CN112316137A - 一种抗菌纳米材料Au-AMP-Cy的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于金属纳米材料技术领域，具体公开了一种抗菌纳米材料Au‑AMP‑Cy的制备与应用。通过Au‑S键将光热材料Cypate标记的序列为R₉KIKKVKKKGRKC的抗菌肽连接到纳米金上。引入光热材料Cypate为了进行光热抗菌（PTT），利用它在激光的照射下，产生热量，导致微生物升温并导致细胞损伤和死亡，与抗菌肽（AMP）产生协同抗菌作用。本发明制备的抗菌纳米材料Au‑AMP‑Cy具有较传统抗菌肽更优异的抗菌性能，并且以纳米材料作为载体，既能增加材料的稳定性又能增加生物相容性。

Description

一种抗菌纳米材料Au-AMP-Cy的制备方法和应用

技术领域

本发明属于抗菌材料技术领域，具体涉及一种具有抗菌性能以及光热疗法的新型纳米材料Au-AMP-Cy的制备方法和应用。

背景技术

多重耐药细菌感染的发病率急剧上升，对人类健康构成了严重挑战，创面多重耐药细菌感染会不仅加重创面恶化，愈合延迟，甚至导致脓毒症最终死亡。在过去的几十年中，抗生素是治疗细菌性疾病的主要选择。但是，随着抗生素的广泛使用和多药耐药菌的出现，抗生素的治疗效果大大降低，且过度使用抗生素引起的细菌耐药性可能比癌症还严重。考虑到新药发展缓慢和耐药菌病原体的发展，因此迫切需要研发新的治疗方法来替代传统抗生素的应用，这也是目前生物医学领域亟待解决的问题。

光热疗法（PTT）是一种对抗耐药性细菌的一种有效方法，由于其无创性和较少的副作用而受到了广泛的关注。光热疗法利用具有较高光热转换效率的材料,在外部光源的照射下将光能转化为热能，引起细菌表面升温，使其蛋白质变性，进而导致细菌的死亡，而且可以避免产生耐药性。

抗菌肽（antimicrobial peptide，AMP）是一种具有抗菌活性的多肽，因其具有抗菌范围广、活性高、种类多等优点，成为一种炙手可热的新型抗菌药物。当AMPs与靶膜结合时，膜渗透发生，导致细胞成分渗漏，最终导致细胞死亡。已经提出了几种模型来解释AMPs破坏膜的机理（附图1）。在环状孔模型中，肽在膜表面积聚，导致脂质单分子膜在孔内不断弯曲，插入的肽和脂质在孔内积聚。桶壁模型假设附着的肽首先积聚在外膜上，并且最终插入细胞膜中。亲水性肽部分形成核心的内部区域，疏水区朝向细胞膜脂质，在地毯状模型中，没有孔隙形成。肽与细菌膜平行聚集，像地毯一样覆盖在膜表面。附着在表面的肽会引发膜的渗透性，导致膜以类似洗涤剂的方式破裂，最终形成胶束。

在本发明中，我们将光热材料Cypate与抗菌肽（AMP）偶联，并通过Au-S键将其偶联到纳米金表面，从而开发了一种新型多功能抗菌纳米材料Au-AMP-Cy。引入光热材料Cypate为了PTT抗菌，利用它在激光的照射下，产生热量，导致微生物升温并导致细胞损伤和死亡，与抗菌肽（AMP）产生协同抗菌作用。

发明内容

为了克服现有技术中的不足，本发明将抗菌肽（AMP）与光热材料Cypate同时固定在纳米金上，提供一种Au-AMP-Cy复合纳米抗菌材料，本发明制备的抗菌复合材料在抑菌、杀菌领域均有广泛的应用前景。

