CN113350376B - 一种抗菌金属纳米酶OA-MnO2的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于金属纳米材料技术领域，具体公开了一种抗菌金属纳米酶OA‑MnO2的制备方法和应用。通过油酸(OA)纳米乳液模板法一锅合成二氧化锰(OA‑MnO2)纳米酶。其具有良好的氧化物酶活性，能够产生活性氧(ROS),导致微生物细胞损伤，从而有效杀灭革兰氏阳性(金黄色葡萄球菌)和阴性(大肠杆菌)菌株，而且对金黄色葡萄球菌具有良好的生物膜预防和破坏能力。本发明制备的抗菌金属纳米酶OA‑MnO2在生理条件下表现出较高的稳定性和生物相容性，在体内抗菌性能上优于万古霉素，是对抗细菌感染和促进伤口愈合的安全有效工具。

Description

一种抗菌金属纳米酶OA-MnO2的制备方法和应用
技术领域
本发明属于金属纳米材料技术领域，具体涉及一种抗菌金属纳米酶 OA-MnO2的制备方法和应用。
背景技术
天然酶在温和的条件下具有较强的催化活性，存在于生物体生命活动的各个过程，如：三羧酸循环，糖酵解，脂质、蛋白质和氨基酸的合成与代谢等，大部分天然酶的主要成分是蛋白质，对反应环境要求严格，过酸过碱，过冷过热的环境下蛋白质均容易变性，酶的催化活性也因此丧失。由此产生了人工模拟酶，金属纳米酶便是其中一种。
纳米酶是一种能够催化生物底物的纳米材料，其反应动力学与天然酶相似。近年来，纳米酶杀灭细菌的应用越来越广泛。例如，V2O5纳米线和CeO2基纳米棒具有类似卤过氧化物酶的活性，它们能够产生低卤酸来破坏微生物群体感应，最终抑制细菌生物膜。具有氧化酶活性的Co4S3/Co(OH)2杂化纳米管可以产生超氧阴离子自由基来抑制多个细菌菌株的生长。此外，石墨烯量子点和MoS2纳米粒子已被证明具有过氧化物酶活性，并被用于催化H2O2生成羟基自由基用于伤口消毒。这些研究在抑菌方面显示了良好的作用，对现代社会人类大健康事业的发展起到了积极的推动作用。
虽然纳米酶已经取得了巨大的进展，但是催化活性低，稳定性差等限制了纳米材料人工模拟酶的发展，稳定性差主要是因为纳米粒分布不均匀，容易聚集，催化活性低主要是对催化环境有一定的要求，例如：纳米金只有在碱性条件下，才表现出固有的类过氧化氢酶催化活性，而细菌感染部位微环境为弱酸性。此外制备稳定的纳米材料往往需要相对复杂的步骤，这些都限制了纳米酶在医学科学中的进一步应用。
发明内容
为了制备稳定的MnO2纳米酶，本发明采用油酸纳米乳液模板法，合成了 OA-MnO2抗菌金属纳米酶，本发明制备的抗菌金属纳米酶具有良好的氧化物酶活性，在抑菌、杀菌领域均有广泛的应用前景。
抗菌金属纳米酶OA-MnO2的制备方法，步骤如下：
(1)将200μL油酸溶于7mL无水乙醇，快速注入60℃水浴加热的超纯水中剧烈搅拌，制得油酸纳米乳液；
油酸纳米乳液水合粒径188.2±42.6nm，电位0.131±2.27mV。
(2)将不同质量(10mg-70mg)高锰酸钾溶于水中，快速注入步骤(1) 剧烈搅拌的油酸乳液中，白色乳液由紫罗兰色变成酒红色，继续搅拌，直至溶液变成棕色，得到稳定的OA-MnO2纳米粒。
合成的二氧化锰纳米粒子水合粒径128.3±38.25nm，电位-49.5±7.66mV。
上述方法制备的抗菌金属纳米酶OA-MnO2具有氧化物酶活性，能够产生 ROS，其中ROS类型为羟基自由基(·OH)和单线态氧(1O2)。用作抗菌金属纳米酶，用于金黄色葡萄球菌体内体外杀菌，消除和破坏生物膜，以及促进皮肤伤口愈合。
二氧化锰纳米粒子氧化物酶活性耐受温度范围广，温度范围为30℃至 70℃，二氧化锰纳米粒子氧化物酶活性耐受pH范围广，pH范围为4至9，二氧化锰纳米粒子氧化物酶活性耐受离子强度范围广，氯化钠浓度0.1mM至1.0 mM，生理条件下活性最强。
本发明具有以下有益效果：
