验步骤如下：

1)首先按照表4配置分离胶和浓缩胶；

2)样品制备：将600μM CoCl₂与样品组一起加入细胞悬液中，培养12h。刮取细胞于离心管中，使用细胞裂解液冰浴裂解1h，离心取上清。使用BCA蛋白盒测定蛋白浓度，加入5X的Loading buffer(工作浓度为1X)；

3)跑胶：80V，30min；110V，150min；根据mark，裁剪120KDa、36KDa附近条带；

4)转膜：PVDF膜事先用甲醇激活；将三明治夹板黑色朝下，按照海绵垫、滤纸、胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫的顺序排好。120V，45min，进行低温转膜；

5)封闭：5％脱脂奶粉摇床1h，将PVDF膜上未结合的位点进行封闭；

6)孵一抗：分别加入HIF-α和GADPH对应的兔源一抗，4℃冰箱孵育过夜；

7)孵二抗：回收一抗，TBST清洗3×10min，加入兔源二抗，室温孵育1h；

8)显影：ECL显色剂进行显影曝光。

结果如图31，可以发现，GCACF组表达的HIF-1α蛋白相对于缺氧对照组较少，FL组表达的HIF-1α蛋白现对于对照组更少。说明FL能明显改善细胞缺氧情况，添加了FL的GCACF水凝胶也具有一定的改善细胞缺氧的作用。

表4

11.GCACF用于金黄色葡萄球菌感染的研究

1)建立金黄色葡萄球菌皮肤感染模型

具体建模方法如下：在Balb/c小鼠背部剃毛暴露出皮肤后过夜，第二天在背部使用打孔器构建椭圆形全厚度伤口，长轴约8mm，短轴约6mm；然后在伤口上滴入20μL金黄色葡萄球菌溶液(10⁸CFU/mL)过夜，为了确保感染成功，进行了两次感染。

2)金黄色葡萄球菌感染伤口的治疗

为了探究GCACF对细菌感染创面的治疗情况，将建立模型的实验小鼠分为7组，包括GCACF、GCACF+IR(1.5W/cm²，5min)、AC、AC+IR(1.5W/cm²，5min)、GC、FL和PBS，每组设3只平行样。将每只小鼠单独进行饲养，使其能够自由饮水、饮食从而消除其余实验干扰。该过程进行4次给药(前4天，每天1次)，光照组每次给药使用固定板将小鼠进行固定，整个近红外过程使用热成像仪进行温度监测，确保温度维持在46℃左右，以防止温度达不到治疗要求或是太高损伤正常组织。最后为了监测治疗过程感染创面的变化以及小鼠体征变化，每天拍摄创面照片。治疗第十天时，将组织部位用医用剪刀消毒后取下，将各组组织用等体积无菌PBS保存进行涂板实验，菌板放于放入培养箱37℃培养过夜，对菌落数进行计量。创面愈合效果及伤口菌落涂板结果见图32、图33。

通过实验结果，可以看出GCACF+IR组的治疗效果最近。PBS组，在第十天仍有细菌感染现象，伤口的痂下面有黄色脓。GC组与PBS组情况类似，因为没有抗菌成分，对细菌感染没有很好的作用。FL组，由于可以输送氧气，在伤口愈合的炎症阶段，可以为免疫细胞提供氧气，使免疫细胞更好的发挥作用，杀死细菌，所以愈合情况相对于PBS和GC组较好。AC组和AC+IR组可以高效杀菌，由于细菌的清除，可以为伤口愈合提供更好的环境，所以AC组和AC+IR组的伤口愈合情况较好。GCACF组的伤口愈合情况也较好，这是由于GCACF水凝胶材料兼具了杀菌与载氧能力，对伤口愈合有非常好的促进作用，再配合光热效果，可以进一步提高伤口愈合的速度，在第8天基本愈合，第10天完全愈合。同时由涂板结果可以看出，含有AC组分的实验组未见有细菌存在，表明细菌得到有效的杀灭，而在其它组，均有细菌存在，其中PBS组较多，这也与伤口愈合的情况相一致。这些结果均表明GCACF水凝胶在高效杀菌的同时，可以为伤口提供氧气，促进伤口愈合。

