CN111991557A - 一种光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于抗菌药物领域,公开了一种光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料的制备方法及其应用,材料简称为WS2QDs‑Van@lipo,其中WS2QDs为硫化钨量子点,Van为万古霉素,lipo为脂质体。首先,将二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇‑羟基溶解在三氯甲烷中,并通过真空干燥以产生脂质薄膜;随后,加入含有WS2QDs和Van的PBS中,水化形成薄膜;最后,涡旋振荡后超声处理,离心纯化得到WS2QDs‑Van@lipo复合材料。本发明将能够作为抗菌试剂,通过光控在目标部位精准释放,减少抗生素使用量和生物体的系统毒性,并且对大肠杆菌和耐万古霉素的金黄色葡萄球菌的活力均有较好的抑制作用,可为治疗难治性耐药菌提供一种安全有效的解决方案。
Description
技术领域
本发明涉及抗菌试剂,尤其涉及一种光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料的制备方法,以及作为抗菌试剂的应用,属于生物医药材料制备领域。
背景技术
滥用抗生素会导致耐药细菌的出现,并威胁公众健康。目前,万古霉素是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的首选治疗药物,但是由于抗生素的过度使用已导致耐万古霉素的金黄色葡萄球菌菌株(Mu50)的出现。由于耐万古霉素的金黄色葡萄球菌逃避了宿主的免疫监视,并导致临床上持续的慢性感染,并通常难以治疗。因此,设计一种新颖的抗菌策略至关重要。该策略应具有高协同抗菌功效,可以以最小的抗生素剂量与抑制耐药菌活性,从而减轻耐药菌耐药性的进化并减轻毒副作用。
纳米材料的迅速发展,特别是基于智能纳米颗粒的可控药物释放系统,为抗菌提供了新的策略。因为具有强组织穿透力和低副作用的优点,近红外光是一种很好的控制药物释放的外部刺激条件。这些智能抗菌系统可以克服细菌对抗生素的耐药性,增强抗菌效果并控制药物的释放。据报道,硫化钨量子点(WS2QDs)属于过渡金属二卤化物纳米材料,在近红外光照射下可产生较高热量,并具有良好的生物相容性和出色的肾脏清除率,可用于癌症治疗。具有类芬顿反应活性的纳米材料可以将过氧化氢(H2O2)转化为有毒的羟自由基,从而杀伤肿瘤细胞或细菌,此方法称为化学动力学疗法(CDT)。但是,高芬顿反应速率需要强酸条件,这限制了CDT在生物体中的应用。因此,我们希望找到一种在弱酸性或中性环境下仍具有较高类芬顿反应速率的纳米材料。此外,肿瘤和感染部位的微环境呈酸性,厌氧糖酵解还会导致微环境过氧化氢和谷胱甘肽(GSH)水平异常。可以消耗 GSH的纳米材料可以通过减少GSH对ROS的清除提高CDT疗效。由于多价金属离子的催化反应,一些基于金属元素的纳米颗粒,如氧化铁纳米颗粒、铜/碳杂化纳米球、Cu-TCPP纳米片、氧化钒纳米点、硫化钼纳米颗粒和ZIF-67等都能表现出类芬顿反应活性来抗菌。此外,由于WS2和MoS2之间的相似性以及钨离子的多价态,我们推测 WS2QDs具有类芬顿反应活性及消耗GSH的特性,以进行抗菌治疗。综上所述,我们认为WS2QDs可作为一种出色的光热试剂,协同抗菌疗法用于控制药物的释放。
针对以上问题,本发明制备了一种智能光控释放可协同光热/化学动力学/药物治疗的纳米颗粒。该发明使用热敏脂质体包裹WS2QDs 和抗生素万古霉素。因为WS2QDs具有有类芬顿反应的活性,所以在低浓度H2O2的情况下具有良好的CDT疗效;且由于WS2QDs具有出色的消耗GSH的活性,进一步降低细菌的抗氧化能力并提高CDT效率。此外,WS2QDs的光热效应在杀菌的同时并有促进提高CDT效率。产生的热量,使热敏脂质体被破坏并释放万古霉素协同消除细菌。体内实验表明,该纳米颗粒可以在近红外(NIR)照射下和低浓度的 H2O2有效治愈耐万古霉素的金黄色葡萄球菌Mu50引起的皮肤脓肿。综上,发明一种智能光控释放可协同光热/化学动力学/药物治疗的纳米颗粒的制备方法及其应用很有必要。
发明内容
本发明提出的一种光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料的制备方法及其应用。