本发明方法先制备油酸乳液，水合粒径为188.2±42.6nm，以此粒径的油酸纳米乳液作为模板，每个油酸纳米乳液还原一定质量的高锰酸钾形成水合粒径为128.3±38.25nm实心结构的二氧化锰纳米粒。该纳米粒具有氧化物酶活性，不需要严苛的反应条件，就能催化氧化产生大量ROS，破坏细菌细胞，达到抗菌杀菌的作用，体内实验表明，OA-MnO2纳米酶还能够抵御皮肤细菌感染，促进皮肤伤口愈合。
此外，本发明仅仅采用了200μL油酸，在制备过程中几乎全部反应完全，不需要后续处理去除油酸，制得的纳米酶不会被蛋白酶水解，催化效率高，生物相容性好，本发明公开的制备工艺简单，原料来源广泛，反应条件温和，易于合成，适于推广使用。
附图说明
图1为油酸纳米乳液粒径分布图；
图2为OA-MnO2纳米酶粒径分布图；
图3为OA-MnO2纳米酶zeta电位分布图；
图4为油酸纳米乳液透射电镜图；
图5为OA-MnO2纳米酶透射电镜图；
图6为OA、KMnO4和OA-MnO2的紫外吸收光谱图；
图7为不同浓度OA-MnO2纳米酶的紫外吸收光谱图；
图8为不同浓度OA-MnO2纳米酶500nm处的线性关系图；
图9为不同浓度OA-MnO2纳米酶催化TMB紫外吸收图；
图10为OA-MnO2纳米酶酶促反应动力学曲线；
图11为OA-MnO2纳米酶pH处理稳定性图；
图12为OA-MnO2纳米酶温度处理稳定性图；
图13为OA-MnO2纳米酶NaCl溶液处理稳定性图；
图14为添加OA-MnO2纳米酶前后DPBF的荧光吸收变化图；
图15为添加OA-MnO2纳米酶前后MB的紫外吸收变化图；
图16为添加OA-MnO2纳米酶前后TA的荧光吸收变化图；
图17为OA-MnO2纳米酶对S.aureus存活率的影响图(浊度法)；
图18为OA-MnO2纳米酶对S.aureus存活率的影响图(琼脂板计数法)；
图19为OA-MnO2纳米酶对S.aureus存活率的影响图(柱状图)；
图20为OA-MnO2纳米酶对E.coli存活率的影响图(浊度法)；
图21为OA-MnO2纳米酶对E.coli存活率的影响图(琼脂板计数法)；
图22为OA-MnO2纳米酶对E.coli存活率的影响图(柱状图)；
图23为S.aureus的live/dead染色图；
图24为E.coli的live/dead染色图；
图25为OA-MnO2纳米酶抑制S.aureus生物膜的形成图；
图26为OA-MnO2纳米酶破坏已形成的S.aureus生物膜图；
图27为S.aureus感染小鼠的伤口变化；
图28为小鼠伤口面积变化百分比柱状图；
图29为治疗期间小鼠体重变化图；
图30为四组不同处理方式小鼠的皮肤切片的格兰氏染色图；
图31为四组不同处理方式小鼠的皮肤切片的H&E染色图；
图32为四组不同处理方式小鼠的皮肤切片的Masson染色图；
图33为四组不同处理方式小鼠的皮肤切片的免疫组织化学CD31染色图；
图34为体外细胞毒性实验结果图；
图35为两组不同处理方式小鼠的主要内脏器官切片的H&E染色图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细阐述，但本发明不局限于这些实施例。
实施例1
1、OA-MnO2纳米酶的合成及纯化
将200μL油酸溶于7mL无水乙醇中，60℃水浴下加入到7mL水中，剧烈搅拌5min，此时形成乳白色均一油酸纳米乳液，立即冰浴冷却。
为了找出制备OA-MnO2的最佳计量比，分别称取10，20，30，40，50，60， 70mg高锰酸钾固体于5mL水中溶解，快速注入剧烈搅拌的油酸乳液中，白色乳液由紫罗兰色变成酒红色，继续搅拌，直至溶液变成棕色，此时得到稳定的 OA-MnO2纳米粒，当还原70mg KMnO4时，出现纳米粒聚集现象，继续搅拌1h后透析(MV＝14000)，每6h换一次水，直至溶液体积不再变化。
2、OA-MnO2纳米酶的表征
1)OA-MnO2纳米酶的水合粒径和Zeta电位的测定实验
