CN111281976B - 光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的制备方法与应用 - Google Patents

光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的制备方法及应用，其包括如下步骤：步骤一，将巯基化石墨烯、亚硝基叔丁酯和二甲基亚砜均匀混合，室温避光静置，得到混合液；步骤二，进行离心处理，去除上清液得到产物；步骤三，采用去离子水洗涤产物，然后进行离心处理；步骤四，将步骤三得到的产物以HEPES重悬得到悬液A，加入4‑巯基苯硼酸，室温条件下搅拌得到悬液B；步骤五，对悬液B进行离心处理，使用去离子水洗涤，得到光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料。其具有高效靶向光热与化疗协同杀伤细菌能力，生物相容性良好，制备方法简单，能够有效治疗多重耐药革兰阴性杆菌皮肤创面感染并促进皮肤感染创面的愈合。

Description

光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的制备方 法与应用
技术领域
本发明涉及功能化石墨烯材料，具体涉及一种光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的制备方法及应用。
背景技术
皮肤创面细菌感染，一直是烧、创伤救治的重大挑战，目前针对细菌感染，仍然主要依赖于抗生素治疗，但临床抗生素治疗常常伴随着多重耐药菌株的出现与流行，由于缺乏新的抗生素，一些泛耐药的菌株，尤其是多重耐药革兰阴性杆菌，甚至出现“无药可治”的状况。皮肤创面多重耐药革兰阴性杆菌感染已经成为临床抗感染治疗的一大棘手问题，由于传统抗生素治疗难以奏效，因此，我们迫切需要寻找一些新的治疗策略来解决该问题。
光热治疗作为替代治疗之一，具有无创或微创性、可控性、良好的抗菌效率、不会产生耐药性等诸多优势，已成为近年的研究热点。最近，金纳米粒子、金纳米棒、铜纳米粒子、聚多巴胺等众多重金属纳米材料、高分子聚合物及其复合物均成功应用于光热抗菌治疗，显示出卓越的杀菌能力与良好的应用前景。然而，目前光热治疗的关键问题在于光热剂对细菌无靶向性，不能结合到病原菌上对其直接进行加热杀灭，难以避免对周围正常组织造成副损伤。
石墨烯是一种只有单原子厚度的、蜂窝状晶格的碳基二维材料，作为一种良好的光热剂，基于石墨烯的光热治疗目前已经成功应用于抗菌领域。与其他光热剂相比，石墨烯可与多种小分子、聚合物发生交联，功能化方法简单，容易通过简单的化学反应优化石墨烯作为光热剂的特性。并且，石墨烯在体内外均具有良好的生物相容性，不会对正常组织、细胞产生强烈毒性。同时，与球形纳米粒子或圆柱形的纳米棒相比，片层状的石墨烯具有较大的比表面积，可与细菌充分接触、包裹，进而提高光热效率与抗菌效率。
NO是一种内源合成的气体小分子物质，存在于人体各种组织和细胞中，广泛参与调节各种生理过程。NO可诱发氮化应激和氧化应激，造成细菌DNA链断裂、细胞膜破坏、影响膜蛋白功能，从而导致细菌功能失调，最终导致细菌死亡，因此，NO是一种高效的广谱抗菌剂。同时，NO在细菌感染免疫应答中发挥重要作用。此外，NO还具有促进创面愈合、组织修复等多种功能。然而，NO化学性质活跃，易与其它分子发生反应，在生物体中半衰期极短(数秒)，仅能在短时间短距离内发挥生物学效应。因此，选择合适的NO供体，实现NO在感染部位的可控、持续释放是发挥其抗菌作用的关键。在众多的NO释放系统中，光控释放NO供体可以精确地控制NO释放部位、时间及剂量，近年受到越来越多的关注。
细菌靶向策略与联合治疗策略是提高抗菌有效性的重要手段。硼酸分子共价结合是一种近年刚兴起的专门针对革兰阴性杆菌的靶向策略。最近，Galstyan等利用硼酸分子可与多糖特异性共价结合的特性，制备了一种硼酸功能化的光敏剂，在体外条件下能够直接靶向大肠杆菌胞壁脂多糖及胞外生物膜基质多糖成分，极大地提高了光动力治疗的抗菌效率。硼酸分子不同于其它靶向多糖的分子，其识别革兰阴性杆菌细胞壁及生物膜多糖成分并与其特异结合的能力极强，主要通过硼酸基团与多糖顺式邻羟基发生共价酯化反应实现。另外，硼酸功能化可降低材料毒性、提高体内稳定性，目前已成功应用于医疗器械的表面修饰。
CN109876141A公开了一种具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料的制备方法及应用，通过选择羧基化石墨烯，基于氨基与羧基的缩合反应通过共价交联引入3-氨基吡啶，然后基于季铵化反应引入3-溴甲基苯硼酸，接枝硼酸基团及季铵盐基团，得到具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料，其仅能实现单一的光热治疗，应用范围受限。
