CN112301106A - 具有光热响应的DNA修饰的金纳米颗粒的DNA-AuNP探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有光热响应的DNA修饰的金纳米颗粒的DNA‑AuNP探针及其制备方法和应用，该探针由具有光热响应的金纳米颗粒表面修饰DNA寡核苷酸构建而成，所述DNA寡核苷酸为介导DNA‑AuNP探针与靶标核酸分子的特异性识别与结合的核酸扩增引物。本发明的DNA‑AuNP探针具有金纳米颗粒的光热响应特性，能将光能转化为热能，以此介导探针对靶标核酸的识别，并在特定的等温扩增体系下，实现核酸样品的快速扩增，同时对核酸样品的扩增具有良好的特异性和的准确性，操作方便快捷，不仅适用于医院及实验室条件，也适用于设备有限的场所的核酸可视化检测。
Description
技术领域
本发明涉及体外核酸检测探针，具体涉及一种具有光热响应的DNA修饰的金纳米颗粒的DNA-AuNP探针及其制备方法和应用。
背景技术
金属纳米粒子(NPs)因其独特的理化性质而备受关注。NPs在纳米尺度具有光学、电子、磁性、机械、催化等特性，使其在生物医学诊疗和体外诊断方面具有广泛的应用价值。金属纳米颗粒的研究，尤其是对其形貌可控的制备及其相关性质的应用，一直是材料科学以及相关领域的前沿热点。金属纳米颗粒如棒、线、管及核壳结构相继被合成，其各种性质不仅依赖于尺寸，还依赖于拓扑结构、电子结构。其中金纳米颗粒(AuNP)是最受关注的一类。金纳米颗粒因具有合成简单、化学性能稳定、易于功能化、较好的光学性能、可重复使用，以及不影响生物物质的活性等特殊的物理化学性质和生物相容性，目前已应用于金标法等免疫测定，其进一步应用受到广泛的关注。
聚合酶链式反应(PCR)是一种用于扩增特定核酸片段的分子生物学技术。常用PCR技术有实时荧光定量PCR(qPCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、反向PCR (inverse PCR)等，该技术目前已经发展到第三代技术阶段。在基本的PCR扩增体系中包含待测核酸样品、聚合酶、dNTP、缓冲液等成分。PCR扩增体系借助热循环仪，在设定的程序下，通过不断变化温度，实现变性、退火、延伸等过程，完成一个扩增循环，并不断重复上述循环，实现指数级目标核酸片段的扩增。双链经特异性荧光标记，可以在凝胶电泳、荧光光谱仪下实现检测。PCR技术可以通过核酸扩增引物的识别与结合，特异性扩增目标核酸片段，实现对病原微生物的检测、对遗传病、癌症的早期检测和筛查。因此，PCR技术在基因工程、细胞工程、体外分子诊断等各类生物医学研究中被广泛应用，其已经成为生物医学研究中必不可少的工具之一。
由于PCR反应条件以及结果检测方法的限制，目前的PCR技术多使用荧光作为最终的输出信号。但是，由于荧光分子的双链结合特异性还有待提高，且荧光检测过程复杂、成本高，使PCR技术的适用范围通常限定于特定领域的技术人员和特定场所中，如科学实验室、医院检验科等，在资源匮乏的场景下难以得到有效应用。与此同时，由于该技术依赖于热循环仪和荧光检测设备(如凝胶成像系统、定量PCR仪等)，存在实验时间长、场所受限等问题。
发明内容
发明的目：针对现有核酸检测的扩增技术和信号输出技术存在的问题，本发明提供一种具有光热响应的DNA修饰的金纳米颗粒的DNA-AuNP探针，该探针可以实现了对核酸样品的快速扩增和可视化检测。解决了对昂贵PCR仪的依赖，降低检测成本的同时，简化了核酸检测步骤和提升了输出信号的可读性。
本发明还提供所述具有光热响应的DNA修饰的金纳米颗粒的DNA-AuNP 探针的其制备方法和应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种具有光热响应的DNA修饰的金纳米颗粒的DNA-AuNP探针，所述探针包括正向纳米探针DNA-AuNP-F与反向纳米探针DNA-AuNP-R，分别由具有光热响应的金纳米颗粒，在其表面修饰DNA寡核苷酸链构建而成，所述DNA寡核苷酸链为介导DNA-AuNP探针与靶标核酸分子的特异性识别与结合的核酸扩增引物。
其中，所述DNA寡核苷酸为PCR扩增所需的核酸扩增引物，其模式序列为 5’-SH-X-3’-OH，其中5’端为巯基修饰端，3’端为未修饰端，X为检测靶标核酸分子所用特异性核酸扩增引物序列。