本发明的具体技术方案如下所述：

1、本发明制备的Au-AMP-Cy纳米材料由纳米金、抗菌肽（AMP）和光热材料Cypate三部分共同组成。

2、本发明制备的Au-AMP-Cy纳米材料中的纳米金是通过氯金酸还原得到的，颜色为酒红色，加入纳米金的目的在于，增加材料的稳定性和生物相容性。

3、本发明制备的Au-AMP-Cy纳米材料中的抗菌肽（AMP），其序列为R9KIKKVKKKGRKC，采用常规的固相Fmoc法合成，即固相树脂上被Fmoc保护的单体氨基酸去保护后露出氨基，通过缩合反应与溶液中氨基酸的羧基形成肽键，从而将氨基酸连接到树脂上，使肽链从C端向N端延伸，直至合成所需肽链。

4、本发明制备的Au-AMP-Cy纳米材料中的光热材料Cypate，它能够在近红外激光（808 nm）照射下产生热量，从而触发细菌的损伤和死亡，有着显著的光热抗菌效果（PTT）。

5、本发明制备的Au-AMP-Cy纳米材料，其合成方法为：在400 μL纳米金中加入400μL AMP-Cy（250 μM），放入摇床250 r/min，20 h。待反应完成后，将混合溶液收集于2 mL的高转速离心管中，用高速离心机将溶液以13000 rpm离心15 min。离心完成后，去上清向沉淀中加入去离子水重悬，重复离心3次。即得到最终的Au-AMP-Cy抗菌纳米材料。

6、本发明制备的Au-AMP-Cy纳米材料，其水合粒径为208 nm，并且连续监测7天，无明显聚集现象，其在水溶液中趋于稳定状态。

7、本发明制备的Au-AMP-Cy纳米材料，有着显著的光热转化效率，经近红外激光照射后，产生的热量对细菌有着杀伤作用，与AMP产生协同抗菌作用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开的方法制备得到的Au-AMP-Cy纳米复合抗菌材料，将传统抗菌肽（AMP）与光热疗法（PTT）相结合，发挥协同抗菌作用，具有较高的抗菌活性，并且以纳米材料作为载体，既能增加材料的稳定性又能增加生物相容性。可广泛应用于抑菌、杀菌领域中，本发明公开的制备工艺简单，原料来源广泛，反应条件温和，易于合成，适于推广使用。

附图说明

图1为AMP的作用机制模型（A）环形孔模型（B）桶壁模型和（C）地毯状模型。

图2为光热材料Cypate的合成路线。

图3为光热材料Cypate的紫外吸收图谱。

图4为光热材料Cypate的标准曲线。

图5为光热材料Cypate的质谱分析图谱。

图6为纳米金的颜色表征。

图7为AMP-Cy的HPLC图。

图8为Au-AMP-Cy纳米材料的水合粒径图。

图9为Au-AMP-Cy纳米材料的粒径稳定性图。

图10为光热材料Cypate的升温曲线图。

图11为Au-AMP-Cy纳米材料处理的S. aureus菌琼脂板图。

图12为不同材料处理组S. aureus菌的SEM图。

图13为AMP对S. aureus菌存活率的影响图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行详细阐述，但本发明不局限于这些实施例。

实施例1

1、材料的合成与表征

（1）光热材料Cypate的合成与表征

称量3-溴丙酸4g、1,1,2-三甲基-[1H]-苯并[e]吲哚4g和1,2-二氯苯20mL于100mL烧瓶中，将烧瓶置于油浴锅中，并在110℃下搅拌加热18h。将产物用适量的二氯甲烷洗涤，颜色变为棕灰色，于恒温干燥箱中干燥。称量戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐（红色固体）521mg，三水合乙酸钠（白色晶体）649mg，第一步产物6.4 g，同样置于上述100mL烧瓶中。再向其中加入乙醇37mL，于油浴锅中冷凝回流90min。溶液反应过程中，反应现象为深红色溶液变为深绿色（附图2）。