综上，以石墨烯作为光热基底材料，通过对石墨烯的功能化实现光热和化疗协同作用靶向杀灭细菌，制备一种安全、高效的新型靶向纳米抗菌材料，能够为治疗皮肤创面多重耐药革兰阴性杆菌感染提供新思路、新策略。
发明内容
本发明的目的是提供一种光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的制备方法及应用，其具有高效靶向光热与化疗协同杀伤细菌能力，生物相容性良好，制备方法简单，能够有效治疗多重耐药革兰阴性杆菌皮肤创面感染并促进皮肤感染创面的愈合。
本发明所述的光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的制备方法，其包括如下步骤：
步骤一，将1～5重量份巯基化石墨烯、0.5重量份的亚硝基叔丁酯和5～20重量份二甲基亚砜均匀混合，室温避光静置12～14h，得到混合液；
步骤二，对混合液进行离心处理，取沉淀去除上清液，得到产物；
步骤三，采用去离子水洗涤产物，然后进行离心处理；
步骤四，将步骤三得到的产物以5～20重量份HEPES重悬，得到悬液A，向悬液A中加入1～5重量份4-巯基苯硼酸，室温条件下搅拌12～14h，得到悬液B；需要说明的是：所述HEPES与步骤一中的巯基化石墨烯、亚硝基叔丁酯和二甲基亚砜为同一重量基准，
步骤五，对悬液B进行离心处理，使用去离子水洗涤，得到光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料。
进一步，所述步骤一中巯基化石墨烯为2重量份，亚硝基叔丁酯为0.5重量份，二甲基亚砜为10重量份；所述步骤四中HEPES为10重量份，4-巯基苯硼酸为1重量份。
进一步，所述步骤二、步骤三和步骤五中的离心处理工艺参数为：离心转速为10000～15000r/min，离心时间为60～90min。
进一步，所述步骤二、步骤三和步骤五中的离心处理工艺参数为：离心转速为11000r/min，离心时间为90min。
进一步，所述步骤五中得到的光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料呈片状，片层厚度为1.0～1.4nm，粒径为350-450nm。
由上述的制备方法得到的光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料在多重耐药革兰阴性杆菌皮肤感染中的应用。
进一步，所述皮肤感染为皮肤创面感染或皮下脓肿。
本发明与现有技术相比具有如下有益效果。
1、本发明通过选择巯基化石墨烯，与亚硝基叔丁酯和二甲基亚砜反应形成亚硝基硫醇，然后基于巯基易氧化的特性，通过巯基的氧化形成二硫键，接枝硼酸基团，得到光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料。通过其接枝改性的苯硼酸分子特异性地与细菌表面的脂蛋白结合，靶向粘附细菌。在近红外光照射下，光热剂石墨烯可以将光能转化为热能，升高温度，使细菌裂解死亡；同时，温度升高，亚硝基硫醇的S-N键断裂，释放出光谱杀菌剂NO，以亚硝基硫醇作为NO纳米供体，实现NO在感染部位的可控、持续释放。选择巯基化石墨烯作为光热剂和载体，并接枝NO供体和苯硼酸靶向分子，得到了光热与化疗协同作用的靶向抗菌材料，提高了材料的抗菌效率。
2、本发明的制备方法条件温和，操作简单。
3、本发明的功能化石墨烯纳米材料具有协同、靶向、高效杀菌多重功能，同时能够促进血管再生和创面愈合，具有良好的生物相容性和较小的毒副作用。
附图说明
图1是本发明实施例八制得的光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的透射电子显微镜照片；
图2是本发明实施例八制得的光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的原子力显微镜照片；
图3；是本发明实施例八制得的光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的光热性能图；
图4是本发明实施例八制得的光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的NO 可控性释放性能图；
图5是本发明实施例八制得的光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的细胞相容性实验的结果统计图；
