CN112156171A - 光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料的制备方法及其应用 - Google Patents

光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料的制备方法及其应用。该复合材料通过将万古霉素包封在锌有机框架内，并由聚多巴胺进一步修饰其表面构成，材料简称为Van@ZIF‑8@PDA，其中Van为万古霉素，ZIF‑8为锌有机框架，PDA为聚多巴胺。首先，将万古霉素和六水硝酸锌溶于水溶液，混合搅拌；然后逐滴加入2‑甲基咪唑溶液，再次搅拌后离心洗涤真空干燥得到包封万古霉素的锌有机框架（Van@ZIF‑8）；再将多巴胺加到Van@ZIF‑8的Tris‑HCl溶液中混合搅拌，离心洗涤真空干燥得到Van@ZIF‑8@PDA复合材料。本发明属于抗菌药物领域，作为一种新型抗菌药物，其对万古霉素中介耐药金黄色葡萄球菌Mu50及其生物膜均有显著的抑制作用，并能显著降低抗生素的工作浓度，在耐药菌的治疗上具有巨大的潜力。

Description

光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料的制备方法及 其应用
技术领域
本发明属于生物医药抗菌领域，涉及光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料的制备方法，以及作为抗菌药物的应用。
背景技术
抗生素是预防和治疗细菌感染最常见的治疗方法。但抗生素的滥用会导致耐药菌的出现和流行。此外，细菌感染和生物膜形成是一个严重的临床问题。因此，迫切需要针对细菌感染和生物膜的替代治疗策略，以减少耐药性的出现。
近年来，具有高载药能力等特点的纳米材料正成为抗菌领域的新型药物制剂。与传统抗生素相比，纳米材料因具有独特的抗菌机理，其诱导细菌产生耐药性的可能性较小。其中，锌有机框架（ZIF-8）因具有高孔隙率，广泛用于药物递送的纳米载体。据报道，ZIF-8是一种pH响应的纳米载体，在生理环境中稳定，但在酸性条件下可以降解释放锌离子，释放的锌离子有助于抑制细菌生长。
光热疗法可以利用光热剂将近红外光转换成热能从而杀死细菌。相比于传统的抗生素治疗，光热疗法具有规避耐药性的优势且对健康组织的热损伤小。聚多巴胺（PDA）由于其合成相对简单，良好的生物相容性和较高的光热转化效率而被广泛研究。PDA可以在多种材料上形成表面附着的纳米涂层，更重要的是，ZIF-8表面的PDA修饰可以增强其稳定性，降低其毒性，从而提高其生物相容性。
较低的温度在短时间内不足以完全消除顽固的细菌感染，仅通过光热疗法来完全消除细菌可能需要更高的温度，这会损害邻近的健康组织。因此，可以利用光热疗法和抗生素治疗的优点，开发出一种新型的智能控制药物释放纳米系统。在近红外光光照下，智能地在感染部位释放抗生素，并联合光热治疗协同抗菌。这些协同策略可以充分发挥两者的优势，增强抗菌效果，同时降低抗生素的工作浓度。
发明内容
本发明提出了一种光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料的制备方法及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料的制备方法，其特征在于：所述的制备方法是通过一锅反应合成包封万古霉素的锌有机框架，聚多巴胺修饰于其表面得到纳米复合材料。
具体制备过程包括以下步骤：
步骤一：万古霉素（5 mg）和六水硝酸锌（0.2 g）溶解在5 mL的水中，混合液搅拌5 分钟；
步骤二：在上述所得混合液中逐滴加入10 mL 2-甲基咪唑溶液， 再次搅拌15 分钟，离心收集后用H2O和甲醇混合洗涤三次，然后在真空下干燥得到Van@ZIF-8；
步骤三：将5 mg Van@ZIF-8悬浮在30 mL的Tris-HCl缓冲液 （10 mM，pH 8.5）中。超声搅拌5 分钟后，加入5 mg盐酸多巴胺，室温搅拌2 小时。
步骤四：离心收集后用H2O和甲醇混合洗涤3次，然后在真空下干燥制得最终的产品Van@ZIF-8@PDA。
优化的方案，所述的光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料，在制备过程中原料分别为：六水硝酸锌200 mg，万古霉素5 mg，10 mL 2-甲基咪唑溶液，盐酸多巴胺5mg。