分别取合成好的OA纳米乳液，OA-MnO2纳米酶，分别用去离子水稀释至2mL。其中，1mL用于测水合粒径，1mL用于测Zeta电位。水浴超声15min，并经过水系(0.22μm)滤膜过滤后用于实验测定，每组样品平行测定三次，并监测整个过程的变化。测量结果见表1所示。其中油酸纳米乳液的水合粒径分布图如附图1所示，还原60mg高锰酸钾制得的OA-MnO2纳米酶的水合粒径和Zeta 电位分布图分别如附图2和3所示。
表1为不同用量高锰酸钾制备的OA-MnO2纳米酶的水合粒径和zeta电位变化情况表。
表1
Figure BDA0003095988470000061
根据测得的水合粒径结果显示，制备的OA纳米乳液分散良好，平均水合粒径为188.2±42.6nm，多分散性指数为0.188。随着KMnO4质量的不断增加，能够很容易的制得OA-MnO2纳米酶，电荷比的增加导致了OA-MnO2水合粒径的变化，当KMnO4的质量超过50mg时，水合粒径稳定在了100nm左右。因此，还原60mg KMnO4制备的OA-MnO2具有最佳的反应产率，水合粒径和Zeta电位，除非另有说明，否则将用于以下研究。
2)OA-MnO2纳米酶的透射电镜实验
分别取20μL OA纳米乳液、OA-MnO2纳米酶于1.5mL离心管中，加入980μL 去离子水稀释，吸取10μL稀释后的样品滴于碳支持膜铜网上，将铜网置于电子干燥箱中过夜干燥，制备透射电子显微镜(TEM)样品。
由透射电子显微镜观察到的结果如附图4和5所示，根据附图4TEM的结果显示，OA纳米乳液为球形纳米粒子，真实直径约为50nm。OA-MnO2纳米酶为球形纳米粒子，真实直径约为100nm。
3)OA-MnO2纳米酶的紫外吸收光谱
为了进一步证实OA-MnO2纳米酶的成功制备，测定了OA纳米乳液、KMnO4溶液和OA-MnO2纳米酶的紫外-可见吸收光谱。在96孔板中依次加入200μL OA乳液，KMnO4溶液，2mM OA-MnO2纳米酶，用酶标仪在400-900nm处进行扫描，得到OA，KMnO4，OA-MnO2纳米酶的紫外吸收光谱，如附图6所示。KMnO4与OA纳米乳液反应后KMnO4在500-600nm之间的特征峰消失，证实了OA-MnO2纳米酶的成功制备。
4)OA-MnO2纳米酶的分散性实验
为了证实OA-MnO2纳米酶的分散性，在96孔板中依次加入200μL 0，1，3， 5，8mMOA-MnO2纳米酶，用酶标仪在400-900nm处进行扫描，得到了不同浓度 OA-MnO2纳米酶的紫外吸收光谱，如附图7所示。结果显示，紫外吸收随OA-MnO2纳米酶浓度的增加而增加。将不同浓度OA-MnO2纳米酶在500nm处的紫外吸收值进行拟合，得到一条y＝0.122x+0.026的直线，R2为0.999，呈现良好的线性关系，表明所制备的OA-MnO2纳米酶在水中分散良好。
3、OA-MnO2纳米酶的酶活性测定实验
1)OA-MnO2纳米酶氧化物酶活性
OA-MnO2纳米酶的氧化酶活性通过TMB催化氧化法进行验证。OA-MnO2纳米酶可以催化无色的TMB氧化生成蓝色的oxTMB，在370nm和652nm处有最大吸收峰。实验时在96孔板中首先加入20μL 0，1，2，3，4mM OA-MnO2纳米酶，之后在每孔中加入200μL TMB显色液，室温，避光操作，立即用酶标仪扫描 200-1000nm处紫外吸收。附图9显示，随着OA-MnO2纳米酶浓度的增加，TMB颜色逐渐由无色变为蓝色，1mM的OA-MnO2纳米酶即可将TMB氧化成蓝色的oxTMB，浓度越大蓝色越深，如文献所述，在370nm和652nm处出现特征吸收峰，吸收峰强度与OA-MnO2纳米酶的浓度呈正相关。说明OA-MnO2纳米酶具有氧化酶活性。
2)酶促反应动力学
为了测定OA-MnO2纳米酶的浓度依赖性催化反应动力学，在96孔板中首先加入20μL 0，1，2，3，4mM OA-MnO2纳米酶，之后在每孔中加入200μL TMB 溶液，室温，避光操作，立即用酶标仪扫描652nm处紫外吸收，此后每10min 测量一次，确定OA-MnO2纳米酶催化氧化TMB的酶促反应动力学参数。