图6是本发明实施例八制得的光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的多重耐药铜绿假单胞菌抗菌实验的典型平板培养图；
图7是本发明实施例八制得的光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的多重耐药铜绿假单胞菌抗菌实验的数据统计图；
图8是本发明实施例八制得的光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的动物皮肤创面多重耐药革兰阴性杆菌感染治疗效果测试的创面照片；
图9是本发明实施例八制得的光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的动物皮肤创面多重耐药革兰阴性杆菌感染治疗效果测试的愈合率统计图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作详细说明。
原料来源：巯基化石墨烯购买自南京先丰纳米材料科技有限公司，亚硝基叔丁酯、二甲基亚砜、HEPES和4-巯基苯硼酸购买自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。
实施例一，一种光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的制备方法，其包括如下步骤。
步骤一，将2mg巯基化石墨烯、0.5mg的亚硝基叔丁酯和5ml二甲基亚砜均匀混合，室温避光静置12h，得到混合液。
步骤二，对混合液进行离心处理，离心转速为11000r/min，离心时间为90min，取底部沉淀物去除上清液，得到产物。
步骤三，采用去离子水反复洗涤产物三次，去除上清液，然后进行离心处理，离心转速为11000r/min，离心时间为90min。
步骤四，将步骤三得到的产物以15ml的HEPES重悬，得到悬液A，向悬液A中加入1mg的4-巯基苯硼酸，室温条件下搅拌12h，得到悬液B。
步骤五，对悬液B进行离心处理，离心转速为11000r/min，离心时间为90min，使用去离子水洗涤三次，得到光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料。
实施例二，一种光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的制备方法，其包括如下步骤。
步骤一，将4mg巯基化石墨烯、0.5mg的亚硝基叔丁酯和5ml二甲基亚砜均匀混合，室温避光静置12h，得到混合液。
步骤二，对混合液进行离心处理，离心转速为13000r/min，离心时间为80min，取底部沉淀物去除上清液，得到产物。
步骤三，采用去离子水反复洗涤产物三次，去除上清液，然后进行离心处理，离心转速为13000r/min，离心时间为60min。
步骤四，将步骤三得到的产物以15ml的HEPES重悬，得到悬液A，向悬液A中加入1mg的4-巯基苯硼酸，室温条件下搅拌12h，得到悬液B。
步骤五，对悬液B进行离心处理，离心转速为13000r/min，离心时间为90min，使用去离子水洗涤三次，得到光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料。
实施例三，一种光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的制备方法，其包括如下步骤。
步骤一，将4mg巯基化石墨烯、1mg的亚硝基叔丁酯和10ml二甲基亚砜均匀混合，室温避光静置14h，得到混合液。
步骤二，对混合液进行离心处理，离心转速为11000r/min，离心时间为60min，取底部沉淀物去除上清液，得到产物。
步骤三，采用去离子水反复洗涤产物三次，去除上清液，然后进行离心处理，离心转速为11000r/min，离心时间为60min。
步骤四，将步骤三得到的产物以15ml的HEPES重悬，得到悬液A，向悬液A中加入4mg的4-巯基苯硼酸，室温条件下搅拌12h，得到悬液B。
步骤五，对悬液B进行离心处理，离心转速为11000r/min，离心时间为60min，使用去离子水洗涤三次，得到光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料。
实施例四，一种光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的制备方法，其包括如下步骤。
步骤一，将2mg巯基化石墨烯、1mg的亚硝基叔丁酯和20ml二甲基亚砜均匀混合，室温避光静置14h，得到混合液。