其中，所述探针由具有光热响应的两种DNA-AuNP探针组成，由正向DNA 引物F和反向DNA引物R分别修饰在金纳米颗粒表面，获得正向纳米探针 DNA-AuNP-F与反向纳米探针DNA-AuNP-R。
作为优先，所述正向DNA引物F(SH-Primer-F)和反向DNA引物R (SH-Primer-R)分别为：5’-SH(C6)-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’； 5’-SH(C6)-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’。
其中修饰巯基SH，通过金巯键与金纳米颗粒连接，修饰C6间隔空间，便于探针的识别。
本发明所述的具有光热响应的DNA修饰的金纳米颗粒的DNA-AuNP探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)金纳米颗粒的制备
向预热后的去离子水中加入氯金酸溶液，加热搅拌下，加入柠檬酸三钠溶液；当溶液由淡黄色变成灰色后变成黑色，最终变为红色后，继续搅拌至颜色稳定；降低转速使溶液平衡至室温后过夜，得金纳米颗粒，4℃保存待用。
(2)金纳米颗粒的修饰
a.正向与反向DNA引物的活化
将将带巯基修饰的正向与反向DNA引物：Primer-F和Primer-R，平衡至室温后，各自加入活化液，室温孵育，还原二硫键，便于后续修饰使用；
b.正向与反向DNA引物的修饰
将金纳米颗粒溶液，分别与1活化后的SH-Primer-F和SH-Prime-R混合，随后分别加入PEG；置于混匀，室温避光静置；分别滴加Tris-醋酸溶液后，滴入NaCl溶液，室温避光静置；离心弃上清清洗重悬，获得正向纳米探针 DNA-AuNP-F和反向纳米探针DNA-AuNP-R，保存备用。
作为优选，所述步骤(1)中在100mL锥形瓶中，加入25mL去离子水90℃水浴加热10min再加入氯金酸；将锥形瓶转移至磁力搅拌器的加热板上，使用的锥形瓶及转子应用王水(HCl：HNO3＝3：1)浸泡30min，并用足量去离子水冲洗干净后使用。
作为优选，所述步骤(2)的a中所述活化液为：TCEP 10mM，乙酸钠50mM， pH 8.0的混合液。
本发明所述的具有光热响应的DNA修饰的金纳米颗粒的DNA-AuNP探针在核酸可视化扩增及检测中的应用。
其扩增体系如下：取提取的核酸样品(即靶标核酸序列)作为扩增模板，用量同常规PCR反应，随后将上述合成DNA-AuNP探针作为核酸扩增引物，依照以下扩增体系混合：
具体的，表1为所述核酸可视化扩增体系包含以下成分及浓度。
表1
| 试剂 | 体积(μL) | 终浓度 |
| 扩增缓冲液(2X) | 12.5 | 1X |
| Bst 3.0DNA聚合酶 | 1.0 | 0.32units/μL |
| 核酸提取样品 | 1.0 | - |
| 正向纳米引物 | 2.0 | 2.5nM |
| 反向纳米引物 | 2.0 | 2.5nM |
| 去离子水 | 6.5 | - |
其中所述的扩增缓冲液(2X)为：40mM Tris-HCl，300mM KCl，20mM (NH4)2SO4，4mMMgSO4，0.2％Tween-20，pH 8.8。
其中，所述核酸可视化扩增其扩增步骤和程序包括以下步骤：根据引物退火温度Tm值，将核酸可视化扩增体系置于55至65℃恒温条件下，使用波长为532 nm，强度为10-50mW/cm2的激光非连续照射可视化扩增体系，完成扩增反应，肉眼观察或用可见分光光度计检测核酸可视化扩增体系的颜色变化。将反应后的溶液进行琼脂糖凝胶电泳检测，可见扩增后的荧光条带，所得溶液颜色变浅即说明样品中存在目标核酸。
作为优选，所述激光非连续照射可视化扩增体系为激光照射程序以照射5-10 秒，暂停30-60秒，照射10-20秒为一个循环，重复30-45个循环。
本发明制备了一种具有光热响应的DNA修饰的金纳米颗粒的DNA-AuNP 探针。在核酸可视化扩增体系中，DNA-AuNP探针的DNA寡核苷酸链作为核酸扩增引物，介导DNA-AuNP探针与靶标核酸分子的特异性识别与结合； DNA-AuNP探针的金纳米颗粒作为光热纳米转换元件，在DNA-AuNP探针表面实现光热转换，为核酸扩增引物与靶标分子的结合提供热能；最终，基于扩增产物对DNA-AuNP探针的聚集作用，以及金纳米颗粒的光学特性，实现核酸可视化扩增及检测。