为了进一步证实OA-MnO2纳米酶具有氧化物酶活性这一结论，用酶标仪记录了TMB溶液在OD652 nm处紫外吸收随时间和浓度依赖性变化。附图10显示，在初始阶段TMB溶液的OD652 nm吸收随时间的增加而增加，最终在20min左右达到平衡，这与酶的催化反应动力学相似。此外，随着OA-MnO2纳米酶浓度的增加，OD652 nm处紫外吸收也在增强。进一步证实OA-MnO2纳米酶具有氧化物酶活性。
3)不同pH条件下OA-MnO2纳米酶催化活性稳定性
OA-MnO2纳米酶分别用pH为2.0到9.0的PBS(10mM)稀释，然后用TMB催化氧化法监测OA-MnO2纳米酶氧化酶活性，并与未处理的OA-MnO2纳米酶氧化酶活性进行比较。
如附图11所示，OA-MnO2纳米酶的催化活性在pH 3-5范围内随pH的增加而增加，超过pH 5后保持不变，直到在pH 9时略有增加。根据报道，感染部位通常是微酸性环境，而OA-MnO2纳米酶在pH为5-7范围内的高催化活性能够更好的杀灭细菌，避免感染进一步恶化。
4)不同温度处理后OA-MnO2纳米酶催化活性稳定性
OA-MnO2纳米酶稀释后水浴5min，温度从30到70℃，然后用TMB催化氧化法监测OA-MnO2纳米酶氧化酶活性，并与未处理的OA-MnO2纳米酶氧化酶活性进行比较。
如附图12所示，温度从30到70℃的变化对OA-MnO2纳米酶的酶催化活性几乎没有影响，表明其具有高温稳定性，并可能有利于与光热疗法结合以获得更好的性能。
5)不同浓度NaCl溶液处理后OA-MnO2纳米酶催化活性稳定性
OA-MnO2纳米酶分别用浓度为0到1.0M的NaCl溶液稀释，然后用TMB催化氧化法监测OA-MnO2纳米酶氧化酶活性，并与未处理的OA-MnO2纳米酶氧化酶活性进行比较。
将OA-MnO2纳米酶在不同浓度的NaCl溶液中孵育，并评估其酶催化活性。如附图13所示，在0.1M的NaCl浓度下，OA-MnO2纳米酶的活性最高，高离子浓度下OA-MnO2纳米酶的活性最低，酶催化活性呈浓度依赖性降低，表明高离子浓度不利于OA-MnO2纳米酶的催化。然而，实际应用中离子浓度通常在0.01M 左右，远低于0.1M，因此OA-MnO2纳米酶能够稳定的抵抗离子干扰。
6)DPBF检测单线态氧1O2
DPBF作为一种荧光探针能够检测单线态氧1O2的存在，DPBF在单线态氧1O2的氧化下荧光吸收降低，首先将DPBF溶于乙腈(终浓度为500μM)，然后在 96孔板中加入100μL 4mMOA-MnO2纳米酶，之后加入20μL DPBF溶液，不加 DPBF溶液的孔为对照组，避光操作，摇匀，激发波长为380nm，测其425-650nm 处荧光发射光谱。据报道，氧化酶通过催化氧化产生活性氧(ROS)来杀灭病原微生物，从而对抗细菌感染。通过DPBF荧光探针法确定了OA-MnO2纳米酶催化产生活性氧的类型，如附图14所示，DPBF在单线态氧(1O2)氧化时460nm处荧光强度降低，跟文献报道一致，说明OA-MnO2纳米酶催化产生的活性氧种类是单线态氧(1O2)。
7)亚甲基蓝(MB)检测活性氧(·OH)
MB作为一种探针能够检测羟基自由基(·OH)的存在，MB在活性氧ROS(·OH) 的氧化下吸光度值降低，将亚甲基蓝(MB)溶于水(终浓度为0.015％)，首先在 96孔板中加入100μL 4mM OA-MnO2纳米酶，之后加入20μL MB溶液，不加 MB溶液的孔为对照组，避光操作，摇匀，立即用酶标仪测其500-800nm处紫外吸收。接下来，通过监测MB的紫外吸收确定了OA-MnO2纳米酶催化产生活性氧的类型，MB能够在羟基自由基(·OH)的氧化下660nm处紫外吸收强度降低。如附图15所示，MB在羟基自由基(·OH)的氧化下660nm处紫外吸收强度降低，跟文献报道一致，说明OA-MnO2纳米酶催化产生的活性氧种类是羟基自由基 (·OH)。