步骤二，对混合液进行离心处理，离心转速为11000r/min，离心时间为70min，取底部沉淀物去除上清液，得到产物。
步骤三，采用去离子水反复洗涤产物三次，去除上清液，然后进行离心处理，离心转速为11000r/min，离心时间为70min。
步骤四，将步骤三得到的产物以25ml的HEPES重悬，得到悬液A，向悬液A中加入10mg的4-巯基苯硼酸，室温条件下搅拌12h，得到悬液B。
步骤五，对悬液B进行离心处理，离心转速为11000r/min，离心时间为70min，使用去离子水洗涤三次，得到光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料。
实施例五，一种光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的制备方法，其包括如下步骤。
步骤一，将3mg巯基化石墨烯、0.5mg的亚硝基叔丁酯和5ml二甲基亚砜均匀混合，室温避光静置14h，得到混合液。
步骤二，对混合液进行离心处理，离心转速为10000r/min，离心时间为65min，取底部沉淀物去除上清液，得到产物。
步骤三，采用去离子水反复洗涤产物三次，去除上清液，然后进行离心处理，离心转速为10000r/min，离心时间为65min。
步骤四，将步骤三得到的产物以25ml的HEPES重悬，得到悬液A，向悬液A中加入3mg的4-巯基苯硼酸，室温条件下搅拌12h，得到悬液B。
步骤五，对悬液B进行离心处理，离心转速为10000r/min，离心时间为65min，使用去离子水洗涤三次，得到光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料。
实施例六，一种光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的制备方法，其包括如下步骤。
步骤一，将4mg巯基化石墨烯、0.5mg的亚硝基叔丁酯和10ml二甲基亚砜均匀混合，室温避光静置14h，得到混合液。
步骤二，对混合液进行离心处理，离心转速为15000r/min，离心时间为90min，取底部沉淀物去除上清液，得到产物。
步骤三，采用去离子水反复洗涤产物三次，去除上清液，然后进行离心处理，离心转速为15000r/min，离心时间为90min。
步骤四，将步骤三得到的产物以15ml的HEPES重悬，得到悬液A，向悬液A中加入5mg的4-巯基苯硼酸，室温条件下搅拌12h，得到悬液B。
步骤五，对悬液B进行离心处理，离心转速为15000r/min，离心时间为90min，使用去离子水洗涤三次，得到光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料。
实施例七，一种光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的制备方法，其包括如下步骤。
步骤一，将2mg巯基化石墨烯、0.5mg的亚硝基叔丁酯和20ml二甲基亚砜均匀混合，室温避光静置12h，得到混合液。
步骤二，对混合液进行离心处理，离心转速为15000r/min，离心时间为90min，取底部沉淀物去除上清液，得到产物。
步骤三，采用去离子水反复洗涤产物三次，去除上清液，然后进行离心处理，离心转速为15000r/min，离心时间为90min。
步骤四，将步骤三得到的产物以10ml的HEPES重悬，得到悬液A，向悬液A中加入1mg的4-巯基苯硼酸，室温条件下搅拌12h，得到悬液B。
步骤五，对悬液B进行离心处理，离心转速为15000r/min，离心时间为90min，使用去离子水洗涤三次，得到光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料。
实施例八，一种光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的制备方法，其包括如下步骤。
步骤一，将2mg巯基化石墨烯、0.5mg的亚硝基叔丁酯和10ml二甲基亚砜均匀混合，室温避光静置12h，得到混合液。
步骤二，对混合液进行离心处理，离心转速为11000r/min，离心时间为90min，取底部沉淀物去除上清液，得到产物。
步骤三，采用去离子水反复洗涤产物三次，去除上清液，然后进行离心处理，离心转速为11000r/min，离心时间为90min。
步骤四，将步骤三得到的产物以10ml的HEPES重悬，得到悬液A，向悬液A中加入1mg的4-巯基苯硼酸，室温条件下搅拌12h，得到悬液B。
步骤五，对悬液B进行离心处理，离心转速为11000r/min，离心时间为90min，使用去离子水洗涤三次，得到光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料。