其中，DNA-AuNP探针中的金纳米颗粒在其特征吸收峰值对应的光照下吸收光能，转化为热能，为DNA寡核苷酸链与靶标核酸分子的特异性识别与结合提供能量。
本发明中还制备了一种稳定性高、粒径小而均一的金纳米颗粒，基于金纳米颗粒的DNA修饰，构建了DNA-AuNP探针，并将其运用到核酸可视化检测领域。本发明将金纳米颗粒光热响应性质与核酸等温扩增检测相结合，为核酸样品的扩增提供了一种新方法，同时实现了对核酸样品的快速扩增和可视化检测。因此，本发明提出了一种光热响应DNA修饰的金纳米颗粒的制备方法，还提供了一种核酸可视化扩增的应用方法，其原理如图1。
作为优选，所述的光热响应金纳米颗粒探针由特异性核酸扩增DNA引物和金纳米颗粒两部分组成。其中，反应所用的金纳米颗粒的粒径为13±2nm，光热响应最大吸收值为520±3nm；其所述修饰DNA引物序列5’端为巯基，用于DNA寡核苷酸链和金纳米颗粒的连接，紧接着为检测所用的特异性核酸扩增引物，其模式序列为：5’-SH-X-3’-OH，其中的X即为检测所用特异性核酸扩增引物序列，如图1所示。扩增反应所用AuNP-DNA探针分为两类：正向DNA 引物Primer-F修饰AuNP获得的正向纳米探针(DNA-AuNP-F)和反向DNA引物Primer-R修饰AuNP获得的反向纳米探针(DNA-AuNP-R)，如图1所示。本发明通过修饰在金纳米颗粒上的特异性核酸扩增引物在特定的光照强度和光照程序下，扩增靶标核酸序列后，将散布在溶液中的金纳米颗粒连接起来，从而改变了溶液宏观的颜色，如图1和图5。实现了核酸样品的快速、便捷检测的同时，检测结果的呈现更加直观。
本发明制备了光热响应的DNA-AuNP探针，用于样品中可能存在的微量核酸快速的扩增、可视化检测。本发明基于金纳米颗粒在特定波长光照下发生等离子共振，将光能转化为热能的特性，以此介导探针对靶标核酸的识别，并在特定的等温扩增体系下，实现核酸样品的快速扩增，建立了一个新的等温扩增体系，实现了脱离热循环仪的核酸快速的可视化扩增。同时对核酸样品的扩增具有良好的特异性和的准确性，较常规PCR检测方式操作更加简便，耗时更短，结果可视化。
此外，本发明利用金纳米颗粒的光热效应，为PCR扩增提供一个适宜的扩增温度，可以克服传统PCR扩增体系中反应混合物需要在不同温度间循环才能实现扩增的问题；再者，由于不同尺寸下金纳米颗粒具有等离子共振效应，可以产生不同的可见光吸收光谱，可以用于可视化检测。因此，借助金纳米颗粒的光热效应并结合其独特地依赖于尺寸的光学效应，就可以实现等温条件下核酸的可视化扩增。本发明光热响应纳米探针的制备和应用，将有助于推动可视化PCR 体系的构建，为现场、实时的高灵敏核酸扩增及检测提供重要的技术手段。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明制备了一种光热响应DNA-AuNP探针，其扩增前后溶液颜色产生变化，可对其扩增结果进行可视化的检测，提供了一种核酸扩增检测的可视化方法，实现了在核酸样品的快速、便捷检测的同时，令检测结果肉眼可见。
(2)本发明制备的一种光热响应DNA-AuNP探针能对特定波长的光照响应并且进行光热转换，降低了DNA扩增的能耗，提高了扩增效率。
(3)本发明制备的一种光热响应DNA-AuNP探针以及建立的扩增体系与传统的PCR程序相比，反应条件温和，不需要高温或变温反应，节省了时间及空间，表明该体系对于核酸检测应用领域有很大的利用价值。
(4)本发明制备的一种光热响应DNA-AuNP探针有助于研究DNA扩增体系的方法，适用于目标DNA片段的捕获及快捷检测，同时本发明制备的金纳米颗粒使用方便，节省时间，在进行特定修饰后对DNA片段的扩增有良好的特异性和准确性。本发明的DNA-AuNP探针可对当前核酸快速、可视化检测技术进行补充，是目前很多生物医学研究急需的方案，将会有很好的应用和市场前景。
(5)本发明的制备简单，操作简便，无需复杂和极端条件，使用不同核酸扩增引物即可应用于不同的核酸样品的快速扩增和可视化检测。不仅适用于医院及实验室条件，也适用于设备有限的场所，如现场取样条件下的核酸检测。