8)对苯二甲酸(TA)检测活性氧(·OH)
对苯二甲酸(TA)作为一种荧光探针能够检测羟基自由基(·OH)的存在，对苯二甲酸(TA)遇到活性氧ROS(·OH)会形成带荧光的二羟基对苯二甲酸 (TAOH)，在435nm处荧光信号增强。实验将对苯二甲酸溶于NaOH溶液(2mM) (终浓度为0.5mM)，加热搅拌，直到溶解。之后在96孔板中依次加入100μL 4mM OA-MnO2纳米粒和100μL TA溶液，不加TA溶液的孔为对照组，室温避光反应8h，用酶标仪测量其荧光吸收，其中激发波长为380nm，发射波长为425-500 nm。
最后，用TA探针法进一步确认产生的活性氧类型是羟基自由基(·OH)，通过监测TA的荧光吸收来确定，TA在羟基自由基(·OH)的氧化下435nm处荧光吸收强度降低。如附图16所示，TA在羟基自由基(·OH)的氧化下435nm处荧光吸收强度降低，跟文献报道一致，说明OA-MnO2纳米酶催化产生的活性氧种类是羟基自由基(·OH)。
4、OA-MnO2纳米酶的MIC90值测定
1)OA-MnO2纳米酶对金黄色葡萄球菌(S.aureus)MIC90值测定
用超纯水配制0.2,0.4,4,16mM的OA-MnO2纳米酶溶液，其中10mM (pH＝7.4)的PBS缓冲液作为对照组。取培养6h的S.aureus菌液，用PBS 稀释50倍备用。接下来取200μL稀释后的菌液加入96孔板中，再加入200μL 浓度分别是0.2,0.4,4,16mM的OA-MnO2纳米酶溶液，之后放置于摇床(250 rpm，37℃)共孵育5h，每个样品重复加三个孔。为了排除OA-MnO2纳米酶自身吸光度的影响，以不加菌液只加OA-MnO2纳米酶的孔为背景孔。共孵育后用酶标仪检测600nm处吸光度值，与PBS组进行对比，通过培养基浊度判断细菌存活率，吸光度值越小，说明细菌存活率越低。如附图17所示，OA-MnO2纳米酶对 S.aureus的存活率有明显的抑制作用，且浓度越大抑制效果越好。同时用固体琼脂板菌落计数法验证这一结果，如附图18所示，与对照组相比，8mM OA-MnO2纳米酶组仅有少量菌落数，S.aureus的存活率仅为10％，即MIC90为8mM(附图 19)。
2)OA-MnO2纳米酶对大肠杆菌(E.coli)MIC90值测定
用超纯水配制2,4,8,16mM的OA-MnO2纳米酶溶液，其中10mM(pH＝7.4) 的PBS缓冲液作为对照组。取过夜培养的E.coli菌液，用PBS稀释100倍备用。接下来取200μL稀释后的菌液加入96孔板中，再加入200μL浓度分别是2, 4,8,16mM的OA-MnO2纳米酶溶液，之后放置于摇床(250rpm，37℃)共孵育5h，每个样品重复加三个孔。为了排除OA-MnO2纳米酶自身吸光度的影响，以不加菌液只加OA-MnO2纳米酶的孔为背景孔。共孵育后用酶标仪检测600nm处吸光度值，与PBS组进行对比，通过培养基浊度判断细菌存活率，吸光度值越小，说明细菌存活率越低。如附图20所示，高浓度OA-MnO2纳米酶对E.coli的存活率有明显的抑制作用，且浓度越大抑制效果越好。同时用固体琼脂板菌落计数法验证这一结果，如附图21所示，与对照组相比，8mM OA-MnO2纳米酶组仅有少量菌落数，E.coli的存活率为10％左右，即MIC90为8mM(附图22)。
5、OA-MnO2纳米酶治疗后细菌的live/dead染色实验
运用live/dead染色试剂盒探究OA-MnO2纳米酶作用于S.aureus/E.coli 细菌前后的存活情况。各取1mL过夜培养的S.aureus/E.coli细菌于EP管中，5000rpm，4℃，冷冻离心5min，弃上清，加入200μL无菌PBS溶液重悬备用。加入200μL OA-MnO2纳米酶(对于S.aureus，终浓度为0.1，8mM；对于E.coli，终浓度为1,8mM)共孵育30min，其中对照组加入PBS溶液。孵育结束后，5000rpm，4℃，冷冻离心5min，弃上清，沉淀中加入40μL live/dead试剂染色，涡旋混匀，避光静置20min。取20μL样品滴在载玻片上，从一端盖盖玻片，用荧光显微镜观察。
