CN113355455A

CN113355455A - 一种检测新型冠状病毒的荧光定量纳米粒子pcr的引物、引物探针组合及其应用

Info

Publication number: CN113355455A
Application number: CN202110560677.0A
Authority: CN
Inventors: 肖彩霞; 袁巧梅; 王涛
Original assignee: GBA National Institute for Nanotechnology Innovation
Current assignee: GBA National Institute for Nanotechnology Innovation
Priority date: 2021-05-21
Filing date: 2021-05-21
Publication date: 2021-09-07
Anticipated expiration: 2041-05-21
Also published as: CN113355455B

Abstract

本发明公开了一种检测新型冠状病毒的荧光定量纳米粒子PCR的引物、引物探针组合及其应用，所述引物的5’端修饰有纳米颗粒，所述纳米颗粒为导体或半导体纳米颗粒。本发明还提供了包含所述引物的引物探针组合及试剂盒，并提供了一种新型冠状病毒2019‑nCoV的非诊断目的的检测方法，使用所述引物探针组合，且利用含有激光加热装置的PCR仪进检测，其使用银纳米颗粒表面修饰的引物，以及使用特定波长激光加热进行快速升降温，可将qPCR扩增时间缩短为30min以内，而荧光定量PCR需要60～120min；其检测灵敏度低至1copy，较荧光定量PCR提高10倍，且荧光定量纳米粒子PCR能抑制与新型冠状病毒同源性较高病毒SARS的非特异扩增，提升体系的特异性。

Description

一种检测新型冠状病毒的荧光定量纳米粒子PCR的引物、引物探针组合及其应用

技术领域

本发明涉及检测技术领域，具体地，涉及一种检测新型冠状病毒的荧光定量纳米粒子 PCR的引物、引物探针组合及其应用。

背景技术

冠状病毒是一个大型病毒家族，新型冠状病毒肺炎(新冠肺炎，COVID-19)为2019年新发急性呼吸道传染病，而以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。感染该种病毒的人会出现程度不同的症状，有的只是发烧或轻微咳嗽，有的会发展为肺炎，有的则更为严重甚至死亡。多数致死案例与其共病密切相关，年龄越高的染病致死率也越高，男性患者的致死率高于女性患者。

按照《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》，实时荧光RT-PCR检测人新型冠状病毒核酸检测呈阳性是患者确诊的证据之一。实时荧光RT-PCR方法通常需要一个完整的扩增程序：变性、退火及延伸，即一个循环会经历3个不同的温度。由于目前荧光定量PCR仪器的加热方式多为半导体加热，组合金属导热模块，但缺点是升降温速度受限，导致完成一个 PCR检测需要2个小时左右，耗时长，这对疫情爆发期间的筛查是非常不利的。目前市场上为了解决该问题，主要有以下两个方案：第一个方案是采用其他方法学进行检测，如抗原-抗体胶体金检测、恒温PCR，虽然能将检测时间控制在30min以内，但是由于方法学的限制，会出现灵敏度低和特异性差的现象，导致检测结果不准确，这对疫情的防控存在极大的隐患；第二种方案是采用快速升降温的PCR仪器，但是该PCR仪器加热装置依然是金属材质，组合耗材方面的改进，从而实现快速升降温。而目前市场的快速PCR仪器完成一个PCR循环一般仍需30min～1h，仍没有控制在30min以内。

