CN114106354B - 可原位自催化产生过氧化氢并持续释放no和自由基的纳米复合材料及其制备方法与应用 - Google Patents

可原位自催化产生过氧化氢并持续释放no和自由基的纳米复合材料及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料及其制备方法与应用，属于生物医学工程材料领域。本发明首先将葡萄糖氧化酶，NO供体和自由基供体载入到可降解金属有机框架MOF纳米材料中，获得可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料。在葡萄糖底物存在条件下，本发明的可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料可原位精准释放一氧化氮与自由基，实现协同、高效的抗菌效果。本发明制备的可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料能有效改善表皮伤口感染并促进伤口愈合，同时能有效消除皮下脓包感染，有望应用于多种细菌感染疾病。

Description

可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医学工程材料领域，特别涉及一种可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料及其制备方法与应用。
背景技术
如今，细菌感染引起的疾病严重危及人类公众健康。临床上，常规的对抗细菌的方式是使用抗生素，然而抗生物的滥用易导致细菌耐药性的产生甚至超级细菌的出现，使得抗生素的治疗效果并不理想。因此，新型抗菌材料尤其是抗耐药菌材料的研发意义重大。
近期，气体治疗由于其绿色、安全、高效等优点，在抗菌、抗肿瘤等生物医学应用上受到研究人员的广泛关注。一氧化氮(NO)是机体内作用广泛且性质独特的信号分子，参与人体多种生理活动，在免疫反应、癌症治疗、抗菌感染和组织修复等方面具有重要的作用。近年来，NO因其具有高效杀菌和良好的生物膜消散性能，且不易导致耐药性，逐渐发展成为一种新型的抗菌药物。然而，作为高活性气体分子，如何对其进行高效负载和实现有效控释，并尽可能提高其抗菌性能，成为当前NO抗菌材料发展的关键。目前，已有多种纳米材料被设计合成用于NO的递送和可控释放研究。这些纳米体系能够利用外源性或内源性的刺激条件，如X-射线、超声、紫外光、近红外光、pH、温度、GSH及H2O2等，实现NO的控释。开发具有控释功能的NO纳米材料将更有利于推动NO纳米体系在临床医学的转化应用。
此外，NO疗法虽在抗菌领域具有一定的效果，但单一的NO疗法还不能完全抑制细菌。近年来，基于自由基(单线态氧、羟基自由基、超氧自由基等)的治疗方法也被广泛用于抗菌的治疗研究。仿中性粒细胞仿生疗法由于其具有低毒高效的优势而备受研究者关注。中性粒细胞是功能强大的效应白细胞，在先天免疫系统中对抵抗肿瘤进展和改善病原体感染起着重要作用。人工“超级嗜中性粒细胞”被提出具有出色的炎症靶向性和次氯酸(HClO)生成特性，HClO可进一步生成活性氧自由基(ROS)，有效消除细菌等病原体。目前基于中性粒细胞治疗的纳米体系的制备常采用中性粒细胞膜修饰制备的方法，虽然该方法可避免免疫监视，具有靶向能力，但是中性粒细胞膜来源受限，成本高，不利于量产，生物活性不稳定，相比之下，负载活性酶的类中性粒细胞纳米材料易于制备，能够实现量产并长时间保持高活性，目前越来越被大家认可。然而，高活性HClO的产生，依赖于H2O2的浓度。而体内能够提供的H2O2含量有限，导致不能在感染部位持续催化产生高活性的HClO成分，从而不能保证其持续、有效的抗菌疗效。
近年来生物催化反应的发展促进了多功能酶系统在生物医学领域的应用。葡萄糖氧化酶(Gox)是一种需氧脱氢酶，可在体内持续将葡萄糖转化为葡萄糖酸和H2O2，避免了直接添加高浓度的H2O2产生的毒副作用，降低了不良反应发生率，同时达到原位自催化持续产生高活性H2O2的效果，促发NO和HClO的高效可控释放。该过程产生的HClO可生成活性氧自由基ROS，和NO结合进一步生成活性氮自由基RNS，直接氧化细胞成分，继而诱导DNA损伤和细菌生物膜消散，达到有效的抗菌效果。因此，开发可原位自催化产生过氧化氢并持续释放自由基的纳米体系及其抗菌功能研究，在纳米医学领域具有一定的意义和临床应用前景。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料的制备方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法制备得到的可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料，该纳米复合材料可原位自催化产生过氧化氢并持续释放自由基，具有一氧化氮/次氯酸协同抗菌作用。
本发明的再一目的在于提供上述可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)将对苯二甲酸、2-氨基对苯二甲酸、FeCl3·6H2O溶解于有机溶剂中，高温反应，离心后洗涤沉淀，溶解，得到金属有机框架MOF材料溶液；
(2)将葡萄糖氧化酶Gox溶液加入步骤(1)得到的金属有机框架MOF材料溶液中，搅拌反应，离心后洗涤沉淀，溶解，得到MOF-Gox复合材料溶液；
(3)将NO供体溶液加入到上述步骤(2)得到的MOF-Gox复合材料溶液中，搅拌反应，离心后洗涤沉淀，溶解，得到MOF-Gox-NO供体复合材料混合溶液；
(4)在步骤(3)得到的MOF-Gox-NO供体复合材料混合溶液中，加入自由基前体药物过氧化物酶溶液，搅拌反应，离心后洗涤沉淀，即得到可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料。