为了探索纳米酶的抗菌机理，使用双重荧光染料SYTO9/碘化丙啶(PI)对S.aureus和E.coli进行了染色。PI仅染色膜结构受损的细菌，而SYTO9可以进入所有细菌。当两种染料同时出现时，SYTO9的荧光强度会变弱。具有整合膜结构的细菌被绿色荧光染色，具有受损膜结构的细菌被红色荧光染色。如图显示了用OA-MnO2纳米酶处理后的S.aureus(附图23)和E.coli(附图24) 的荧光图像。PBS处理的组作为对照，其中PBS处理的组S.aureus、E.coli 细菌呈现出明亮的绿色，只有少量细菌被PI染成红色，说明细菌仍然具有完整的细胞膜结构，保持着较好的细菌活力，但是加入OA-MnO2纳米酶后细菌呈现出大部分的红色，而且呈现明显的浓度依赖性。在MIC90时，OA-MnO2纳米酶进一步降低了细胞活力，仅检测到微弱的绿色荧光。推测是OA-MnO2纳米酶产生的ROS 发挥了作用，ROS破坏了细菌细胞膜的完整性，使得内容物流出，细菌被杀死。
6、OA-MnO2纳米酶对生物膜的破坏和抑制实验
1)OA-MnO2纳米酶抑制生物膜的形成实验
取过夜培养的S.aureus细菌菌液4μL加入96孔板中，再加入200μL OA-MnO2纳米酶，用TSB培养基稀释OA-MnO2纳米酶，终浓度约为0.1，8mM，加 PBS组作为对照，每组3个孔，置于生化培养箱中，孵育48h。轻轻取出孵育后的样品，弃去上层培养基，并用PBS清洗3次，静置风干后加入100μL 1％的结晶紫静置染色100min，上层结晶紫丢弃，用PBS清洗3遍，静置风干后加入100μL 80％的乙醇溶液，放入摇床振荡溶解2h，用酶标仪测590nm处的吸光度。
为了评估OA-MnO2纳米酶抑制生物膜的形成能力，将不同浓度的OA-MnO2纳米酶与金黄色葡萄球菌共孵育48h，评价孵育结束后生物膜的形成情况。如附图25所示，在MIC50和MIC90浓度下，OA-MnO2纳米酶分别有效地抑制了生物膜形成的40％和20％，表明在抑制生物膜形成方面具有很大的潜力。
2)OA-MnO2纳米酶消除已经形成的生物膜实验
取过夜培养的S.aureus细菌菌液4μL加入96孔板中，再加入200μL TSB 培养基，放入生化培养箱中孵育48小时，待其形成生物膜，孵育后轻轻取出，弃去上层培养基，并加入200μL OA-MnO2纳米酶溶液，终浓度为0.1,8mM，加 PBS的孔作为对照组，每组平行加3个孔，置于摇床共孵育1h。孵育结束后弃去上层培养基，并用PBS清洗3次，风干后加入100μL 1％的结晶紫染色，静置10min后，将上层结晶紫吸走，PBS清洗3遍，风干后加入100μL 80％的乙醇溶液，放置在摇床中震荡溶解2h，用酶标仪测590nm处的吸光度。
为了评估OA-MnO2纳米酶对已经形成的生物膜的破坏能力，先培养金黄色葡萄球菌形成生物膜，再将不同浓度的OA-MnO2纳米酶与生物膜共孵育1h，评价孵育结束后生物膜的破坏情况。如附图26所示，共孵育1h后，OA-MnO2纳米酶对生物膜有明显的破坏作用，在MIC 90浓度下仅剩30％。
6、OA-MnO2纳米酶体内抗菌实验
1)小鼠S.aureus细菌伤口感染模型的建立
为了研究OA-MnO2纳米酶对小鼠皮肤伤口S.aureus细菌感染部位的抗菌效果，首先对小鼠建立S.aureus细菌感染模型。提前一天将小鼠背部鼠毛剃去备用。实验时，在小鼠的腹腔注射100μL 4％的水合氯醛，待小鼠完全麻醉后，将小鼠背部向上，用打孔器在背部做出长轴约为10mm，短轴约为6mm的椭圆形全厚伤口，用消过毒的手术剪、手术镊处理伤口。吸取50μL S.aureus菌液(107CFU/mL)滴在其背部伤口进行感染，每只滴加三次，待伤口上菌液风干即可，24h后观察伤口感染情况。