最后将上述产物用HCl反复冲洗，离心，经HPLC分离纯化后，得到最终的光热材料Cypate。分子量通过LC-MS确定（附图3）。

将合成的Cypate经滤膜过滤之后，稀释一倍，每个样平行测定三次，取平均值，用紫外-可见分光光度计进行吸收波长的扫描并确定最大紫外吸收波长（附图4）。

如附图4所示，由紫外-可见分光光度计在500-950 nm范围内的波长扫描结果，可以得出Cypate在790 nm处有最大吸收。

为了定量，可建立Cypate的标准曲线。分别配制不同浓度的Cypate标准溶液溶液，每组浓度配制3份，然后测定每组浓度在790 nm处的吸光度值，取平均值，用平均吸光度值和浓度作图，并进行线性回归处理（附图5）。

如附图5所示，Cypate溶液的标准方程，为y = 0.1517χ + 0.0626，R² = 0.9998，这样可认为Cypate吸光度值和浓度呈线性关系，可通过测定Cypate在790 nm处的吸光度值，间接得到材料的浓度。

（2）纳米金的合成与表征

在装有冷凝器的1 L圆底烧瓶中，在剧烈搅拌下将100 mL 1 mM HAuCl₄加热至滚沸状态。向溶液的涡旋中快速加入10 mL的38.8 mM柠檬酸钠，继续煮沸10 min，停止加热，继续搅拌15 min。冷却至室温，得到纳米金。合成的纳米金，经水系滤膜（0.22 μm）过滤之后，颜色为酒红色（附图6），且无沉淀。

注：所有的玻璃器皿都需用王水洗净，所用水为去离子水。

（3）抗菌肽（AMP）的合成与表征

首先合成多肽R₉KIKKVKKKGRKC，多肽是基于带有Fmoc保护基团的2-ChlorotritylChloride树脂，通过固相多肽合成法得到。具体为：分别称取相当于树脂5倍摩尔量的氨基酸（经化学修饰的α-氨基酸）、HBTU、HOBT，溶于DMF中，加入DIEA偶联30 min。然后加入20%哌啶反应30 min脱去Fmoc保护基，重复此步骤直达合成所需的肽链。

光热材料Cypate标记多肽：称取30 mg树脂（上述合成的有肽链的树脂），和相当于树脂3倍摩尔量的Cypate、HOBT、EDC溶解于1 mL DMF中，加入10 μL DIEA避光过夜反应，最后用切割液将标记的多肽从树脂上裂解下来，HPLC纯化（附图7）。

如附图7所示，经纯化后多肽产物峰为单一主峰，出峰时间为19分钟。

（4）Au-AMP-Cy抗菌纳米材料的合成与表征

在400 μL纳米金中加入400 μL AMP-Cy（250 μM），放入摇床250 r/min，20 h。待反应完成后，将混合溶液收集于2 mL的高转速离心管中，用高速离心机将溶液以13000 r离心15min。离心完成后，去上清向沉淀中加入去离子水重悬，重复离心3次。即得到最终的Au-AMP-Cy抗菌纳米材料。

分别取合成好的Au、Au-AMP、Au-AMP-Cy各40 μL，用去离子水稀释至2 mL。用于测水合粒径，每组样品平行测定三次，并监测整个过程的变化（附图8）。

在材料制备过程中，我们通过测定Au、Au-AMP、Au-AMP-Cy的水合粒径的变化来验证每一步是否偶联成功，若水合粒径数据发生正确变化，则为材料的成功合成提供依据。由附图8可以发现，从最初的纳米金到最终的Au-AMP-Cy纳米材料，其水合粒径逐渐增大，证明了AMP以及AMP-Cy的成功偶联，最终合成的Au-AMP-Cy纳米材料的水合粒径约为208 nm。

为了评价制备完成的Au-AMP-Cy纳米材料在去离子水中的粒径稳定性。检测时间为7天，每天吸取20 μL的Au-AMP-Cy纳米材料于1.5 mL的离心管中，再用去离子水将其稀释至1 mL，然后用纳米粒度及电位仪测定Au-AMP-Cy纳米材料的水合粒径，每天平行测定多次（n ≥ 3），记录得到的数据取平均值，即可做出Au-AMP-Cy纳米材料的水合粒径稳定性结果（附图9）。