步骤(1)中，所述的对苯二甲酸、2-氨基对苯二甲酸和FeCl3·6H2O优选按质量比55～65:55～65:60～70；更优选为按质量比60.1:61.1:67.6计算。
步骤(1)中，所述的有机溶剂优选包括但不限于DMF和N-甲基吡咯烷酮中的至少一种。
步骤(1)中，所述的对苯二甲酸与有机溶剂优选按质量体积(mg:mL)比55～65:100计算；更优选按质量体积比60.1:100计算。
步骤(1)中，所述的高温反应的条件优选为100～140℃反应10～14h；更优选为120℃反应12h。
步骤(1)中，所述的高温反应可通过油浴、烘箱电加热和微波加热中的至少一种反应器中进行。
步骤(1)中，所述的离心的条件优选为：500～12000rpm离心5～15min；更优选为：10000rpm离心10min。
步骤(1)中，所述的洗涤的试剂优选为乙醇；更优选为纯度>99％的乙醇。
步骤(1)中，所述的洗涤的次数为2～5次；优选为3次。
步骤(1)中，所述的溶解的试剂优选为PBS缓冲液；更优选为：pH为7.4、摩尔浓度为0.01M的PBS缓冲液。
步骤(2)中，所述的金属有机框架MOF材料与葡萄糖氧化酶Gox优选按质量比1:0.125～0.375计算。
步骤(2)中，所述的搅拌反应的转速优选为100～300rpm；更优选为150rpm。
步骤(2)中，所述的搅拌反应的时间优选为4～16h；更优选为12h。
步骤(2)中，所述的离心的条件优选为500～12000rpm离心5～15min；更优选为10000rpm离心10min。
步骤(2)中，所述的洗涤的试剂优选为PBS缓冲液、生理盐水、超纯水和Tris-HCl缓冲液中的至少一种。
步骤(2)中，所述的洗涤的次数为2～5次；优选为3次。
步骤(2)中，所述的溶解的试剂优选为超纯水。
步骤(3)中，所述的NO供体优选包括但不限于N,N′-二仲丁基-N,N′-二亚硝基-1,4-苯二胺(BNN6)、N-亚硝胺、金属-NO络合物、罗森黑盐(RBS)和双-氮-亚硝基化合物(BNNs)中的至少一种。
步骤(3)中，所述的NO供体与MOF-Gox复合材料优选按质量比1～3:1计算；更优选按质量比1:1计算。
步骤(3)中，所述的NO供体溶液的试剂优选为乙醇；更优选为浓度不低于25％的乙醇。
步骤(3)中，所述的搅拌反应的转速优选为100～300rpm；更优选为150rpm。
步骤(3)中，所述的搅拌反应的时间优选为4～16h；更优选为12h。
步骤(3)中，所述的离心的条件优选为500～12000rpm离心5～15min；更优选为10000rpm离心10min。
步骤(3)中，所述的洗涤的试剂优选为PBS缓冲液、生理盐水、超纯水和Tris-HCl缓冲液中的至少一种。
步骤(3)中，所述的洗涤的次数为2～5次；优选为3次。
步骤(3)中，所述的溶解的试剂优选为超纯水。
步骤(4)中，所述的过氧化物酶优选包括但不限于髓过氧化物酶(MPO)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和氯过氧化物酶(CPO)中的至少一种；更优选为谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和氯过氧化物酶(CPO)中的至少一种。
步骤(4)中，所述的过氧化物酶的酶活优选为2000～4000Units/mL。
步骤(4)中，所述的搅拌反应的转速优选为100～300rpm；更优选为150rpm。
步骤(4)中，所述的搅拌反应的时间优选为2～12h；更优选为4～12h。
步骤(4)中，所述的离心的条件优选为500～12000rpm离心5～15min；更优选为10000rpm离心10min。
步骤(3)中，所述的洗涤的试剂优选为PBS缓冲液、生理盐水、超纯水和Tris-HCl缓冲液中的至少一种。
步骤(3)中，所述的洗涤的次数为2～5次；优选为3次。
一种可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料，通过上述制备方法制备得到。
所述的可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料在生物医学药物中的应用，尤其是在抗菌药物中的应用。
所述的抗菌药物优选包括抑制细菌生长和/或繁殖的药物；所述的细菌优选包括但不限于耐药细菌；更优选为金黄色葡萄球菌S.aureus、多重耐药性金黄色葡萄球菌MRSA和革兰氏阴性菌代表大肠杆菌E.coli中的至少一种。
所述的可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料通过NO/次氯酸协同抗菌作用实现抗菌、杀菌的目的。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供了在葡萄糖底物存在条件下可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料的制备方法；本发明首先将葡萄糖氧化酶Gox，NO供体和自由基供体载入到可降解金属有机框架MOF纳米材料中，获得可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料。在葡萄糖底物存在条件下，本发明的可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料可原位精准释放一氧化氮与自由基，实现协同、高效的抗菌效果。
(2)本发明采用生物相容性良好的葡萄糖氧化酶原位自催化葡萄糖持续产生充足的H2O2，天然无毒，酶促反应温和，相比体外添加高浓度的强氧化剂H2O2，降低了不良反应发生率，更适应临床需求。
(3)本发明采用葡萄糖氧化酶作为H2O2供体，其能够在葡萄糖存在条件下产生H2O2，进一步使NO供体和自由基供体原位精准持续释放一氧化氮和自由基。