2)OA-MnO2纳米酶对S.aureus感染小鼠伤口的治疗
伤口感染后，将感染的小鼠随机分为4组(Control组，Van组，MIC50组， MIC90组)，每组各5只，所有老鼠分笼饲养，防止互相抓伤，舔舐伤口。Control 组感染后的伤口上滴加50μL PBS；Van组滴加50μL万古霉素溶液(2μg/mL)，作为阳性对照组；MIC50组滴加50μL OA-MnO2纳米酶(0.1mM)；MIC90组组滴加50μL OA-MnO2纳米酶(8mM)。每天一次，连续治疗7天，每天记录小鼠体重 (附图29)，相同时间观察伤口愈合情况，并拍摄背部伤口照片，最后用ImageJ 软件定量伤口面积，以此计算每天伤口面积与初始伤口面积的百分比。
实验过程中伤口面积变化如附图27,28所示，对照组没有任何治疗干扰，仅仅是每天给予PBS缓冲液作为对照，S.aureus感染的伤口也具有自然愈合的倾向。万古霉素是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的最后一道防线，其具有良好的抗菌性能，最小抑菌浓度为1μg/mL，本实验中，采取稍高于最小抑菌浓度的万古霉素剂量，与对照组相比，伤口面积先有增大的趋势，直到第7天，伤口面积才有明显缩小的趋势。这表明，万古霉素虽然具有良好的抗菌性能，但是可能对伤口愈合具有一定的负面作用。原因可能是万古霉素是一种带正电荷的抗菌肽，它对负责皮肤恢复的上皮细胞具有一定的细胞毒性。相反，不同浓度的OA-MnO2纳米酶能在实验记录的时间间隔内显著加速伤口的愈合，且伤口愈合速度呈现浓度依赖性，这可能归功于其强大的抗菌能力。
3)创面皮肤组织染色
待MIC90组小鼠伤口完全愈合后，取下4组小鼠背部的伤口组织，将创面皮肤组织用苏木精和伊红(H&E)染色做成病理切片，将做好的病理切片在荧光显微镜下观察染色后各组创面的愈合情况，同时进行格兰氏染色，Masson染色和免疫组织化学CD31染色。其中，通过格兰氏染色可以观察小鼠皮肤伤口经过治疗后S.aureus的存活情况。
格兰氏染色中，S.aureus被染成紫色，紫色越多说明伤口感染情况越严重。如附图30所示，革兰氏染色结果显示对照组皮肤中大量存在S.aureus，显示出 S.aureus感染的慢性特征。Van组虽然用2μg/mL万古霉素治疗能够有效地减少S.aureus的数量，但是治疗后7天仍残留许多S.aureus。MIC50剂量组的 OA-MnO2纳米酶表现出比万古霉素更好的抗菌性能，皮肤组织中只剩下很少量的 S.aureus。此外，MIC90剂量组几乎完全抑制S.aureus，可忽略皮肤组织的革兰氏染色阳性结果。这些结果表明OA-MnO2纳米酶具有较强的体内抗菌性能。
H&E染色结果如附图31所示，对照组损伤区域均可见新生的表皮层(黑色箭头)，真皮层被大面积增生的结缔组织取代(黄色箭头)，可见较多新生血管 (红色箭头)，伴有较大量的淋巴细胞与中性粒细胞浸润(蓝色箭头)，局部可见较大量的出血(绿色箭头)，周围可见少量实质细胞坏死溶解(棕色箭头)。 Van组和MIC50组也观察到这些现象，但是MIC50组未见出血部位。MIC90组表皮层轻度增厚(黑色箭头)；真皮层胶原纤维含量丰富，可见毛囊皮脂腺等附属器官，未见明显炎症，表明皮肤伤口感染完全恢复，伤口愈合较好。
附图32显示的是Masson染色结果，胶原纤维被染成蓝色，肌纤维、纤维素和红细胞呈现红色。从图中可以看出，对照组有大量红色细胞，说明红细胞偏多，胶原纤维偏少，说明伤口正在愈合，还未完全形成真皮层。Van组和MIC 50组有大量蓝色胶原纤维，说明伤口愈合良好，已经差不多形成真皮层。MIC 90 组表皮层有大量蓝色细胞，说明伤口已经完全愈合，形成完整的真皮层。
免疫组织化学CD31染色结果如附图33所示，阳性细胞被染成棕黄色，阳性细胞越多说明伤口愈合情况越好。从图中结果可以看出，对照组和Van组均有少量的阳性细胞，阳性细胞密度稍小，MIC 50和MIC 90组均有大量棕褐色阳性细胞，但是MIC 90组阳性细胞密度明显大于MIC 50组，说明MIC90组伤口愈合最好。