近年来，随着纳米材料的发展，研究发现纳米金属颗粒不仅能够调节DNA聚合酶的活性，高效启动DNA聚合酶，还能够提高PCR反应体系的导热性能。有研究表明，纳米颗粒具有较大的比表面积，吸收光源后可以转化为较大的热量进行辐射。也有研究指出，转化等离子体光热(PPT)热能，又称热等离子体效应，在纳米颗粒附近高度局域化，可作为稳定的原位热源进行可控、均匀的热加工。因此基于纳米材料的优良的导热性及等离子体效应，通过特定波长激光照射纳米颗粒，可使纳米颗粒快速加热。而将该属性应用到PCR循环中，可以使反应体系快速升温到目的温度，缩短在非目标温度的停留时间，不仅减少了非特异性扩增，还提高了反应的灵敏度。另外，也有报道指出纳米材料特异性修饰的引物可以吸附模板并降低由完全匹配和不匹配的引物形成的双链体的解链温度(Tm)，并增加了它们之间的Tm差异，从而增加体系的特异性。但是目前纳米PCR体系多为终点检测，譬如凝胶电泳检测，使用实时定量荧光检测的相对较少，主要原因为纳米颗粒会影响荧光信号的采集。目前实时荧光定量常用的荧光基团多为FAM、Cy5、HEX、VIC、 ROX等，但是该类荧光基团的激发波长范围在490nm～600nm之间，发射波长范围在 500nm～700nm之间，即激发波长和发射波长均处于可见光区。目前，文献报道中常用语纳米PCR的纳米颗粒为纳米金颗粒，特别是直径为12～13nm纳米金颗粒，其吸收波长在 530nm左右，将该纳米颗粒加入到PCR体系中，会影响荧光信号的采集，特别是FAM通道，金纳米颗粒的激发波长范围与FAM荧光基团的发射波长范围重叠，会对其有淬灭效果。因此限制了纳米PCR在实时荧光定量方面的应用。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种检测新型冠状病毒的荧光定量纳米粒子PCR的引物、引物探针组合及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种荧光定量纳米粒子PCR的引物。

本发明的第二个目的是提供一种检测新型冠状病毒2019-nCoV的荧光定量纳米粒子 PCR的引物探针组合。

本发明的第三个目的是提供一种检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒。

本发明的第四个目的是提供一种新型冠状病毒2019-nCoV的非诊断目的的检测方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

随着近年来新型纳米材料的发现，继而发现更加适合荧光定量PCR使用的纳米材料，即激发波长和发射波长在490nm～700nm之外(荧光基团占用的波长范围)，避免对荧光定量信号的采集。新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测体系为了确保检测的准确性，一般为多重PCR检测，目前检测靶基因为ORF1ab基因、N基因、E基因、S基因和M基因等。因此，建立特定纳米材料的新型冠状病毒2019-nCoV多重纳米PCR检测方法，不仅可以实现金标准qPCR的快速扩增，满足多重实时荧光定量检测，还能提高灵敏度和特异性，可为新型冠状病毒2019-nCoV的快速而精准的筛查提供实验方案。

因此本发明要求保护一种荧光定量纳米粒子PCR的引物，所述引物的5’端修饰有纳米颗粒，所述纳米颗粒为导体或者半导体纳米颗粒。

优选地，所述纳米颗粒的直径为1～200nm。

更优选地，所述纳米粒子的直径为1～50nm。

优选地，所述纳米颗粒的激发波长或者发射波长在490nm～700nm之外。

更优选地，所述纳米颗粒为银纳米颗粒。银纳米颗粒的激发波长为390nm。

进一步优选，所述纳米颗粒为直径为1～10nm银纳米颗粒。

优选地，所述引物的5’端通过Poly A与纳米颗粒连接。

更优选地，所述的Poly A长度为1～1000bp。

进一步优选地，所述的Poly A长度为1～200bp。

更优选地，所述Poly A的5’端修饰有疏基(-SH)，引物的5’端与polyA的3’端相连，而polyA的5’端通过疏基(-SH)与纳米粒子链接。

本发明进一步要求保护一种检测新型冠状病毒2019-nCoV的荧光定量纳米粒子PCR 的引物和探针组合，所述引物如上所述。

优选地，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1到4所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7到8所示。

更优选地，还含有核苷酸序列如SEQ ID NO：5到6所示的引物，核苷酸序列如SEQID NO：9所示的探针。

进一步优选地，各探针的3’端有猝灭荧光基团，各探针的5’端有不同的激发荧光基团。

进一步更优选地，所述猝灭荧光基团为BHQ2。

进一步更优选地，激发荧光基团为VIC、ROX、FAM、和Cy5的一种或几种。

本发明还要求保护所述的引物和探针组合在制备检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒中的应用。

具体地，要求保护一种检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒，含有所述的引物和探针组合。

优选地，所述试剂盒还包括阳性质控品、阴性质控品、Taq酶、M-MLV酶、RNasin酶、PCR Buffer和水，其中强阳性假病毒为阳性质控品，纯化水为和阴性质控品。