优化的方案，所述的光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料，步骤二中在逐滴加入2-甲基咪唑溶液过程中持续进行搅拌，搅拌时间为15分钟。
优化的方案，所述的光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料，步骤三中在加入盐酸多巴胺后，在室温下搅拌时间为2小时。
优化的方案，所述的光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料，即Van@ZIF-8@PDA 纳米颗粒的最终工作浓度100 μg/mL。
优化的方案，所述的光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料，可在近红外光下释放万古霉素，并降低万古霉素的工作浓度。
优化的方案，所述的光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料，在近红外光照射下具有显著的抗菌活性，并能够有效抑制万古霉素中介耐药金黄色葡萄球菌Mu50的生物膜形成。
优化的方案，所述的光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料，可以通过光热效应和光响应性释放的万古霉素协同治疗由万古霉素中介耐药金黄色葡萄球菌Mu50引起的皮肤脓肿，包括但不限于此。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
本发明提供的一种光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料Van@ZIF-8@PDA，通过将万古霉素包载于锌有机框架内，再由聚多巴胺对其表面进行修饰而成。合成过程简易、耗时短、成本低，表现出优异的光热/药物协同抗菌作用。可以在近红外光照射下控制抗生素释放并显著降低抗生素的工作浓度，该纳米材料可以协同光热和药物治疗，对万古霉素中介耐药金黄色葡萄球菌Mu50具有显著的抗菌效果并可以抑制其生物膜形成；在小鼠皮下脓肿模型中，验证了Van@ZIF-8@PDA显著的体内抗菌效果，促进感染部位的恢复且同时具有良好的体内生物相容性。
附图说明
图1为本发明提出的Van@ZIF-8@PDA的合成示意图；
图2为Van@ZIF-8@PDA扫描电子显微镜表征示意图；
图3为Van@ZIF-8@PDA水合粒径示意图；
图4为Van@ZIF-8@PDA表面电势示意图；
图5为808 nm激光（1 W/cm2，10分钟）照射下，不同浓度的Van@ZIF-8@PDA溶液的温度变化示意图；
图6 为Van@ZIF-8@PDA的光热稳定性示意图；
图7 为Mu50经过不同处理后形成的琼脂平板上细菌菌落照片；
图8为不同处理后Mu50的相对存活率；
图9为不同组处理后的Mu50扫描电镜图；
图10为Mu50经过不同处理后的DNA裂解分析图；
图11为已建立的Mu50生物膜经过不同处理后的清除率统计图；
图12为Mu50经过不同处理后生物膜形成的抑制率统计图；
图13为Mu50感染的皮下脓肿小鼠进行不同处理后第12天皮肤脓肿变化的照片；
图14为第12天从各治疗组感染的脓肿组织匀浆的琼脂平板上形成细菌菌落的照片；
图15为不同治疗12天后感染皮肤组织的H&E染色图像；
图16为不同治疗组小鼠的体重变化统计图；
图17为不同治疗12天后小鼠主要脏器组织（心、肝、脾、肺、肾）的H&E染色图像。
具体实施方式
下面将通过具体实施方式的描述并结合本发明实施例中的附图，对本发明作进一步的说明，但并非是全部的实施例。
实施例一：
光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料的制备方法，具体制备方法包括以下步骤：
步骤一：万古霉素（5 mg）和六水硝酸锌（0.2 g）溶解在5 mL的水中，混合液搅拌5 分钟；
步骤二：在上述所得混合液中逐滴加入10 mL 2-甲基咪唑溶液， 再次搅拌15 分钟，离心收集后用H2O和甲醇混合洗涤三次，然后在真空下干燥得到Van@ZIF-8；
步骤三：将5 mg Van@ZIF-8悬浮在30 mL的Tris-HCl缓冲液 （10 mM，pH 8.5）中。超声搅拌5 分钟后，加入5 mg盐酸多巴胺，室温搅拌2 小时。