(4)本发明选用负载过氧化物酶的方法制备可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料，制备方法简易且易于控制，能够实现量产并长时间保持高活性。
(5)本发明提供了一种能够同时储存一氧化氮和自由基，并能原位自催化产生过氧化氢，实现原位精准释放一氧化氮和自由基的可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料；该纳米复合材料对革兰氏阳性和阴性菌均显示出明显的广谱抗菌作用，对多重耐药性金黄色葡萄球菌MRSA亦显示出良好的抗菌效果，在抗菌方面尤其是抗耐药菌方面显示出重要的应用前景。
(6)本发明制备的可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料能有效改善表皮伤口感染并促进伤口愈合，同时能有效消除皮下脓包感染，有望应用于多种细菌感染疾病。
(7)本发明得到的可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料在葡萄糖存在条件下，可同时释放一氧化氮和自由基，达到多模态协同高效抗菌的作用，为抗菌纳米体系提供了一个新的平台，为解决细菌耐药性问题提供新的思路，具有重大的临床指导意义。
附图说明
图1为本发明可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料的制备过程及释放药物级联反应示意图。
图2为实施例1所得的金属有机框架MOF材料的透射电镜图。
图3为实施例2制备的可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料催化不同终浓度的葡萄糖产生过氧化氢的结果图；其中a代表葡萄糖终浓度为0μM时可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料催化葡萄糖产生过氧化氢结果图；b代表葡萄糖终浓度为1.5μM时可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料催化葡萄糖产生过氧化氢结果图；c代表葡萄糖溶液中葡萄糖的浓度为2.5μM时可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料催化葡萄糖产生过氧化氢结果图；d代表葡萄糖溶液中葡萄糖的浓度为5μM时可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料催化葡萄糖产生过氧化氢结果图。
图4为实施例5所得的可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料的NO释放量曲线图。
图5为实施例1所得的可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料(MOF-Gox-BNN6-CPO)的单线态氧自由基释放结果图。
图6为不同纳米材料对不同菌株的体外抑菌效果图。
图7为不同纳米材料对大鼠皮肤伤口细菌感染模型的抑菌作用与伤口愈合效果图。
图8为不同纳米材料对裸鼠皮下脓包感染模型的抑菌效果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明的试剂和原料若无特别说明，均可通过市购得到。
葡萄糖氧化酶Gox购于Sigma-Aldrich公司；氯过氧化物酶(CPO)从海洋真菌Caldariomyces fumago中直接分离的，浓度≥3000units/mL，购于Sigma-Aldrich公司；谷胱甘肽过氧化物酶购于Acmec公司；NO供体BNN6按照Shihua Li,Xiaorong Song etal.Light-Switchable Yolk-Mesoporous Shell UCNPs@MgSiO3 for Nitric Oxide-Evoked Multidrug Resistance Reversal in Cancer Therapy[J].ACS AppliedMaterials&Interfaces,2020,12,27:30066-30076.中记载的方法制备得到。
谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)溶液酶活：3000Units/mL；
氯过氧化物酶(CPO)溶液酶活：≥3000Units/mL
葡萄糖氧化酶(Gox)溶液酶活：3000Units/mL。
本发明可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料的制备过程及释放药物级联反应如图1所示。
实施例1：可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料的制备
(1)将60.1mg对苯二甲酸、61.1mg 2-氨基对苯二甲酸、67.6mg FeCl3·6H2O溶解于100mL的DMF中，充分溶解均匀后置于高压反应釜内，120℃烘箱反应12h，然后10000rpm离心10分钟，沉淀用乙醇(纯度>99％)洗涤三次，最后溶解到10mL PBS(0.01M，pH7.4；下同)缓冲液中，得到4mg/mL金属有机框架MOF材料溶液。
金属有机框架MOF材料的透射电镜图如图2所示，可见其形貌均一，粒径约为200nm；
(2)将步骤(1)得到的金属有机框架MOF材料溶液稀释至1mg/mL。取1mL 1mg/mL金属有机框架MOF材料溶液，加入12.5μL葡萄糖氧化酶Gox溶液(10mg/mL)，于磁力搅拌器上在150rpm转速下室温搅拌12h，得到混合溶液，将混合溶液10000rpm离心10分钟，沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，除去未负载的Gox，得到MOF-Gox复合材料；将MOF-Gox复合材料溶于超纯水中，制备1mg/mL的MOF-Gox复合材料溶液；