由附图9可以看出Au-AMP-Cy纳米材料在去离子水溶液中储存7天后，检测到的纳米材料的水合粒径没有显着增加，表明制备的Au-AMP-Cy纳米材料纳具有高结构稳定性并且在水性环境中分散性良好。

2、Au-AMP-Cy纳米材料的光热转化性能考察实验

取制备好的Au-AMP-Cy纳米材料样品（20 μg/mL），分别稀释20、10、4、2倍。设立对照组为去离子水，将5组不同浓度的样品各取1 mL，放在2 mL的离心管中，然后用功率密度为1.5W/cm²的808 nm激光器照射5组样品6 min，用热像仪持续观察5组纳米材料溶液的温度增幅（附图10）。

Cypate能够将吸收到的光能转化为热能，这为利用Cypate的光热效应协同抗菌奠定了良好的基础。我们设计了不同浓度的Au-AMP-Cy纳米材料（1、2、5、10 μg/mL）检测其光热转化效率，以去离子水作为对照。结果如附图10所示，当用808 nm的激光器（功率密度为1.5 W/cm²）去照射不同浓度的Au-AMP-Cy纳米材料时，Au-AMP-Cy纳米材料表现出优异的光热升温能力，经过6 min的近红外激光照射，其温度大幅升高，而对照组水的温度变化几乎为零。从图中仍然可以发现，Au-AMP-Cy纳米材料中Cypate浓度越高，溶液在相同时间内升温越高，这为后续抗菌实验提供了良好的基础。

3、Au-AMP-Cy纳米材料的抗菌实验

（1）细菌复苏

首先将冻存好的S. aureus（ATCC 6538）从-80 ℃冰箱中取出（拿取细菌时注意快速，防止冻伤），将其放在温度设置为37 ℃的水浴锅中剧烈摇晃使之解冻。取10 mL对应的培养基加入摇菌管中，待解冻完成后，将菌液加入对应的培养基中培养。将摇菌管放置于37 ℃，250 r的恒温摇床中培养过夜。

（2）细菌传代

培养完成后，取100 μL菌液加入对应的5 mL培养基中，在恒温摇床中培养6 h，细菌处于对数生长期可用于实验。通过测量其在600 nm处的吸光度（OD₆₀₀）来确定细菌的浓度，得到的OD₆₀₀的数值如果在0.6-0.8之间，表明细菌处于旺盛生长的对数生长期。

（3）Au-AMP-Cy纳米材料的光热抗菌涂板实验

各取浓度为10⁸ CFU/mL的S. aureus菌液500 μL于两个1.5 mL的离心管中，分别向两管菌液中加入浓度为20 μg/mL体积为200 μL的Au-AMP-Cy纳米材料，涡旋混合均匀。其中一个样品用808 nm近红外激光器（功率密度为1.5 W/cm²）照射6 min，另一个样品不做光照处理。将两个样品放置于温度为37 ℃，转速为250 r的恒温摇床中，培养30 min。培养完成后，将两组样品分别用灭菌PBS缓冲溶液稀释10⁵，然后各取100 μL涂于胰酪胨大豆琼脂板（TSA）上，以PBS作为对照，每组设置3个平行样，并将9个琼脂板放于温度为37 ℃的生化培养箱中孵育过夜。观察琼脂板上菌落的数量（附图11）。

为了考察Au-AMP-Cy纳米材料的光热抗菌性能，将Au-AMP-Cy纳米材料与S. aureus细菌混合均匀，分为两组，一组用近红外激光照射，另一组不做光照处理，并以PBS作为对照，结果如附图11所示，不经激光照射组相对于对照组而言仅观察到少量菌落，这是AMP发挥了作用，而经近红外激光（808 nm）照射处理后，没有细菌能在TSA琼脂板上长出，这说明Au-AMP-Cy纳米材料有着显著的光热转化效率，经近红外激光照射后，产生的热量对细菌有着杀伤作用，与AMP产生协同抗菌作用。

