CN113109265A - 一种细菌光热检测试剂、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种细菌光热检测试剂、试剂盒及检测方法。将MPBA功能化至AuNPs表面，MPBA包含两个官能团：可与Au结合的巯基基团，以及与细菌细胞壁中的肽聚糖共价结合的硼酸基团。当体系不存在细菌时，继续添加过量的MPBA可以通过形成环酯选择性地结合顺式二醇基团，引起MPBA‑AuNPs聚集，使溶液从红色转变为蓝色。而当体系中存在细菌时，将MPBA‑AuNPs固定在细菌表面，过量的MPBA引起AuNPs聚集不明显。由于聚集的和未聚集状态的AuNPs的光热转换效率不同，经激光器照射后，溶液产生的温度变化不同，通过普通数字温度计检测温度变化即可定量转化为对应细菌浓度。
Description
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种细菌光热检测试剂、试剂盒及检测方法。
背景技术
微生物的快速检测在食品安全、水环境监测、公共安全和医疗诊断等方面具有重要意义。传统的微生物检测的方法主要包括培养法、聚合酶链式反应（PCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA）等，但这些方法往往具有耗时、灵敏度低和特异性差或者需要专业的设备和专业人员的弊端。
而近年来，随着生命科学、物理学、分析化学、纳米科学以及信息科学和其他相关技术的发展，基于纳米材料的比色法在分析检测领域引起了极大的关注，但比色法的信号读取方式分为两种，一种基于肉眼的颜色判断，灵敏度较低；另一种需借助酶标仪或分光光度计，依赖于大型仪器的方式无法满足床旁检测简便、即时的需求。
基于便携式温度计的生物传感器在快速检测得到广泛讨论，但其在微生物检测领域应用较少，且已有的基于温度计的微生物检测方法操作繁琐。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种细菌光热检测试剂、试剂盒及检测方法。
本发明的第一方面，提供一种细菌光热检测试剂，其包含巯基苯硼酸（MPBA）修饰的纳米金颗粒。其中，MPBA具体可选择4-MPBA或3-MPBA。
进一步的，MPBA修饰的纳米金颗粒的制备为：用柠檬酸盐还原法合成胶体金纳米颗粒，得到柠檬酸根阴离子稳定的胶体金纳米颗粒混合体系，然后加入MPBA反应，得到MPBA修饰的纳米金颗粒。
进一步的，所加入的MPBA浓度为0.04 mM，加入MPBA后反应时间为20 min。
本发明的第二方面，提供一种细菌光热检测试剂盒，其包含试剂一、试剂二、激光器、温度检测装置；
所述试剂一为如上所述的细菌光热检测试剂；
所述试剂二包含MPBA。
进一步的，所述激光器可形成照射功率为1 W/cm2的激光。
本发明的第三方面，提供一种细菌光热检测方法，包括以下步骤：
（1）将如权利要求1-3任一项所述的细菌光热检测试剂与待测溶液反应；
（2）在步骤（1）反应结束后的体系中加入MPBA，进行反应；
（3）将步骤（2）反应结束后的体系用激光照射，并使用温度检测装置监测温度变化。
进一步的，步骤（1）中，反应的时间为15-45min。
进一步的，步骤（2）中，MPBA加入的浓度为0.5 mM，反应时间为30 min。
进一步的，步骤（3）中，激光照射采用激光器照射功率的1 W/cm2，照射时间3 min。
本发明的有益效果如下：本发明将MPBA功能化至AuNPs表面，MPBA包含两个官能团：可与Au结合的巯基基团，以及与细菌细胞壁中的肽聚糖共价结合的硼酸基团。当体系不存在细菌时，继续添加过量的MPBA（50 μM）可以通过形成环酯选择性地结合顺式二醇基团，中和斥力从而引起MPBA-AuNPs聚集，使溶液从红色转变为蓝色。而当体系中存在细菌时，MPBA-AuNPs将通过共价键与细菌细胞壁上存在的多糖的顺式-二醇基团结合，从而将MPBA-AuNPs固定在细菌表面，过量的MPBA引起AuNPs聚集不明显。由于聚集的和未聚集状态的AuNPs的光热转换效率不同，经激光器照射后，溶液产生的温度变化不同，通过普通数字温度计检测温度变化即可定量转化为对应细菌浓度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