附图说明
图1为DNA-AuNP探针的制备及工作原理图；
图2为金纳米颗粒(AuNP)TEM图；
图3为DNA-AuNP探针PCR后TEM图；
图4为DNA-AuNP探针PCR后电泳图；
图5激光照射前后DNA-AuNP探针溶液颜色变化对比图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
实施例1
一种光热响应DNA-AuNP探针的制备方法及其内参基因Actin的扩增应用，包括以下步骤：
(1)金纳米颗粒的制备
在100mL锥形瓶中，加入25mL去离子水90℃水浴加热10min；将锥形瓶转移至磁力搅拌器加热板上，向去离子水中加入50μL0.5 M的氯金酸(HAuCl4) 溶液，加热至100℃；在最高转速1200rpm搅拌下，加入0.5mL0.2 M的柠檬酸三钠(Na3C6H5O7)溶液；当溶液由淡黄色变成灰色后变成黑色，最终变为红色后，继续搅拌10min至颜色稳定；降低转速500rpm令溶液平衡并室温过夜，得平均粒径13±2nm的金纳米颗粒胶体溶液，4℃保存待用，其TEM如图2所示。
(2)金纳米颗粒的修饰
本实施例合成的巯基修饰特异性核酸扩增引物为Actin基因特异性引物，引物序列如下所示：
Primer-F(SEQ ID NO.1)：
5’-SH(C6)-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’
Primer-R(SEQ ID NO.2)：
5’-SH(C6)-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’
a.特异性引物的活化
将100μM的Primer-F和Primer-R平衡至室温后，各取10μL Primer-F 和Primer-R，并各自加入2μL活化液，室温活化10min，待用。
b.DNA的修饰
将1mL的金纳米颗粒溶液分别与12μL活化后的Primer-F和Primer-R混合，随后分别加入100mM的PEG(MW 1000)100μL；置于100r/min摇床混匀2h，室温避光静置14h；两管分别滴加10μL 100mM Tris-醋酸溶液(pH 8.2)后，分六次滴入115μL(19.16μL/次)1M的NaCl溶液，室温避光静置24h；14000 rpm离心30min，弃上清；用TE Buffer清洗2-3次；最终重悬于250μL的TE Buffer中，获得正向纳米探针(DNA-AuNP-F)和反向纳米探针(DNA-AuNP-R)，于4℃保存备用。
其中，所述步骤(1)中使用的锥形瓶及转子应使用王水(HCl：HNO3＝3： 1，v/v)浸泡30min，并用足量去离子水冲洗干净后使用。
其中，所述步骤(2)的a中活化液为终浓度：TCEP 10mM，乙酸钠50mM， pH＝8.0的混合液。
(3)样品扩增：
具体方法：依照表1的扩增体系与扩增模板混合；使用恒温金属浴，55℃条件下，使用波长532nm的激光器照射扩增体系，激光强度为10mW/cm2，非连续照射，激光照射程序为：一个循环为(照射10s，暂停30s，照射20s)，重复30个循环，完成扩增反应。所得溶液肉眼观察颜色变浅(图5)，说明样品中存在目标核酸。将反应后的溶液使用浓度1％琼脂糖凝胶，在150V下电泳20min 检测，即可见Actin基因扩增后的荧光条带，大小约为295bp，符合预期片段大小。琼脂糖凝胶电泳检测结果如图4所示，扩增后TEM下观察金纳米颗粒间由扩增产物连接而改变其等离子共振效应，金纳米颗粒溶液颜色变浅或消失，如图 3所示。
综上，本发明制备了一种光热响应DNA-AuNP探针，其扩增前后溶液颜色产生变化，可对其扩增结果进行可视化的检测，提供了一种核酸扩增检测的可视化方法，实现了在核酸样品的快速、便捷检测的同时，令检测结果肉眼可见。同时与传统的PCR程序相比，反应条件温和，不需要高温或变温反应，节省了时间及空间，表明该体系对于核酸检测应用领域有很大的利用价值。
序列表
<110> 南京师范大学