(3)将1mg的NO供体(N,N′-二仲丁基-N,N′-二亚硝基-1,4-苯二胺：BNN6)溶解到1mL的50％(v/v)乙醇中，得到1mg/mL的NO供体(BNN6)溶液。将1mL NO供体(BNN6)溶液加入到上述步骤(2)得到的1mL MOF-Gox复合材料溶液中，于磁力搅拌器上在150rpm转速下室温搅拌12h，得到混合溶液，将混合溶液10000rpm离心10分钟，沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，除去未负载的BNN6和乙醇，得到MOF-Gox-BNN6复合材料；将MOF-Gox-BNN6复合材料溶于超纯水中，制成MOF浓度为1mg/mL的MOF-Gox-BNN6复合材料混合溶液；
(4)在1mL步骤(3)得到的MOF-Gox-BNN6复合材料混合溶液中，加入8μL氯过氧化物酶CPO溶液，混合均匀，于磁力搅拌器上在150rpm转速下室温搅拌4h，得到混合溶液，将混合溶液10000rpm离心10分钟，沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，除去未负载的CPO，即得到可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料(MOF-Gox-BNN6-CPO)。
实施例2：可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料的制备
(1)将60.1mg对苯二甲酸、61.1mg 2-氨基对苯二甲酸、67.6mg FeCl3·6H2O溶解于100mL的DMF中，充分溶解均匀后置于高压反应釜内，120℃反应12h，然后10000rpm离心10分钟，沉淀用乙醇(纯度>99％)洗涤三次，最后溶解到10mL PBS缓冲液中，得到4mg/mL金属有机框架MOF材料溶液；
(2)将步骤(1)得到的金属有机框架MOF材料溶液稀释至1mg/mL。取1mL 1mg/mL金属有机框架MOF材料溶液，加入37.5μL葡萄糖氧化酶Gox溶液(10mg/mL)，于磁力搅拌器上在150rpm转速下室温搅拌12h，得到混合溶液，将混合溶液10000rpm离心10分钟，沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，除去未负载的Gox，得到MOF-Gox复合材料；将MOF-Gox复合材料溶于超纯水中，制备1mg/mL的MOF-Gox复合材料溶液；
(3)将1mg的NO供体(N,N′-二仲丁基-N,N′-二亚硝基-1,4-苯二胺：BNN6)溶解到1mL的50％(v/v)乙醇中，得到1mg/mL的NO供体(BNN6)溶液，将上述1mL NO供体(BNN6)溶液加入到上述步骤(2)得到的1mL MOF-Gox复合材料溶液中，于磁力搅拌器上在150rpm转速下室温搅拌12h，得到混合溶液，将混合溶液10000rpm离心10分钟，沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，除去未负载的BNN6和乙醇，得到MOF-Gox-BNN6复合材料；将MOF-Gox-BNN6复合材料溶于超纯水中，制成MOF浓度为1mg/mL的MOF-Gox-BNN6复合材料混合溶液；
(4)在1mL步骤(3)得到的MOF-Gox-BNN6复合材料混合溶液中，加入8μL氯过氧化物酶CPO溶液，混合均匀，于磁力搅拌器上在150rpm转速下室温搅拌4h，得到混合溶液，将混合溶液10000rpm离心10分钟，沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，除去未负载的CPO，即得到可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料(MOF-Gox-BNN6-CPO)。
实施例3：可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料的制备
(1)将60.1mg对苯二甲酸、61.1mg 2-氨基对苯二甲酸、67.6mg FeCl3·6H2O溶解于100mL的DMF中，充分溶解均匀后置于高压反应釜内，120℃反应12h，然后10000rpm离心10分钟，沉淀用乙醇(纯度>99％)洗涤三次，最后溶解到10mL PBS缓冲液中，得到4mg/mL金属有机框架MOF材料溶液；
(2)将步骤(1)得到的金属有机框架MOF材料溶液稀释至1mg/mL。取1mL 1mg/mL金属有机框架MOF材料溶液，加入12.5μL葡萄糖氧化酶Gox溶液(10mg/mL)，于磁力搅拌器上在150rpm转速下室温搅拌12h，得到混合溶液，将混合溶液10000rpm离心10分钟，沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，除去未负载的Gox，得到MOF-Gox复合材料；将MOF-Gox复合材料溶于超纯水中，制备1mg/mL的MOF-Gox复合材料溶液；
(3)将3mg的NO供体(N-亚硝胺)溶解到1mL的无水乙醇中，得到3mg/mL的NO供体(N-亚硝胺)溶液。将上述1mL NO供体(N-亚硝胺)溶液加入到上述步骤(2)得到的1mL MOF-Gox复合材料溶液中，于磁力搅拌器上在150rpm转速下室温搅拌12h，得到混合溶液，将混合溶液10000rpm离心10分钟，沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，除去未负载的N-亚硝胺和乙醇，得到MOF-Gox-N-亚硝胺复合材料；将MOF-Gox-N-亚硝胺复合材料溶于超纯水中，制成MOF浓度为1mg/mL的MOF-Gox-N-亚硝胺复合材料混合溶液；