7、OA-MnO2纳米酶体内安全性评价
1)MTT细胞毒性实验
本实验采取MTT法探究了OA-MnO2纳米酶对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的细胞毒性。首先在96孔中每孔加入104个细胞，培养12h使其贴壁生长，将OA-MnO2纳米酶用DMEM高糖培养基稀释10倍，终浓度为0.01,0.05,0.1,0.8mM，每孔加100μL OA-MnO2纳米酶培养24h，之后每孔加20μL MTT溶液，避光培养4h，弃去上层培养基，加150μL DMSO溶液静置5min后用酶标仪测量570 nm处吸光度值。如附图34所示，在最高浓度为0.8mM时，HUVEC在孵育24h 时的细胞活力仍在80％以上。这表明OA-MnO2纳米酶的细胞毒性较低。
2)内脏安全性评价
运用OA-MnO2纳米酶对小鼠背部皮肤治疗7天后，对小鼠进行安乐死，取对照组和MIC90组小鼠主要内脏(心，肝，脾，肺，肾)进行H&E染色，通过病理分析OA-MnO2纳米酶是否对小鼠内脏器官具有毒性。如附图35所示对MIC90 组主要器官的H&E染色进行了比较，在对照组和MIC90组的所有主要器官之间没有观察到明显的组织形态学差异，这进一步证实了上述结论。此外实验过程中，记录了小鼠的体重变化。观察到在整个实验治疗期间，即使在MIC90治疗量时，体重也没有发生显著变化(附图29)，表明OA-MnO2纳米酶的低体内毒性。以上这些结果表明，OA-MnO2纳米酶可能是一种安全有效的配方，具有良好的生物相容性，能够在未来对抗皮肤感染方面具有可观的发展前景。

Claims (8)

1.一种抗菌金属纳米酶OA-MnO2的制备方法，其特征在于，所述制备方法步骤如下：
（1）将200 μl油酸溶于7 mL无水乙醇，快速注入60℃水浴加热的超纯水中剧烈搅拌，制得油酸纳米乳液；
（2）将高锰酸钾溶于水中，快速注入步骤（1）剧烈搅拌的油酸乳液中，白色乳液由紫罗兰色变成酒红色，继续搅拌，直至溶液变成棕色，得到稳定的OA-MnO2纳米粒。
2.根据权利要求1所述的抗菌金属纳米酶OA-MnO2的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述油酸纳米乳液水合粒径188.2±42.6 nm，电位0.131±2.27 mV。
3.根据权利要求1所述的抗菌金属纳米酶OA-MnO2的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）将10 mg-70 mg高锰酸钾注入步骤（1）油酸乳液中。
4.根据权利要求1所述的抗菌金属纳米酶OA-MnO2的制备方法，其特征在于，步骤（2）合成的二氧化锰纳米粒子水合粒径128.3±38.25 nm，电位-49.5±7.66 mV。
5.一种根据权利要求1所述方法制备的抗菌金属纳米酶OA-MnO2制备抗金黄色葡萄球菌药物的应用，其特征在于，所述抗菌金属纳米酶OA-MnO2用于金黄色葡萄球菌体内体外杀菌，消除和破坏生物膜，以及促进皮肤伤口愈合。
6.根据权利要求5所述的抗菌金属纳米酶OA-MnO2制备抗金黄色葡萄球菌药物的应用，其特征在于，抗菌金属纳米酶OA-MnO2活性耐受温度范围为30 ℃至70 ℃。
7.根据权利要求5所述的抗菌金属纳米酶OA-MnO2制备抗金黄色葡萄球菌药物的应用，其特征在于，抗菌金属纳米酶OA-MnO2活性耐受pH范围为4至9。
8.根据权利要求5所述的抗菌金属纳米酶OA-MnO2制备抗金黄色葡萄球菌药物的应用，其特征在于，抗菌金属纳米酶OA-MnO2活性耐受氯化钠浓度0.1 mM01.0 mM。
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