<120> 具有光热响应的DNA修饰的金纳米颗粒的DNA-AuNP探针及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcacccacac tgtgcccatc tacga 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagcggaacc gctcattgcc aatgg 25
Claims (9)
1.一种具有光热响应的DNA修饰的金纳米颗粒的DNA-AuNP探针，其特征在于，所述探针包括正向纳米探针DNA-AuNP-F与反向纳米探针DNA-AuNP-R，分别由金纳米颗粒表面修饰DNA寡核苷酸构建而成，所述DNA寡核苷酸为介导DNA-AuNP探针与靶标核酸分子的特异性识别与结合的核酸扩增引物。
2.根据权利要求1所述的具有光热响应的DNA修饰的金纳米颗粒的DNA-AuNP探针，其特征在于，所述DNA寡核苷酸为PCR扩增所需的核酸扩增引物，包括正向DNA引物F和反向DNA引物R，其模式序列为5’-SH-X-3’-OH，其中5’端为巯基修饰端，X为检测靶标核酸分子所用特异性核酸扩增引物序列。
3.根据权利要求1所述的具有光热响应的DNA修饰的金纳米颗粒的DNA-AuNP探针，其特征在于，所述探针由具有光热响应的两种DNA-AuNP探针组成，具体包括由正向DNA引物F和反向DNA引物R并分别修饰在金纳米颗粒表面，获得正向纳米探针DNA-AuNP-F与反向纳米探针DNA-AuNP-R。
4.根据权利要求2或3所述的具有光热响应的DNA修饰的金纳米颗粒的DNA-AuNP探针，其特征在于，所述正向DNA引物F和反向DNA引物R分别为：5’-SH(C6)-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’；5’-SH(C6)-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’。
5.一种权利要求1-3所述的具有光热响应的DNA修饰的金纳米颗粒的DNA-AuNP探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)金纳米颗粒的制备
向预热后的去离子水中加入氯金酸溶液，加热并搅拌下，加入柠檬酸三钠溶液；当溶液由淡黄色变成灰色后变成黑色，最终变为红色后，继续搅拌至颜色稳定；随后使溶液平衡至室温后，过夜室温放置得到所需的金纳米颗粒溶液，保存待用。
(2)金纳米颗粒的修饰
a.正向与反向DNA引物的活化
将带巯基修饰的正向与反向DNA引物平衡至室温后，加入活化液，室温孵育，还原二硫键，便于后续修饰使用；
b.正向与反向DNA引物的修饰
将金纳米颗粒溶液，分别与活化后的正向与反向DNA引物混合，随后分别加入PEG；置于混匀，室温避光静置；分别滴加Tris-醋酸溶液后，滴入NaCl溶液，室温避光静置；离心弃上清后清洗重悬，获得正向纳米探针DNA-AuNP-F和反向纳米探针DNA-AuNP-R，保存备用。
6.一种权利要求1-3所述的具有光热响应的DNA修饰的金纳米颗粒的DNA-AuNP探针在核酸可视化扩增及检测中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述核酸可视化扩增体系包含以下成分及浓度：
其中所述的扩增缓冲液(2X)为：40mM Tris-HCl，300mM KCl，20mM(NH4)2SO4，4mM MgSO4，0.2％Tween-20，pH 8.8。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述核酸可视化扩增其扩增步骤和程序包括以下步骤：根据引物退火温度Tm值，将核酸可视化扩增体系置于55至65℃恒温条件下，使用波长为532nm，强度为10-50mW/cm2的激光非连续照射可视化扩增体系，完成扩增反应，肉眼观察或用可见分光光度计检测核酸可视化扩增体系的颜色变化。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述激光非连续照射可视化扩增体系为激光照射程序优选以照射5-10秒，暂停30-60秒，照射10-20秒为一个循环，重复30-45个循环。
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