步骤四：离心收集后用H2O和甲醇混合洗涤3次，然后在真空下干燥制得最终的产品Van@ZIF-8@PDA。
实施例二：
本发明还提供了光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料的应用，按照实施例一中制得的方法制备出一种近红外光下释放万古霉素的锌有机框架复合纳米材料，即Van@ZIF-8@PDA。
该抗菌复合材料的应用，光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料，可在近红外光刺激下控制万古霉素释放，降低万古霉素的工作浓度。
该抗菌复合材料的应用，光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料，在近红外光照下具有显著的抗菌活性，并能够有效对抗万古霉素中介耐药金黄色葡萄球菌Mu50的生物膜活性。
该抗菌复合材料的应用，光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料，可以通过光热效应和光响应释放的万古霉素协同治疗由万古霉素中介耐药金黄色葡萄球菌Mu50引起的皮肤感染，包括但不限于此。
实施例三：
如图1-4所示，对本发明制备的Van@ZIF-8@PDA纳米复合材料进行表征：
如图1所示，在按照图1示意，制备了光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料Van@ZIF-8@PDA；
如图2所示，使用电子显微镜表征了Van@ZIF-8@PDA的形貌，结果显示这种纳米颗粒为类球形；
如图3所示，对Van@ZIF-8@PDA进行水合粒径（DLS）测量，Van@ZIF-8@PDA测得的平均粒径约为171.6 nm；
如图4所示，对Van@ZIF-8@PDA进行表面电势测量，测得的表面电势为−9.3 ± 0.46mV，这些结果证实了Van@ZIF-8@PDA纳米材料的成功合成。
实施例四：
如图5、图6所示，对本发明制备的Van@ZIF-8@PDA纳米复合材料进行光热性能和光热稳定性的评估：
如图5所示，不同浓度的Van@ZIF-8@PDA溶液（50 ，75，100 μg/mL）在808 nm激光（1 W/cm2，10分钟）照射后，温度升高与浓度成正比，而PBS的温度无明显变化；
如图6所示，为评估Van@ZIF-8@PDA的光热稳定性，Van@ZIF-8@PDA在经过四个开/关近红外光循环照射后，温度变化没有显著差异，表明Van@ZIF-8@PDA在多次光热处理中稳定高，可作为一种可行的潜在光热剂。
实施例五：
如图7-10所示，用万古霉素中介耐药金黄色葡萄球菌Mu50评估Van@ZIF-8@PDA的体外抗菌能力，具体检测结果如下：
如图7所示，通过平板计数法对纳米复合材料的抗菌能力进行了检测，结果显示在Van@ZIF-8@PDA+NIR组中几乎没有观察到细菌菌落；
如图8所示，Van@ZIF-8@PDA+NIR组中的Mu50的相对细菌活力为1.27％；
如图9所示，扫描电镜的结果表明Van@ZIF-8@PDA+NIR处理后的小部分Mu50被破坏；
如图10所示，DNA裂解分析结果表明ZIF-8@PDA、Van@ZIF-8@PDA在近红外光照射后，Mu50全基因组DNA被裂解为小片段。
综上，这些结果表明，我们制备的复合材料Van@ZIF-8@PDA在近红外光照下具有优异的抗菌作用。
实施例六：
如图11、图12所示，评估复合材料Van@ZIF-8@PDA对生物膜的清除能力和抑制能力：
如图11所示，评估Van@ZIF-8@PDA对已建立的Mu50生物膜的清除能力。结果表明Van@ZIF-8@PDA在近红外光照射10分钟后，生物膜的清除率达到75.5%；
如图12所示，评估Van@ZIF-8@PDA抑制Mu50生物膜形成的能力。结果表明Van@ZIF-8@PDA在近红外光照射10分钟后，生物膜的抑制率达到85.6%。
综上，这些结果表明，我们制备的Van@ZIF-8@PDA在近红外光照下对Mu50生物膜具有优异的清除能力，并能够显著抑制其生物膜的形成。
实施例七：
如图13-17所示，建立Mu50引发的皮下脓肿小鼠模型，进一步验证纳米复合材料Van@ZIF-8@PDA体内抗菌效果，并对其体内安全性进行评估。
如图13所示，结果显示Van@ZIF-8@PDA+NIR处理组的治疗效果明显优于其他组，皮肤创面随着时间逐渐变小，治疗后第12天皮肤愈合良好，无明显疤痕或溃疡；