（4）细菌扫描电子显微镜实验

各取1 mL S. aureus菌液于2个1.5 mL的离心管中，用冷冻低速离心机以5000 r，4℃，离心5 min，离心完成后，弃去上清，向沉淀中加入200 μL灭菌PBS溶液重悬备用，细菌浓度为10⁸ CFU/mL。分别向两管配制好的菌液中加入体积为400 μL 浓度为20 μg/mL的Au-AMP-Cy纳米材料，涡旋混合均匀。然后将两个样品放置于37 ℃，250 r的恒温摇床中，将Au-AMP-Cy纳米材料与S. aureus菌液共孵育30 min。其中一组样品用808 nm近红外激光器（功率密度为1.5W/cm²）照射6 min，另一组样品不做光照处理，并以PBS作为对照。照射完成后，三组样品用冷冻低速离心机以5000 r，4 ℃，离心5 min，离心完成后，去上清，细菌与材料沉淀用200 μL灭菌PBS缓冲溶液多次清洗。按照上述条件再次离心，加入200 μL 4%的戊二醛溶液，避光静置2 h。以5000 r，4 ℃，离心5 min，去上清，加入1 mL 50%的乙醇溶液，吹打均匀，脱水10 min，再次离心，接着依次用70%、90%、100%的乙醇溶液进行脱水处理。PBS清洗，并滴加处理完成的三组样品于硅片上，过夜风干，在扫描电子显微镜下观察（附图12）。

附图12是Au-AMP-Cy纳米材料与S. aureus细菌孵育完成后，再经808 nm激光照射前后，S. aureus细菌在扫描电子显微镜的观察下的细菌形貌表征图（放大倍数为20000倍）。从图中我们可以看出，对照组的细菌形貌呈现饱满的葡萄状，细菌有着鲜明的轮廓，表面光滑结构饱满，未被破坏。而与Au-AMP-Cy纳米材料孵育，但未经过近红外激光（808 nm）照射的S. aureus细菌遭到部分破坏，这是AMP作用的结果。而与材料孵育再经过激光照射后，S. aureus细菌形貌完全被破坏，细菌膜呈现熔融状态，细菌与细菌间的轮廓不再分明，细菌死亡。再次说明了Au-AMP-Cy纳米材料有着优良的光热抗菌效果，且与AMP产生协同抗菌作用，抗菌效果显著。

对比实施例1

1、AMP对S. aureus菌存活率的影响

为了探究单独AMP对S. aureus菌存活率的影响，用无菌水配制不同浓度的AMP，取10⁸CFU/mL的S. aureus菌液1 mL与250 μL的AMP共同孵育1小时（AMP的终浓度分别为0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 μg/mL），稀释10³，取100 μL涂板，放入生化培养箱15小时，15小时后，对琼脂平板上长出的菌落数进行计数。每个样平行测定三次（附图13）。

如附图13所示，单独AMP对S. aureus的存活率有明显的抑制作用，且浓度越大抑制效果越好。

Claims (6)

1.一种抗菌纳米材料Au-AMP-Cy，其特征在于，其由纳米金、抗菌肽（AMP）和光热材料Cypate三部分共同组成。

2.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，纳米金由氯金酸还原法制得，水合粒径约为20nm。

3.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，抗菌肽（AMP）的序列为R₉KIKKVKKKGRKC，采用常规的固相Fmoc法合成。

4.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，引入光热材料Cypate是为了进行光热抗菌（PTT），利用它在激光的照射下产生大量的热量，致使细菌死亡，光热材料Cypate标记多肽：称取30 mg树脂（上述合成的有肽链的树脂），和相当于树脂3倍摩尔量的Cypate、HOBT、EDC溶解于1 mL DMF中，加入10 μL DIEA避光过夜反应，最后用切割液将标记的多肽从树脂上裂解下来，HPLC纯化。

5.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，通过Au-S键将Cypate标记的AMP连接到纳米金上，并离心去除未反应物质。

6.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，所述抗菌纳米材料用于抑菌、杀菌领域。

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