本发明还要求一种新型冠状病毒2019-nCoV的非诊断目的的检测方法，使用所述的引物探针组合。

本检测方法直接目的不是获得诊断结果或健康状况，而只是对已经脱离人体或动物体的组织、体液或排泄物进行处理或检测以获取作为中间结果的信息的方法，或处理该信息的方法。

优选地，利用所述引物进行荧光定量PCR。

更优选地，反应体系中，SEQ ID NO：1所示的引物、SEQ ID NO：2所示的引物和 SEQID NO：7所示的探针的摩尔比为1：1：0.8。

更优选地，反应体系中，SEQ ID NO：3所示的引物、SEQ ID NO：4所示的引物和 SEQID NO：8所示的探针的摩尔比为1：1：0.8。

更优选地，反应体系中，SEQ ID NO：5所示的引物、SEQ ID NO：6所示的引物和 SEQID NO：9所示的探针的摩尔比为1：1：0.8。

更优选地，反应体系中，各引物(10μmol/L)0.5μL、各探针(10μmol/L)0.4μL、Taq酶(5U/μL)0.4μL、M-MLV酶(200U/μL)0.2μL、RNasin酶(50U/μL)0.2μL、PCR Buffer 5×5μL、待测RNA5μL水，补水至25μL。

优选地，利用含有激光加热装置的PCR仪进检测，所述激光加热装置包括：恒温浴组件和激光光源组件，所述恒温浴组件在PCR反应中为循环过程中的退火和延伸步骤提供热量，所述恒温浴的温度为PCR反应中退火/延伸的温度，所述激光光源通过照射纳米颗粒，实现纳米颗粒周围微环境快速升温，从而提供PCR反应中热变性的温度。

更优选地，本激光加热模块的激光照射时间能够根据实验需求设定为0.1ms～5s，再优选地，0.1ms～2s。

更优选地，本纳米粒子PCR仪还含有多通道荧光采集装置，本加热装置结合PCR仪中的多通道荧光采集装置，实现多重实时荧光定量PCR的超快速检测。

更优选地，反应程序为：50℃5分钟；95℃1分钟；95℃2秒，55℃6秒，45个循环。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

①多重实时荧光定量纳米qPCR方法使用银纳米颗粒表面修饰的引物，以及使用特定波长激光加热进行快速升降温，可将qPCR扩增时间缩短为30min以内，而荧光定量PCR 需要60～120min；②使用银纳米颗粒特殊修饰引物的纳米qPCR体系，灵敏度低至1copy，较荧光定量PCR提高10倍，且荧光定量纳米粒子PCR能抑制与新型冠状病毒同源性较高病毒SARS的非特异扩增，提升体系的特异性。

附图说明

图1为加热装置示意图。

图2为银纳米粒子的吸收峰。

图3为金纳米粒子的吸收峰。

图4为实施例4检测梯度新型冠状假病毒的检测结果；假病毒的浓度依次为10³copies/rxn、10²copies/rxn、10¹copies/rxn和10⁰copies/rxn。

图5为对比例1检测梯度新型冠状假病毒的检测结果；假病毒的浓度依次为10³copies/rxn、10²copies/rxn、10¹copies/rxn和10⁰copies/rxn。

图6为对比例2检测梯度新型冠状假病毒的检测结果；假病毒的浓度依次为10³copies/rxn、10²copies/rxn、10¹copies/rxn和10⁰copies/rxn。

图7为实施例4的特异性检测；分别检测MERS假病毒和SARS假病毒的特异性结果。

图8为对照例1的特异性检测；分别检测MERS假病毒和SARS假病毒的特异性结果。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1一种荧光定量纳米粒子PCR仪

本纳米粒子PCR仪含有激光加热装置，该加激光热装置如图1所示，其包括：恒温浴组件和激光光源组件。其中恒温浴组件在PCR反应中为循环过程中的退火和延伸步骤提供热量，所述恒温浴的温度为PCR反应中退火/延伸的温度，所述激光光源通过照射纳米颗粒，实现纳米颗粒周围微环境快速升温，从而提供PCR反应中热变性的温度本激光加热模块的激光照射时间能够根据实验需求设定为0.1ms～5s之间调节。