实施例九，对实施例八制得的光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料进行形貌结构观察，使用透射电子显微镜及原子力显微镜观察，参见图1和图2，该材料呈薄片状，平均厚度为1.4nm，长度为400nm。
实施例十，对实施例八制得的光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料进行光热性能测试，取200μL浓度分别为0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL的功能化石墨烯靶向杀菌材料加入到96孔板中，并在808nm激光照射下，每隔50秒记录相应孔板中液体温度，总测试时间600秒。结果参见图3，随着激光照射时间的延长，功能化石墨烯靶向杀菌材料的浓度越高，其温度升高的越快，表明了制得的功能化石墨烯靶向杀菌材具有较好的光热性能。
实施例十一，测试实施例八制得的光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的NO可控性释放性能，实验分组：无激光组，间歇激光组和连续激光组。无激光组，在96孔板中加入200μL的功能化石墨烯靶向杀菌材料，整个实验过程中不采用808nm激光照射。间歇激光组，在96孔板中加入200μL的功能化石墨烯靶向杀菌材料，整个实验过程中采用5分钟不加激光照射和30秒激光照射的循环照射过程。连续激光组，在96孔板中加入200μL的功能化石墨烯靶向杀菌材料，整个实验过程中持续照射808nm激光。最后采用 Griesss试剂分别测试各孔中液体NO的含量。结果参见图4，无激光照射时，NO的释放量很少；在间隙激光照射下，当进入30秒激光照射时，NO释放量徒增；在连续激光照射下，能够稳定、持续地释放NO。
实施例十二，对实施例八制得的光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料进行细胞相容性检测实验。
进行实验分组：将实施例八制得的光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料溶于溶剂中，得到浓度为50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL的溶液；对照组：无菌PBS 缓冲液。
实验步骤：在96孔培养板中接种适量小鼠3T3细胞(100μL/孔)，将培养板在培养箱中培养至细胞贴壁，培养环境：温度为37℃以及5％CO2。以不同浓度功能化石墨烯靶向杀菌材料为实验组，以无菌PBS缓冲液为对照组，以不含细胞的空白孔为空白对照。在培养板不同培养孔中分别加入不同浓度功能化石墨烯靶向杀菌材料及无菌PBS缓冲液，继续培养1天、3天、5天。向每孔中加入10μL的CCK8试剂，培养4h后，以酶标仪测定450nm 吸光度。按照公式计算细胞存活率，并绘制柱状图，所述公式为：
细胞存活率(％)＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％，其中As为实验孔，Ac为对照孔，Ab为空白孔。
参见图5，所示光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的细胞相容性实验结果统计，细胞活性检测显示实验组与对照组无明显差异，表明了功能化石墨烯靶向杀菌材料未引起明显细胞毒性，具有较好的细胞相容性。
实施例十三，将实施例八制得的光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料以标准平板计数法进行多重耐药鲍曼不动杆菌、多重耐药肺炎克雷伯菌及多重耐药铜绿假单胞菌光热靶向杀菌性能检测。
将菌株置于培养基中，在温度为37℃、转速为220rpm的条件下摇动过夜，预培养到指数生长期。然后，将经过洗涤的细菌细胞重悬于无菌PBS缓冲液中，得到菌液，并将600nm处光密度调节至0.4～0.5，大致对应于菌液浓度107-108CFU/mL。
进行实验分组，实验组为实施例八制得的光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料；对照组包括巯基化石墨烯混悬液、无菌PBS缓冲液和空白对照组。取上述菌液800μL，分别加入200μL的功能化石墨烯靶向杀菌材料、巯基化石墨烯混悬液和无菌PBS缓冲液，并使功能化石墨烯靶向杀菌材料和巯基化石墨烯混悬液的最终浓度为0.2mg/mL。在温度为 37℃的条件下震荡30分钟，然后将上述混合液以无菌PBS缓冲液反复洗涤3次，并以1mL 无菌PBS缓冲液重悬。再以808nm、0.5W/cm2的近红外激光照射上述重悬液10分钟。而后，将处理后的细菌混悬液适当稀释，取等量菌液均匀涂布于LB琼脂平板上，以未经处理的菌液涂板作为空白对照组，在温度为37℃的条件下孵育18h后进行菌落计数，从而估计治疗对细菌的杀伤程度，按如式计算细菌活力损失：