为了实现上述目的,本发明采用了如下技术方案:
一种光控释放WS2QDs和万古霉素的脂质体复合材料的制备方法,具体制备方法包括以下步骤:
步骤一:将二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羟基按照20:10:1的摩尔比溶于三氯甲烷中,并采用超声辅助溶解后倒入反应容器中,随后通过真空干燥30分钟,在反应容器内壁得到脂质薄膜;
步骤二:将WS2QDs和万古霉素溶解于PBS缓冲液中,随后将含有硫化钨量子点和万古霉素的PBS缓冲液加入含有脂质薄膜的反应容器内,得到水合溶液;
步骤三:所得水合溶液,在45℃温度下涡旋振荡1小时,然后超声处理,超声功率设置为60W,超声时间为5分钟,最后离心并用交联葡聚糖凝胶层析柱纯化得到可光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料,即WS2QDs-Van@lipo纳米颗粒。
优选的方案,所述的一种光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料的制备方法,步骤一中制备过程中物料的取量的摩尔比为DPPC:胆固醇:DSPE-PEG-OH=20:10:1。
优选的方案,所述的一种光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料的制备方法,步骤二中涡旋震荡温度为45℃,时间为1 小时。
优选的方案,所述的一种光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料的制备方法,步骤三中超声功率设置为60W,超声时间为5分钟。
优选的方案,所述的一种光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料的制备方法,步骤三中的纯化方法离心并用交联葡聚糖凝胶层析柱纯化。
优选的方案,所述的一种光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料,即WS2QDs-Van@lipo纳米颗粒的最终使用浓度 WS2QDs为50μg/mL,万古霉素为0.77μg/mL。
优选的方案,所述的一种光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料可在近红外光照下释放硫化钨量子点和万古霉素。
优选的方案,所述的一种光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料,在近红外光照和低剂量H2O2条件下,具有广谱的抗菌活性,细菌包括但不限于大肠杆菌和耐万古霉素的金黄色葡萄球菌。
优选的方案,所述的一种光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料,在近红外光照和低剂量H2O2条件下,有效治愈细菌感染引起的皮肤脓肿,包括但不限于耐万古霉素的金黄色葡萄球菌 Mu50引起的皮肤脓肿。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明通过WS2QDs和万古霉素为原料进行制备包载WS2QDs 和万古霉素的热敏脂质体WS2QDs-Van@lipo,可以在近红外(NIR) 照射下精准释放药物并减少抗生素使用剂量,该纳米材料可以协同光热、化学动力学和药物治疗,对革兰氏阳性菌Mu50,革兰氏阴性菌大肠杆菌具有明显的光谱抗菌效果并可以抑制生物膜;在Mu50诱导的皮下脓肿小鼠模型中,验证了WS2QDs-Van@lipo可以消灭细菌,促进感染部位的康复且同时具有较低的系统毒性。
附图说明
图1为本发明提出的WS2QDs-Van@lipo的合成示意图;
图2为WS2QDs-Van@lipo低温电子显微镜表征示意图;
图3为WS2QDs-Van@lipo平均粒径示意图;
图4为WS2QDs-Van@lipo表面Zeta电位示意图;
图5为808nm激光(1W/cm2,10分钟)照射下,不同浓度的 WS2QDs-Van@lipo溶液的温度变化示意图;
图6为WS2QDs-Van@lipo的光热稳定性示意图,在WS2QDs-Van@lipo溶液的循环加热过程中进行了六个开/关循环;