(4)在1mL步骤(3)得到的MOF-Gox-N-亚硝胺复合材料混合溶液中，加入8μL氯过氧化物酶CPO溶液，混合均匀，于磁力搅拌器上在150rpm转速下室温搅拌4h，得到混合溶液，将混合溶液10000rpm离心10分钟，沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，除去未负载的CPO，即得到可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料(MOF-Gox-N-亚硝胺-CPO)。
实施例4：可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料的制备
(1)将60.1mg对苯二甲酸、61.1mg 2-氨基对苯二甲酸、67.6mg FeCl3·6H2O溶解于100mL的DMF中，充分溶解均匀后置于高压反应釜内，120℃反应12h，然后10000rpm离心10分钟，沉淀用乙醇(纯度>99％)洗涤三次，最后溶解到10mL PBS缓冲液(0.01M，pH 7.4；下同)中，得到4mg/mL金属有机框架MOF材料溶液；
(2)将步骤(1)得到的金属有机框架MOF材料溶液稀释至1mg/mL。取1mL 1mg/mL金属有机框架MOF材料溶液，加入12.5μL葡萄糖氧化酶Gox溶液(10mg/mL)，于磁力搅拌器上在150rpm转速下室温搅拌12h，得到混合溶液，将混合溶液10000rpm离心10分钟，沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，除去未负载的Gox，得到MOF-Gox复合材料；将MOF-Gox复合材料溶于超纯水中，制备1mg/mL的MOF-Gox复合材料溶液；
(3)将1mg的NO供体(N,N′-二仲丁基-N,N′-二亚硝基-1,4-苯二胺：BNN6)溶解到1mL的50％(v/v)乙醇中，得到1mg/mL的NO供体(BNN6)溶液，将上述1mL NO供体(BNN6)溶液加入到上述步骤(2)得到的1mL MOF-Gox复合材料溶液中，于磁力搅拌器上在150rpm转速下室温搅拌12h，得到混合溶液，将混合溶液10000rpm离心10分钟，沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，除去未负载的BNN6和乙醇，得到MOF-Gox-BNN6复合材料；将MOF-Gox-BNN6复合材料溶于超纯水中，制成MOF浓度为1mg/mL的MOF-Gox-BNN6复合材料混合溶液；
(4)在1mL步骤(3)得到的MOF-Gox-BNN6复合材料混合溶液中，加入10μL谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)溶液，混合均匀，于磁力搅拌器上在150rpm转速下室温搅拌12h，得到混合溶液，将混合溶液10000rpm离心10分钟，沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，除去未负载的GSH-Px，即得到可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料(MOF-Gox-BNN6-GSH-Px)。
实施例5：可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料的制备
(1)将60.1mg对苯二甲酸、61.1mg 2-氨基对苯二甲酸、67.6mg FeCl3·6H2O溶解于100mL的DMF中，充分溶解均匀后置于高压反应釜内，120℃反应12h。然后10000rpm离心10分钟，沉淀用乙醇(纯度>99％)洗涤三次，最后溶解到10mL PBS(0.01M，pH7.4；下同)缓冲液中，得到4mg/mL金属有机框架MOF材料；
(2)将步骤(1)得到的金属有机框架MOF材料溶液稀释至1mg/mL。取1mL 1mg/mL金属有机框架MOF材料溶液，加入12.5μL葡萄糖氧化酶Gox溶液(10mg/mL)，于磁力搅拌器上在150rpm转速下室温搅拌12h，得到混合溶液，将混合溶液10000rpm离心10分钟，沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，除去未负载的Gox，得到MOF-Gox复合材料；将MOF-Gox复合材料溶于超纯水中，制备1mg/mL的MOF-Gox复合材料溶液；
(3)将2mg的NO供体(N,N′-二仲丁基-N,N′-二亚硝基-1,4-苯二胺：BNN6)溶解到1mL的25％(v/v)乙醇中，得到2mg/mL的NO供体(BNN6)溶液，将上述1mL NO供体(BNN6)溶液加入到上述步骤(2)得到的1mL MOF-Gox复合材料溶液中，于磁力搅拌器上在150rpm转速下室温搅拌12h，得到混合溶液，将混合溶液10000rpm离心10分钟，沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，除去未负载的BNN6和乙醇，得到MOF-Gox-BNN6复合材料；将MOF-Gox-BNN6复合材料溶于超纯水中，制成MOF浓度为1mg/mL的MOF-Gox-BNN6复合材料混合溶液；
(4)在1mL步骤(3)得到的MOF-Gox-BNN6复合材料混合溶液中，加入8μL氯过氧化物酶(CPO)溶液，混合均匀，于磁力搅拌器上在150rpm转速下室温搅拌4h，得到混合溶液，将混合溶液10000rpm离心10分钟，沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，除去未负载的CPO，即得到可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料(MOF-Gox-BNN6-CPO)。