细菌杀灭率(％)＝[1－(空白对照计数－实验组计数)/空白对照计数]×100％。
参见图6和图7，结果表明：与巯基化石墨烯相比，合成的功能化石墨烯靶向杀菌材料对多重耐药鲍曼不动杆菌、多重耐药肺炎克雷伯菌及多重耐药铜绿假单胞菌都具有良好的光热杀菌能力，功能化石墨烯靶向杀菌材料能够靶向结合细菌，从而实现对细菌的光热杀伤作用。
实施例十四，对实施例八制得的光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料进行动物皮肤创面多重耐药革兰阴性杆菌感染治疗效果测试。
BALB/C小鼠(购自第三军医大学实验动物中心)皮肤多重耐药革兰阴性杆菌感染创面模型制备方法如下：小鼠予1％戊巴比妥钠腹腔注射(100mg/kg，0.01mL/g)麻醉。手术前 1天仔细取出每只小鼠的背部毛发，暴露的皮肤用75％(v/v)乙醇灭菌，然后冲压成直径为6mm圆形的全层缺损伤口。将50μL、菌液浓度为108CFU/mL的多重耐药铜绿假单胞菌滴于全层缺损伤口，并以无菌伤口贴膜覆盖。
进行实验分组，实验组：功能化石墨烯靶向杀菌材料；对照组：巯基化石墨烯和无菌 PBS缓冲液。
术后24小时将无菌PBS缓冲液或100μL浓度为0.2mg/mL功能化石墨烯纳米材料注射于感染创面，注射后6小时予808nm、0.5W/cm2激光照射10分钟。将直径为6mm的无菌圆形标记放置在每个感染伤口的旁边，并使用数码相机立即拍摄伤口，无菌圆形标记用于表示初始伤口面积。更换伤口敷料，并在术后第1，3，5和7天拍照伤口，使用Image Pro Plus 6.0软件仔细追踪每个伤口和标记的边缘，并计算包含跟踪区域的像素数，然后将像素数转换为平方毫米，伤口使用公式计算创面愈合率，所述公式为：
愈合率＝(原始创面面积－残余创面面积)/原始创面面积
参见图8和图9，结果表明：功能化石墨烯靶向杀菌材料能有效治疗皮肤创面多重耐药革兰阴性杆菌感染，从而促进创面愈合，缩短了愈合时间。

Claims (5)

1.一种光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，将1~5重量份巯基化石墨烯、0.5重量份的亚硝基叔丁酯和5~20重量份二甲基亚砜均匀混合，室温避光静置12~14h，得到混合液；
步骤二，对混合液进行离心处理，取沉淀去除上清液，得到产物；
步骤三，采用去离子水洗涤产物，然后进行离心处理；
步骤四，将步骤三得到的产物以5~20重量份HEPES重悬，得到悬液A，向悬液A中加入1~5重量份4-巯基苯硼酸，室温条件下搅拌12~14h，得到悬液B；
步骤五，对悬液B进行离心处理，使用去离子水洗涤，得到光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料。
2.根据权利要求1所述的光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的制备方法，其特征在于：所述步骤一中巯基化石墨烯为2重量份，亚硝基叔丁酯为0.5重量份，二甲基亚砜为10重量份；
所述步骤四中HEPES为10重量份，4-巯基苯硼酸为1重量份。
3.根据权利要求1或2所述的光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的制备方法，其特征在于：所述步骤二、步骤三和步骤五中的离心处理工艺参数为：离心转速为10000~15000r/min，离心时间为60~90min。
4.根据权利要求3所述的光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的制备方法，其特征在于：所述步骤二、步骤三和步骤五中的离心处理工艺参数为：离心转速为11000r/min，离心时间为90min。
5.根据权利要求1或2所述的光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的制备方法，其特征在于：所述步骤五中得到的光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料呈片状，片层厚度为1.0~1.4nm，粒径为350-450nm。
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