图1 为基于4-MPBA诱导纳米金聚集的细菌光热检测原理图；
图2为4-MPBA诱导纳米金聚集体系的可行性验证；（A）-（D）分别为4-MPBA-AuNPs、4-MPBA-AuNPs+E.coli O157:H7、4-MPBA-AuNPs+过量4-MPBA和4-MPBA-AuNPs+E.coliO157:H7+过量4-MPBA的透射电镜图像（TEM）；（E）为经激光照射后对应温度上升值图像；（F）为UV-vis中吸光度的变化；
图3为基于4-MPBA诱导纳米金聚集体系反应条件的优化；激光器照射功率（A）和时间（B），4-MPBA功能化浓度和时间（C），细菌与4-MPBA-AuNPs体系孵育时间（D），过量4-MPBA聚集浓度（E）及时间（F）；
图4为大肠杆菌的检测性能。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
以下实施例中所使用的材料及来源如下：氯金酸购自上海麦克林生化科技有限公司。柠檬酸三钠和4-巯基苯硼酸购自Sigma-Aldrich（美国）。碳酸氢铵购自阿拉丁化学有限公司。实验用水均为超纯水，电导率为18.2 MΩ cm。
以下实施例中所使用的仪器如下：多功能酶标仪（SpectraMax iD3，美谷分子仪器有限公司，上海）、高速冷冻离心机（5417 R 型，Eppendorf，德国）、集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S型，上海力辰邦西仪器科技有限公司）、红外光热检测平台（MW-GX-660/2000MW，长春镭仕光电科技有限公司），紫外可见光谱分析仪（凌析 V-3000，上海凌析仪器有限公司）、便携式温度计（榛利GL637，福州榛利机光电科技有限公司）、JEM-2100F高分辨透射电子显微镜（JEM-2100F，日本东京）等。
实施例1： 4-MPBA-AuNP的合成
胶体金纳米颗粒用柠檬酸盐还原法合成，具体过程如下：在剧烈搅拌下，通过油浴将100 mL HAuCl4（0.01％ w/w）溶液加热至120℃，然后将10 mL 38.8 mM柠檬酸三钠快速加入上述溶液中。溶液的颜色从浅黄色变为无色，最后呈酒红色，持续加热15分钟后停止加热，继续搅拌至溶液冷却至室温（〜2 h）。通过在4℃下以5,000 rpm离心30分钟获得产物，并将其重新分散在缓冲溶液（10 mM NH4HCO3）中，得到柠檬酸根阴离子稳定的AuNPs混合体系，4°C保存备用。
将4-MPBA（0.004 mM）添加到柠檬酸根阴离子稳定的AuNPs混合体系中，制备4-MPBA-AuNPs。
实施例2：利用AuNPs的光热效应进行细菌检测
实验所用的大肠杆菌O157：H7（E. coli O157：H7）为本实验室保存菌株，使用Luria-Bertani（LB）液体培养基（胰蛋白胨1%，氯化钠1%，酵母提取物0.5%，水100 mL）培养，单个菌落在恒温摇床下（250 rpm，37℃）培养至对数期（6-12 h）。然后，以4000 rpm离心5分钟，去离子水洗涤三次，使用缓冲溶液（10 mM NH4HCO3）将细菌稀释至不同浓度（101-109cfu/mL）。
将1 mL新制备的4-MPBA-AuNPs溶液与不同浓度的大肠杆菌混合，在室温下反应适当的时间（30 min）。然后，通过添加过量的4-MPBA（0.05 mM）以诱导4-MPBA-AuNPs聚集。将混合溶液用激光（660 nm，1 W/cm2）照射3分钟，并使用数字温度计监测温度变化。