实施例6：可原位自催化产生过氧化氢并持续释放自由基的纳米复合材料的制备
(1)将60.1mg对苯二甲酸、61.1mg 2-氨基对苯二甲酸、67.6mg FeCl3·6H2O溶解于100mL的DMF中，充分溶解均匀后置于高压反应釜内，120℃反应12h。然后10000rpm离心10分钟，沉淀用乙醇(纯度>99％)洗涤三次，最后溶解到10mL PBS(0.01M，pH 7.4)缓冲液中，得到4mg/mL金属有机框架MOF材料溶液；
(2)将步骤(1)得到的金属有机框架MOF材料溶液稀释至1mg/mL。取1mL 1mg/mL金属有机框架MOF材料溶液，加入12.5μL葡萄糖氧化酶Gox溶液(10mg/mL)，于磁力搅拌器上在150rpm转速下室温搅拌12h，得到混合溶液，将混合溶液10000rpm离心10分钟，沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，除去未负载的Gox，得到MOF-Gox复合材料；将MOF-Gox复合材料溶于超纯水中，制备1mg/mL的MOF-Gox复合材料溶液；
(3)在1mL步骤(2)得到的MOF-Gox复合材料溶液中，加入8μL氯过氧化物酶(CPO)溶液，混合均匀，于磁力搅拌器上在150rpm转速下室温搅拌4h，得到混合溶液，将混合溶液10000rpm离心10分钟，沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，除去未负载的CPO，即得到可原位自催化产生过氧化氢并持续释放自由基的纳米复合材料(MOF-Gox-CPO)。
实施例7：实施例2制得的可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料的过氧化氢产生性能测试
实施例2制备的可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料成功负载葡萄糖氧化酶Gox，理论上在葡萄糖底物存在条件下Gox可将其持续催化产生过氧化氢，生成的H2O2可用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)进行检测，呈现蓝色显色反应。具体操作如下：配置10mM TMB的DMSO母液。在总体积为1mL的超纯水体系中依次加入100μL 10mMTMB的DMSO母液，50μL可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料(1mg/mL)，不同体积的葡萄糖溶液至葡萄糖终浓度分别为0μM、1.5μM、2.5μM、5μM，最后加入超纯水，混合均匀，1小时后用紫外分光光度计检测其吸收峰值。
结果如图3所示，可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料在葡萄糖存在下可使TMB发生蓝色显色反应，且呈葡萄糖浓度依赖性，说明得到的可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料成功负载Gox，并可原位催化葡萄糖产生充足的H2O2。
实施例8：实施例5制得的可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料的NO释放性能测试
实施例5制备的可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料(MOF-Gox-BNN6-CPO)成功负载葡萄糖氧化酶Gox和NO前体药物BNN6，理论上在葡萄糖底物存在条件下Gox可将其持续催化产生H2O2，H2O2可进一步促进BNN6释放NO。释放的NO可用格里斯试剂检测，具体操作如下：1mg/mL可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料(MOF-Gox-BNN6-CPO)溶液与格里斯试剂按体积比1:1混合，添加葡萄糖溶液至葡萄糖终浓度为2.5μM，避光混合反应15min后，每隔五分钟用紫外分光光度计测定其在540nm处的吸光度，并利用NO标准曲线计算出NO的累计释放量。
结果如图4所示，无葡萄糖存在时可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料无明显的NO的释放，在葡萄糖加入后NO释放速度明显加快，可见葡萄糖加入后产生的H2O2对NO的控释效果明显，根据一氧化氮检测试剂盒(购于上海碧云天生物技术有限公司)说明书绘制标准曲线，计算可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料的NO最大释放量为3.87μM/mg。
实施例9：实施例1制得的可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料的自由基释放性能测试
单线态氧1O2是具有很强活性的氧自由基，具细胞毒性作用，与多种疾病的发生有关，以细胞膜、线粒体等部位对其最为敏感。次氯酸根离子可与过氧化氢反应产生单线态氧自由基1O2，SOSG单线态氧荧光探针可高度选择性结合1O2，在530nm处发射绿色荧光，可用荧光分光光度计检测。取10μL 1mg/mL实施例1制备的可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料(MOF-Gox-BNN6-CPO)溶液加入葡萄糖溶液使葡萄糖终浓度为2.5μM，加入190μL SOSG单线态氧荧光探针(工作浓度10μM)，15分钟后用荧光分光光度计检测其荧光强度。不加葡萄糖的可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料(MOF-Gox-BNN6-CPO)组作为对照。