本纳米粒子PCR仪还含有多通道荧光采集装置，本加热装置结合PCR仪中的多通道荧光采集装置，实现多重实时荧光定量PCR的超快速检测。

实施例2一种纳米粒子PCR反应的纳米粒子

纳米颗粒为激发波长或者发射波长在490nm～700nm之外的半导体纳米材料，本实施例选择激发波长为390nm的银纳米颗粒，其纳米颗粒的直径大小为10nm，以直径大小为10nm金纳米颗粒作为对照。

使用紫外-可见分光光度计进行紫外-可见吸收光谱的测试，具体见图2和图3，结果显示该纳米银颗粒的吸收波长在荧光基团的作用波长490nm～700nm之外(荧光基团的激发波长范围在490nm～600nm之间，发射波长范围在500nm～700nm之间)，说明该直径为10nm的纳米银颗粒不会干扰该类荧光基团的荧光信号的激发和发射，进而不会影响荧光定量PCR的结果。

而纳米金颗粒的吸收峰在520nm左右，在荧光基团的作用波长490～700nm之内，说明直径10nm的纳米金颗粒可能会干扰荧光定量PCR数据。

实施例3一种检测新型冠状病毒2019-nCoV的荧光定量纳米粒子PCR方法的建立

一、引物和探针的设计

通过序列比对，并利用专业软件primer primier5，设计新型冠状病毒核酸检测的特异性引物和探针，合成引物和探针，具体序列如下：

ORF1ab基因上游引物F1序列：CGGAAGCCAATATGGATCAAG(SEQ ID NO:1)，

ORF1ab基因下游引物序R1列：TTGGATGATCTATGTGGCAACG(SEQ ID NO:2)，

ORF1ab基因探针P1序列：FAM-CTTTGGTGGTGCATCGTGTTGTCTG-BHQ1(SEQ ID NO:7)，

N基因上游引物F2序列：CATACAATGTAACACAAGCTTTCGG(SEQ ID NO:3)，

N基因下游引物R2序列：TTCCTTGTCTGATTAGTTCCTGGTC(SEQ ID NO:4)，

N基因探针P2序列：ROX-ACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGA-BHQ2(SEQ ID NO:8)，

内控基因上游引物F3序列：AGATTTGGACCTGCGAGCG(SEQ ID NO:5)，

内控基因下游引物R3序列：AACAACTGAATAGCCAAGGTG(SEQ ID NO:6)，

内控基因探针P3序列：VIC-CTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2(SEQ ID NO:9)。

引物序列的5’端与polyA的3’端相连，而polyA的5’端通过疏基(-SH)与纳米粒子链接。

二、引物的制备

银纳米颗粒使用从SIGMA购买直径为10nm的纳米银溶液(货号为795925)，将合成的100μl 100μM带有5’端SH修饰的oligo片段(5’端有Poly A的引物)与1ml 0.3nM 银纳米颗粒溶液、柠檬酸缓冲液中，每次3～5μl，持续搅拌10min，待溶液完全混合均匀，待oligo片段完成基于Ag-S共价键实现巯基化寡核苷酸在银纳米粒子表面的自组装后，，进行12000rpm高速离心，富集纳米颗粒，弃上清，并重悬于纯化水中待用。通过polyA 与纳米颗粒缀合合成，完成特异性引物的银纳米颗粒修饰。