如图14所示，收集各治疗组脓肿组织进行匀浆，将匀浆组织的细菌悬浮液均匀铺在琼脂平板上进一步评估杀菌效率，结果显示Van@ZIF-8@PDA+NIR治疗组几乎没有菌落；
如图15所示，H＆E染色下进一步评估治疗后第12天脓肿组织的恢复情况，结果显示Van@ZIF-8@PDA+NIR治疗组的皮肤组织显示炎症细胞明显减少，表皮层和纤维细胞完整，表明脓肿愈合；
如图16所示，Van@ZIF-8@PDA+NIR治疗组小鼠体重随时间的变化趋势与对照组的小鼠相似，表明纳米颗粒的体内毒性可忽略不计；
如图17所示，在治疗后的第12天收集所有小鼠的心、肝、脾、肺、肾等器官， H&E染色结果表明纳米颗粒对这些器官没有引起任何明显的损伤或毒性。
这些结果表明，我们制备的Van@ZIF-8@PDA具有显着抗菌作用，并有较高的生物相容性和安全性，从而证实了其作为一种耐药菌感染治疗方法的临床应用潜力；
综上所述，Van@ZIF-8@PDA有望成为一种光响应性释放万古霉素，协同光热/药物治疗，具有优异的体内外抗菌作用，且具有良好生物相容性的新型抗菌药物制剂。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并非局限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员依据本发明的技术方案对以上实施例所做的等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料的制备方法，其特征在于，具体制备方法包括以下步骤：
步骤一：万古霉素（5 mg）和六水硝酸锌（0.2 g）溶解在5 mL的水中，混合液搅拌5 分钟；
步骤二：在上述所得混合液中逐滴加入10 mL 2-甲基咪唑溶液， 再次搅拌15 分钟，离心收集后用H2O和甲醇混合洗涤三次，然后在真空下干燥得到Van@ZIF-8；
步骤三：将5 mg Van@ZIF-8悬浮在30 mL的Tris-HCl缓冲液 （10 mM，pH 8.5）中；
超声搅拌5 分钟后，加入5 mg盐酸多巴胺，室温搅拌2 小时；
步骤四：离心收集后用H2O和甲醇混合洗涤3次，然后在真空下干燥制得最终的产品Van@ZIF-8@PDA。
2. 根据权利要求1所述的光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料的制备方法，其特征在于，在制备过程中原料分别为：六水硝酸锌200 mg，万古霉素5 mg，10 mL 2-甲基咪唑溶液，盐酸多巴胺5 mg。
3.根据权利要求1所述的光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤二中在逐滴加入2-甲基咪唑溶液过程中持续进行搅拌，搅拌时间为15分钟。
4.根据权利要求1所述的光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤三中在加入盐酸多巴胺后，在室温下搅拌时间为2小时。
5.根据权利要求1所述的光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料的制备方法，其特征在于，所述Van@ZIF-8@PDA 纳米颗粒的最终工作浓度100 μg/mL。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料的应用，其特征在于，所述Van@ZIF-8@PDA复合纳米材料可在近红外光刺激响应下释放万古霉素，并能降低万古霉素的工作浓度。
7.根据权利要求6所述的光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料的应用，其特征在于，所述Van@ZIF-8@PDA复合纳米材料，在近红外光照下具有显著的抗菌活性，并能够有效抑制万古霉素中介耐药金黄色葡萄球菌Mu50的生物膜形成。
8.根据权利要求6所述的光响应性释放万古霉素的锌有机框架复合材料的应用，其特征在于，所述Van@ZIF-8@PDA复合纳米材料，可以通过光热效应和光响应释放的万古霉素协同治疗由万古霉素中介耐药金黄色葡萄球菌Mu50引起的皮肤感染，包括但不限于此。
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