实验结果如图5所示，在无葡萄糖添加的情况下，可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料(MOF-Gox-BNN6-CPO)没有明显的1O2生成；而当葡萄糖加入后，可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料(MOF-Gox-BNN6-CPO)在530nm处的荧光强度明显升高，表明有1O2的生成。这说明可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料(MOF-Gox-BNN6-CPO)可释放大量的单线态氧自由基1O2。
实施例10：实施例1制得的可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料的酶活稳定性研究
氯过氧化物酶(CPO)可催化氯化一氯二甲酮(MCD)转化为二氯二甲酮(DCD)。MCD在278nm处有明显的紫外吸收峰，而DCD则无吸收峰，CPO将MCD转化为DCD后，278nm处的紫外吸收值会发生下降，因此我们可通过检测278nm处的紫外吸收值判断MOF-Gox-BNN6-CPO的催化活性。将实施例1制得的MOF-Gox-BNN6-CPO制成1mg/mL的MOF-Gox-BNN6-CPO溶液，放置于4℃冰箱，每隔4小时在1mL磷酸盐缓冲液(0.1M，pH＝2.75)体系中依次加入氯化钾溶液至氯化钾终浓度20mM，过氧化氢溶液至过氧化氢终浓度2mM，MCD溶液至MCD终浓度0.1mM，2μL1mg/mL MOF-Gox-BNN6-CPO溶液，得到混合溶液；用紫外分光光度计检测混合溶液在278nm处紫外吸收峰值的变化。同时以等量CPO溶液替换MOF-Gox-BNN6-CPO溶液进行上述实验作为对照组。
结果发现，直至24h时，含有MOF-Gox-BNN6-CPO的混合溶液与含有CPO的混合溶液在278nm处的紫外吸收峰值降低趋势基本相同，说明24h内，MOF-Gox-BNN6-CPO与CPO的催化活性基本相同，可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料能够保持其中过氧化物酶的酶活稳定性。
实施例11：实施例1制得的可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料的体外抗菌活性研究
选取革兰氏阳性菌代表金黄色葡萄球菌S.aureus(ATCC 29213)、多重耐药性金黄色葡萄球菌MRSA(ATCC F-182)和革兰氏阴性菌代表大肠杆菌E.coli(ATCC 25922)为模型，分别将其在TSB培养基和LB培养基中复苏并培养至对数期状态，离心去除培养基后重悬于PBS缓冲液(0.01M，pH 7.4)中，调节细菌浓度为1×107CFU/mL。
将上述各细菌分别接种于24孔板中，然后加入葡萄糖溶液至终浓度2.5μM，同时加入终浓度为50μg/mL的MOF-Gox-BNN6-CPO复合材料，置于37℃恒温摇床中振荡孵育5h经离心洗涤和梯度稀释后涂布于提前准备好的无菌LB固体培养基平板上。然后，置于37℃恒温培养箱中静止培养过夜，利用相机对平板进行拍照并计算细菌菌落数，评价实施例1制得的可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料(MOF-Gox-BNN6-CPO)对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的协同抑制效果。相同条件下，PBS缓冲液处理组、实施例1制得的金属有机框架MOF材料处理组、实施例1制得的MOF-Gox复合材料处理组、实施例1制得的MOF-Gox-BNN6复合材料处理组、实施例6制备的MOF-Gox-CPO处理组作为对照组。
实验结果如图6所示，该MOF-Gox-BNN6-CPO纳米复合材料相比于其他对照组，三种细菌的细菌数量明显减少，表现出明显的光谱杀菌效果，这说明NO/次氯酸的联合作用相比单一的NO疗法或次氯酸疗法，具有更加显著的体外杀菌作用。
实施例12：实施例1制得的可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料细菌伤口感染大鼠模型体内抗菌活性研究
构建大鼠皮肤伤口细菌感染模型，评价可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料对大鼠伤口的抗菌及修复功能。本实验选用SPF级SD大鼠(雄性；平均体重200g；购于广东省实验动物中心)进行实验。在进行实验前，所有的大鼠需要在动物房饲养观察7天，进行体重，尿液、粪便等指标测试，指标合格后再进行动物实验。大鼠皮肤伤口感染模型建立步骤具体如下：使用10％水合氯醛腹腔注射(30mg/Kg)进行全身麻醉，然后将大鼠以背部脊骨为中心轴剃出一块手术区域，涂抹脱毛膏进行深层除毛处理，并进行消毒。使用取孔器在大鼠背部取直径约为15mm的孔，将真皮层切除后滴加150μL浓度为108CFU/mL的多重耐药性金黄色葡萄球菌MRSA细菌菌液，饲养2天后观察并使用细菌琼脂板确定伤口感染情况。MOF-Gox-BNN6-CPO纳米复合材料组：将MOF-Gox-BNN6-CPO纳米复合材料涂在大鼠伤口处，每2天给药处理，共处理14天。在持续性给药过程中，使用测量尺对给药后的第0天、1天、4天、7天和10天各组大鼠背部感染伤口直径进行测量并使用数码相机进行伤口跟踪记录。并于第0天、1天、4天、7天取相同体积的大鼠背部感染伤口的渗出液PBS缓冲液(0.01M，pH7.4；下同)稀释100倍后使用LB琼脂板进行检测并进行细菌菌落数定量计算，跟踪记录各组大鼠背部伤口细菌数量。相同条件下，PBS缓冲液处理组、实施例1制得的金属有机框架MOF材料处理组、实施例1制得的MOF-Gox复合材料处理组、实施例1制得的MOF-Gox-BNN6复合材料处理组、实施例6制得的MOF-Gox-CPO处理组作为对照组。