图7为WS2QDs具有浓度依赖性的类芬顿反应活性示意图,其中亚甲基蓝(MB)为10μg/mL、H2O2为10mM;
图8为WS2QDs(50μg/mL),MB(10μg/mL)和H2O2(10mM) 的温度依赖性类芬顿反应活性示意图;
图9为WS2QDs(50μg/mL),MB(10μg/mL)和H2O2(10mM) 的不同pH下类芬顿反应活性示意图;
图10为用不同浓度的WS2QDs处理2小时或4小时后的GSH 消耗示意图;
图11为不同温度水浴下用WS2QDs(50μg/mL)处理后的GSH 消耗示意图;
图12为Mu50经过不同处理后形成的细菌菌落的琼脂平板照片;
图13为大肠杆菌(E.coli)经过不同处理后形成的细菌菌落的琼脂平板照片;
图14为在死活染色实验中Mu50在不同处理后的相对荧光强度统计图;
图15为在死活染色实验中E.coli在不同处理后的相对荧光强度统计图;
图16为不同组处理的Mu50扫描电镜图;
图17为不同组处理的大肠杆菌扫描电镜图;
图18为形成Mu50感染的脓肿的小鼠进行不同处理后12天内脓肿变化的照片;
图19为从不同治疗组的小鼠感染脓肿中分离出的细菌的琼脂平板菌落的统计图;
图20为小鼠皮肤组织的H&E染色示意图;
图21为不同治疗组小鼠的体重变化统计图;
图22为小鼠主要器官的H&E染色示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。
实施例一:
一种光控释放WS2QDs和万古霉素的脂质体复合材料的制备方法,具体制备方法包括以下步骤:
步骤一:将二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羟基按照20:10:1的摩尔比溶于三氯甲烷中,并采用超声辅助溶解,随后通过真空干燥30分钟,在反应容器内壁得到脂质薄膜;
步骤二:将硫化钨量子点和万古霉素溶解于PBS缓冲液中,随后将含有硫化钨量子点和万古霉素的PBS缓冲液加入含有脂质薄膜的反应容器内,在45℃温度下涡旋振荡1小时,得到水合溶液;
步骤三:所得水合溶液用超声处理,超声功率为60W,超声时间为5分钟,最后离心并用交联葡聚糖凝胶层析柱纯化,得到可光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料,即 WS2QDs-Van@lipo纳米颗粒。
实施例二:
本发明还提供了一种光控释放WS2QDs和万古霉素的脂质体复合材料的应用,将实施例一中制得的方法制备出一种光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料,即WS2QDs-Van@lipo。
该抗菌复合材料的应用,光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料,在近红外光照和低剂量H2O2条件下,具有广谱的抗菌活性,细菌包括但不限于大肠杆菌和耐万古霉素的金黄色葡萄球菌。
该抗菌复合材料的应用,光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料,在近红外光照和低剂量H2O2条件下,有效治愈细菌感染引起的皮肤脓肿,包括但不限于耐万古霉素的金黄色葡萄球菌 Mu50引起的皮肤脓肿。
实施例三:
参照说明书附图1-4所示:
在对光控释放WS2QDs和万古霉素的脂质体复合材料的制备过程中,制备了WS2QDs-Van@lipo;使用低温电子显微镜表征了 WS2QDs-Van@lipo的形貌和尺寸,发现这种纳米颗粒为均匀的球形,平均尺寸小于100nm;
随后对WS2QDs-Van@lipo进行水合粒径(DLS)测量, WS2QDs-Van@lipo测得的平均粒径约为146.37±0.67nm;
对WS2QDs-Van@lipo进行Zeta电势测量,WS2QDs-Van@lipo 测得的表面Zeta电位分别为-35.4mV,这些结果证实了设计的 WS2QDs-Van@lipo纳米材料的成功合成。
实施例四:
参照说明书附图5-11,对WS2QDs-Van@lipo光热效应及类芬顿反应活性进行检测。WS2QDs-Van@lipo在近红外光下产生热量通过光热疗法杀伤细菌。WS2QDs的类芬顿反应活性可以将过氧化氢转化为游离的氢氧根离子,通过化学动力学疗法破坏杀伤细菌。WS2QDs 氧化谷胱甘肽的活性可以减少破坏细菌的氧化还原平衡,增强化学动力学疗法的效果,具体检测结果如下:
参照图5,用808nm激光(1W/cm2,10分钟)照射不同浓度的 WS2QDs-Van@lipo溶液的温度变化曲线直接显示了它们的光热性能; WS2QDs-Van@lipo溶液的温度在暴露于NIR辐射后立即升高,而PBS 的温度升高几乎没有变化;这说明在NIR照射下50μg/mL WS2QDs-Van@lipo溶液的温度升高足以改变热敏脂质体以释放内部药物;
参照图6,为评估WS2QDs-Van@lipo的光热稳定性,在 WS2QDs-Van@lipo溶液的循环加热过程中进行了六个开/关循环,未观察到明显的温度变化,表明WS2QDs-Van@lipo具有出色的光热稳定性;
参照图7、图8、图9,MB降解的结果显示,WS2QDs将H2O2催化为·OH,这取决于WS2QDs的浓度;进一步检测了温度对WS2QDs 的类芬顿反应活性的影响,结果显示MB的降解随着温度的升高而增加,这表明高温有利于WS2QDs的类芬顿反应活性;进一步检测了 pH对WS2QDs的类芬顿反应活性的影响,结果WS2QDs的类芬顿反应活性在中性或弱酸性环境就有很高的反应效率,这表明WS2QDs 有在生物体内环境应用的潜力。
参照图10、图11,WS2QDs的氧化谷胱甘肽活性与时间和浓度有关;随着温度的升高,谷胱甘肽的消耗增加;
综上所述,WS2QDs-Van@lipo的光热效应可以在近红外光下产生热量,有光热疗法杀伤细菌的潜力;WS2QDs的类芬顿反应活性可以将过氧化氢转化为游离的氢氧根离子,有通过化学动力学疗法破坏杀伤细菌的潜力;WS2QDs氧化谷胱甘肽的活性有减少破坏细菌的氧化还原平衡,增强化学动力学疗法的潜力;WS2QDs-Van@lipo的光热效应有增强WS2QDs的类芬顿反应活性和氧化谷胱甘肽活性的效果。WS2QDs光热效应、类芬顿反应活性和氧化谷胱甘肽活性协同杀伤细菌的潜力。
实施例五:
参照说明书附图12-17,体外实验用Mu50和E.coli评估 WS2QDs-Van@lipo的抗菌能力。具体检测结果如下:
参照图12、图13,通过琼脂平板计数法对纳米颗粒的抗菌能力进行了检测,结果显示在WS2QDs-Van@lipo+H2O2组中,用NIR激光照射后几乎没有观察到细菌菌落,Mu50和E.coli的相对细菌活力分别为0.16%和4.73%;
参照图14、图15,在SYTO 9/PI双重染色检测试验中,相对荧光强度显示出在Mu50和E.coli两种细菌菌株中WS2QDs-Van@lipo+ H2O2+NIR,PI将死细菌的DNA标记为红色荧光信号最多,说明抗菌效果最强;
参照图16、图17,扫描电镜检测显示了两种细菌菌株的形态变化,结果表明WS2QDs-Van@lipo+H2O2+NIR处理的Mu50的一小部分细菌被破坏;形态损害最多的是E.coli,几乎所有细菌膜均被裂解。
这些结果表明,我们制备的WS2QDs-Van@lipo在近红外光照下具有抗菌作用,且与低浓度的H2O2联用有更强的抗菌作用,克服细菌的耐药性。
实施例六:
参照说明书附图18-22,建立小鼠局部皮下注射Mu50引发的皮下脓肿模型,进一步评估纳米材料WS2QDs-Van@lipo体内抗菌效果,并对其毒性进行评估。
参照图18,结果显示WS2QDs-Van@lipo+H2O2+NIR治疗组的愈合过程明显好于其他组中,随着时间的增加,疤痕的大小逐渐减小,表明皮下脓肿得到抑制,伤口基本愈合;
参照图19,将来自皮肤脓肿的细菌悬浮液分散在固体培养基上进一步评估杀菌效率,结果显示WS2QDs-Van@lipo+H2O2+NIR治疗组几乎没有菌落;
参照图20,H&E染色进一步评估感染皮肤组织的恢复情况,结果显示WS2QDs-Van@lipo+H2O2+NIR治疗组的皮肤组织显示出新的毛囊,炎症细胞明显减少;
参照图21,用WS2QDs-Van@lipo+H2O2+NIR治疗组的小鼠的体重增加率与PBS治疗的小鼠相似,表明纳米颗粒对体内毒性的影响可忽略不计;
参照图22,H&E染色结果表明WS2QDs-Van@lipo对主要器官 (心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)没有明显的系统毒性。
这些结果表明,我们制备的WS2QDs-Van@lipo具有显着抗菌作用,并无明显系统毒性;