本实施例提供一种基于4-MPBA诱导纳米金聚集的细菌光热检测方法，其原理如图1所示，首先，将4-MPBA功能化至AuNPs表面，4-MPBA包含两个官能团：可与Ag或Au结合的巯基基团，以及与细菌细胞壁中的肽聚糖共价结合的硼酸基团。当体系不存在细菌时，继续添加过量的4-MPBA（50 μM）可以通过形成环酯选择性地结合顺式二醇基团，中和斥力从而引起4-MPBA-AuNPs聚集，使溶液从红色转变为蓝色。而当体系中存在细菌时，4-MPBA-AuNPs将通过共价键与细菌细胞壁上存在的多糖的顺式-二醇基团结合，从而将4-MPBA-AuNPs固定在细菌表面，过量的4-MPBA引起AuNPs聚集不明显。由于聚集的和未聚集状态的AuNPs的光热转换效率不同，经功率为1.0 W/cm2的660 nm激光器照射3分钟后，溶液产生的温度变化不同，通过普通数字温度计检测温度变化即可定量转化为对应细菌浓度。
如图2（A）-（E）所示，分散状态的4-MPBA-AuNPs，及其与细菌结合引起的温度上升均不显著，而加入过量4-MPBA后，引起温度剧烈上升，此时当体系中存在细菌时，温度上升受到抑制。由此证实本研究具有可行性。通过图2F中的UV-vis中吸光度的变化进一步验证温度变化。
实施例3：基于4-MPBA诱导纳米金聚集的细菌光热检测方法的条件优化
对激光器照射功率和时间、4-MPBA功能化浓度和时间、细菌与4-MPBA-AuNPs体系反应时间、过量4-MPBA聚集浓度及时间进行优化，如图3所示，其最优检测条件为激光器照射功率1 W/cm2，照射时间3 min，4-MPBA功能化浓度和时间为0.04 mM,20 min，细菌与4-MPBA-AuNPs体系反应时间为30 min，过量4-MPBA聚集浓度和时间为0.5 mM，30 min。
优化后的最优检测条件下，对E. coli O157:H7进行检测。如图4A所示，当细菌浓度低于107 cfu / mL时，由于颜色相似，肉眼很难区分不同浓度的样品。而通过我们的光热检测法，E. coli O157:H7线性检测范围可扩增至105 cfu/mL-109 cfu/mL，最低检测限为1.97×104 cfu/mL，比肉眼比色法提高约三个数量级。
实施例4：试样检测
使用过滤后的自来水，稀释的牛奶和血液作为模拟样品，其中加入浓度为109 cfu/mL的E. coli O157:H7，使用上述检测流程对其进行检测。如表1所示，大肠杆菌回收率范围为97.14%-104.20%，由此证实该方法具有潜在的实际应用价值。
表1 大肠杆菌O157:H7在自来水，牛奶和血液样本中的回收率
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
Claims (9)
1.一种细菌光热检测试剂，其特征在于：其包含MPBA修饰的纳米金颗粒。
2.根据权利要求1所述的细菌光热检测试剂，其特征在于：MPBA修饰的纳米金颗粒的制备为：用柠檬酸盐还原法合成胶体金纳米颗粒，得到柠檬酸根阴离子稳定的胶体金纳米颗粒混合体系，然后加入MPBA反应，得到MPBA修饰的纳米金颗粒。
3. 根据权利要求2所述的细菌光热检测试剂，其特征在于：所加入的MPBA浓度为0.04mM，加入MPBA后反应时间为20 min。
4.一种细菌光热检测试剂盒，其特征在于：其包含试剂一、试剂二、激光器、温度检测装置；
所述试剂一为如权利要求1-3任一项所述的细菌光热检测试剂；
所述试剂二包含MPBA。
5. 根据权利要求4所述的细菌光热检测试剂盒，其特征在于：所述激光器可形成照射功率为1 W/cm2的激光。
6.一种细菌光热检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将如权利要求1-3任一项所述的细菌光热检测试剂与待测溶液反应；
（2）在步骤（1）反应结束后的体系中加入MPBA，进行反应；
（3）将步骤（2）反应结束后的体系用激光照射，并使用温度检测装置监测温度变化。
7.根据权利要求6所述的细菌光热检测方法，其特征在于：步骤（1）中，反应的时间为15-45min。
8. 根据权利要求6所述的细菌光热检测方法，其特征在于：步骤（2）中，MPBA加入的浓度为0.5 mM，反应时间为30 min。
9. 根据权利要求6所述的细菌光热检测方法，其特征在于：步骤（3）中，激光照射采用激光器照射功率的1 W/cm2，照射时间3 min。
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