3)伤口组织切片

为了验证材料对伤口愈合情况的影响，对伤口组织进行染色评价。结果见图34。通过H&E染色可以发现PBS组、GC组、FL组均没有新生表皮。GC+FL组、AC+IR组和GCACF组有不连续的新生表皮，而GCACF+IR组具有连续的新生表皮(箭头示意)。同时，Masson染色以及CD31免疫组化也表现出相同的伤口愈合趋势。在Masson染色中，PBS组、GC组和FL组的胶原沉积(蓝色)较少且松散，GC+FL组的胶原沉积增多，但不及AC+IR组，主要原因是GC+FL组不含抗菌材料，虽然能为伤口愈合提供所需的胶原蛋白和氧气，但残存的细菌会干扰胶原的生成和伤口的正常愈合。这点也可以从添加了抗菌肽的GCACF组和GCACF+IR组看出。GCACF组和GCACF+IR组的胶原纤维粗大致密，具有规则的取向和胶原网络拓扑结构，与伤口愈合情况一致，表现出较好的愈合状态。CD31免疫组化从侧面验证了伤口愈合情况。CD31作为内皮细胞的典型标志物，通常与血管生成有关。结果表明GCACF+IR组有较多的新生血管生成(箭头所示)，表明伤口愈合情况较好。通过小鼠的心肝脾肺肾组织切片可以发现，实验组和对照组无明显差别，表明材料对小鼠主要脏器无毒性(图35)。

对照例1

酶响应性光热水凝胶的制备

加入4mg AMP(LLKKLRLKIA)-Cypate，得到GCACF(80μM)，其它同实施例1 1.酶响应性光热载氧水凝胶伤口敷料GCACF的制备。

经DMEM培养基稀释后得到浓度(0μM、2μM、4μM、6μM、8μM)，结果显示出一定的增值效果(图36)，但无法达到抗菌肽抗菌浓度(10μM)(图37)，因此无法满足细胞毒性实验浓度需求(上限需将抗菌浓度(10μM)包括在内)。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术范围。

Claims (8)

1.一种明胶酶响应性光热载氧水凝胶伤口敷料，其特征在于，所述明胶酶响应性光热载氧水凝胶伤口敷料由脂质体包裹的全氟十氢化萘纳米粒(FL)、连接Cypate的抗菌肽(AC)和添加了重组Ⅲ型胶原的明胶组成。

2.如权利要求1所述的明胶酶响应性光热载氧水凝胶伤口敷料，其特征在于，所述明胶酶响应性光热载氧水凝胶伤口敷料中的Cypate最大吸收波段为780nm。

3.如权利要求1所述的明胶酶响应性光热载氧水凝胶伤口敷料，其特征在于，所述抗菌肽序列为KKLRLKIAFK，采用固相法合成，最大吸收波段为780nm。

4.如权利要求1所述的明胶酶响应性光热载氧水凝胶伤口敷料，其特征在于，所述连接Cypate的抗菌肽是Cypate中的羧基与抗菌肽氨基酸游离的氨基通过共价键连接形成，其最大吸收峰为780nm。

5.如权利要求1所述的明胶酶响应性光热载氧水凝胶伤口敷料，其特征在于，所述脂质体纳米粒通过超声乳液法制备，其水合粒径稳定在100nm，电位为-45mV。

6.如权利要求1所述的明胶酶响应性光热载氧水凝胶伤口敷料，其特征在于，所述包裹全氟十氢化萘的脂质体水合粒径为350nm，电位为-5mV。

7.一种如权利要求1所述的明胶酶响应性光热载氧水凝胶伤口敷料的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：将AC、FL、ColⅢ和明胶共同加热搅拌制得。

8.一种如权利要求1所述的明胶酶响应性光热载氧水凝胶伤口敷料的应用，其特征在于，所述明胶酶响应性光热载氧水凝胶伤口敷料用于杀菌，促伤口愈合。

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