综上所述,WS2QDs-Van@lipo有望成为一种智能光控释放可协同光热/化学动力学/药物治疗的纳米抗菌药物,具有抗菌作用, WS2QDs-Van@lipo在抗菌治疗中对正常组织具无明显的副作用。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料的制备方法,其特征在于,具体制备方法包括以下步骤:
步骤一:将二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羟基(DSPE-PEG-OH)按照20:10:1的摩尔比溶于三氯甲烷中,并采用超声辅助溶解后倒入反应容器中,随后通过真空干燥30分钟,在反应容器内壁得到脂质薄膜;
步骤二:将硫化钨量子点和万古霉素溶解悬浮于PBS缓冲液中,随后将含有硫化钨量子点和万古霉素的PBS缓冲液加入含有脂质薄膜的反应容器内,在45℃温度下涡旋振荡1小时,得到水合溶液;
步骤三:所得水合溶液用超声处理,超声功率设置为60W,超声时间为5分钟,最后离心并用交联葡聚糖凝胶层析柱纯化得到可光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料,即WS2QDs-Van@lipo纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的一种光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料的制备方法,其特征在于,所述步骤一中制备过程中物料的取量的摩尔比为DPPC:胆固醇:DSPE-PEG-OH=20:10:1。
3.根据权利要求1所述的一种光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料的制备方法,其特征在于,所述步骤二中涡旋震荡温度为45℃,时间为1小时。
4.根据权利要求1所述的一种光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料的制备方法,其特征在于,所述步骤三中超声功率设置为60W,超声时间为5分钟。
5.根据权利要求1所述的一种光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料的制备方法,其特征在于,所述步骤三中的纯化方法离心并用交联葡聚糖凝胶层析柱纯化。
6.根据权利要求1所述的一种光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料的制备方法,其特征在于,所述WS2QDs-Van@lipo纳米颗粒的最终使用浓度WS2QDs为50μg/mL,万古霉素为0.77μg/mL。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的一种光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料的应用,其特征在于,所述脂质体复合材料可在近红外光照下释放硫化钨量子点和万古霉素。
8.根据权利要求7所述的一种光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料的应用,其特征在于,所述光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合纳米材料,在近红外光照和低剂量H2O2条件下,抑制大肠杆菌和耐万古霉素的金黄色葡萄球菌的活性。
9.根据权利要求7所述的一种光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料的应用,其特征在于,所述光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合纳米材料,在近红外光照和低剂量H2O2条件下,有效治愈耐万古霉素的金黄色葡萄球菌Mu50引起的皮肤脓肿。
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2020
- 2020-09-02 CN CN202010907422.2A patent/CN111991557A/zh active Pending
Patent Citations (1)
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