实验结果如图7所示，在未治疗之前可以清楚看到大鼠伤口感染处出现黄色脓水和组织水肿，在对各个伤口持续给药7天后，观察伤口恢复的整个过程，与单一的NO治疗MOF-Gox-BNN6复合材料处理组或次氯酸治疗MOF-Gox-CPO处理组的伤口相比较发现，经过NO/次氯酸联合治疗的MOF-Gox-BNN6-CPO组大鼠伤口处浓痂明显减小，伤口愈合率达到90％左右，这说明次氯酸/NO的联合作用相比单一的NO疗法或次氯酸疗法，具有更加显著的抑菌作用与伤口愈合效果，可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料(MOF-Gox-BNN6-CPO)有望成为一种新型的抗菌材料。
实施例13：实施例1制得的可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料裸鼠皮下脓包感染模型体内抗菌活性研究
构建裸鼠皮下脓包感染模型，评价可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料(MOF-Gox-BNN6-CPO)对其脓包的治疗效果。本实验选用SPF级BALB/C裸鼠(雄性；购于广东省实验动物中心)进行实验。在进行实验前，所有的裸鼠需要在动物房饲养观察7天，进行体重、尿液、粪便等指标测试，指标合格后再进行动物实验。裸鼠皮下脓包感染模型建立步骤具体如下：取150μL浓度为108CFU/mL的多重耐药性金黄色葡萄球菌MRSA细菌菌液，加入葡萄糖溶液使葡萄糖终浓度为2.5μM，然后分别与50μg/mL的PBS缓冲液、实施例1制得的金属有机框架MOF材料、实施例1制得的MOF-Gox复合材料、实施例1制得的MOF-Gox-BNN6复合材料、实施例6制得的MOF-Gox-CPO材料和实施例1制得的MOF-Gox-BNN6-CPO复合材料混合，37℃孵育5小时，之后将细菌菌液在裸鼠的左侧腋下部位进行皮下注射，之后每天观察裸鼠皮下脓包感染情况。
实验结果如图8所示，10天后，与单一的NO治疗MOF-Gox-BNN6复合材料处理组或次氯酸治疗MOF-Gox-CPO处理组的脓包相比较发现，经过可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料MOF-Gox-BNN6-CPO组NO/次氯酸联合治疗的裸鼠皮下未见明显脓包，可见次氯酸/NO的联合作用相比单一的NO疗法或次氯酸疗法，具有更加优异的抑菌作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将对苯二甲酸、2-氨基对苯二甲酸、FeCl3·6H2O溶解于有机溶剂中，高温反应，离心后洗涤沉淀，溶解，得到金属有机框架MOF材料溶液；
（2）将葡萄糖氧化酶溶液加入步骤（1）得到的金属有机框架MOF材料溶液中，搅拌反应，离心后洗涤沉淀，溶解，得到MOF-Gox复合材料溶液；
（3）将NO供体溶液加入到上述步骤（2）得到的MOF-Gox复合材料溶液中，搅拌反应，离心后洗涤沉淀，溶解，得到MOF-Gox-NO供体复合材料混合溶液；
（4）在步骤（3）得到的MOF-Gox-NO供体复合材料混合溶液中，加入自由基前体药物过氧化物酶溶液，搅拌反应，离心后洗涤沉淀，即得到可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料；
步骤（3）中，所述的NO供体为N,N´-二仲丁基-N,N´-二亚硝基-1,4-苯二胺、N-亚硝胺、金属-NO络合物、罗森黑盐和双-氮-亚硝基化合物中的至少一种；
步骤（4）中，所述的过氧化物酶为髓过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶和氯过氧化物酶中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的金属有机框架MOF材料与葡萄糖氧化酶按质量比1:0.125～0.375计算。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
步骤（3）中，所述的NO供体与MOF-Gox复合材料按质量比1～3:1计算。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
步骤（1）中，所述的对苯二甲酸、2-氨基对苯二甲酸和FeCl3·6H2O按质量比55～65:55～65:60～70。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
步骤（1）中，所述的有机溶剂为DMF和N-甲基吡咯烷酮中的至少一种；
步骤（1）中，所述的对苯二甲酸与有机溶剂按质量体积mg:mL比55～65:100计算；
步骤（1）中，所述的高温反应的条件为100～140℃反应10～14h；
步骤（1）、（2）、（3）、（4）中，所述的离心的条件为500～12000rpm离心5～15min。
6.一种可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料，其特征在于，通过权利要求1～5任一所述的制备方法制备得到。
7.权利要求6所述的可原位自催化产生过氧化氢并持续释放NO和自由基的纳米复合材料在制备生物医学药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的生物医学药物为抗菌药物；
所述的菌为金黄色葡萄球菌S. aureus、多重耐药性金黄色葡萄球菌MRSA和革兰氏阴性菌代表大肠杆菌E. coli中的至少一种。
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