合成得到表1所示的引物和探针。

表1：

实施例4一种检测新型冠状病毒2019-nCoV的荧光定量纳米粒子PCR试剂盒

一、组成

表1所示的引物和探针、阳性质控品、阴性质控品、Taq酶、M-MLV酶、RNasin酶、 PCRBuffer和水；

其中，强阳性新型冠状病毒假病毒(来源于邦德胜公司“2019新型冠状病毒核糖核酸液体室内质控品”产品)为阳性质控品；纯化水为和阴性质控品。

二、使用方法

1、RNA的提取

选用病毒核酸RNA提取试剂盒(磁珠法)进行上述样本的提取，具体提取步骤按照提取试剂盒的操作进行，得到纯化的RNA。

2、荧光定量纳米粒子PCR反应

按照表2配制荧光定量纳米粒子PCR反应体系

表2：

组分	浓度	用量/μL
			ORF1ab-F1-Ag	10μmol/L	0.5
ORF1ab-R1-Ag	10μmol/L	0.5
			ORF1ab-P1	10μmol/L	0.4
N-F1-Ag	10μmol/L	0.5
			N-R1-Ag	10μmol/L	0.5
N-P1	10μmol/L	0.5
			RP-F1-Ag	10μmol/L	0.5
RP-R1-Ag	10μmol/L	0.5
			RP-P1	10μmol/L	0.5
Taq酶	5U/μl	0.4
			M-MLV酶	200U/μl	0.2
RNasin酶	50U/μl	0.2
			PCR Buffer	5×	5
待测RNA		5
			水		补水至25μL

使用实施例1的荧光定量纳米粒子PCR仪进行多重PCR反应，反应程序如表3所示。

表3：

使用实施例1的荧光定量纳米粒子PCR仪进行PCR反应，整个扩增时间约15min。

3、结果判读

通过参考值的研究确定本试剂盒检测目标基因的Ct参考值为40。

对于FAM和ROX通道检测到典型S型扩增曲线，且Ct值≤40的样本，报告为 2019-nCoV病毒阳性；

对于FAM和ROX通道均未检测到典型的S型扩增曲线(No Ct),或Ct＞40，VIC通道有扩增曲线，且Ct≤40的样本，报告为2019-nCoV3病毒阴性；

对于FAM、ROX、VIC通道均未检测到典型的S型扩增曲线(No Ct),或Ct＞40，表示本次检测样本细胞含量太低或者有干扰物质抑制反应，该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本重新采样，进行重复试验。

对比例1一种检测新型冠状病毒2019-nCoV的荧光定量PCR试剂盒

一、组成

表4所示的引物和探针、阳性质控品、阴性质控品、Taq酶、M-MLV酶、RNasin酶、 PCRBuffer和水；

表4：

二、使用方法

1、RNA的提取

2、荧光定量PCR反应

按照表5配制荧光定量纳米粒子PCR反应体系

表5：

组分	浓度	用量/μL
			ORF1ab-F1	10μmol/L	0.5
ORF1ab-R1	10μmol/L	0.5
			ORF1ab-P1	10μmol/L	0.4
N-F1	10μmol/L	0.5
			N-R1	10μmol/L	0.5
N-P1	10μmol/L	0.5
			RP-F1	10μmol/L	0.5
RP-R1	10μmol/L	0.5
			RP-P1	10μmol/L	0.5
Taq酶	5U/μl	0.4
			M-MLV酶	200U/μl	0.2
RNasin酶	50U/μl	0.2
			PCR Buffer	5×	5
待测RNA		5
			水		补水至25μL

使用ABI 7500PCR仪进行多重PCR反应，反应程序如表6所示。

表6：

使用ABI 7500PCR仪进行PCR反应，扩增时间约为80min。

3、结果判读

同实施例4。

对比例2一种检测新型冠状病毒2019-nCoV的荧光定量纳米粒子PCR试剂盒

一、组成

本荧光定量纳米粒子PCR试剂盒的组成，仅仅将银纳米颗粒换为直径为10nm的金纳米颗粒。

具体引物和探针如表7所示。

表7：

名称	序列
		ORF1ab-F1-Au	5′Au-S-poly A-CGGAAGCCAATATGGATCAAG(SEQ ID NO:1)
ORF1ab-R1-Au	5′Au-S-poly A-TTGGATGATCTATGTGGCAACG(SEQ ID NO:2)
		ORF1ab-P1	FAM-CTTTGGTGGTGCATCGTGTTGTCTG-BHQ1(SEQ ID NO:7)
N-F2-Au	5′Au-S-poly A-CATACAATGTAACACAAGCTTTCGG(SEQ ID NO:3)
		N-R2-Au	5′Au-S-poly A-TTCCTTGTCTGATTAGTTCCTGGTC(SEQ ID NO:4)
N-P2	ROX-ACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGA-BHQ2(SEQ ID NO:8)
		RP-F3-Au	5′Au-S-poly A-AGATTTGGACCTGCGAGCG(SEQ ID NO:5)
RP-R3-Au	5′Au-S-poly A-AACAACTGAATAGCCAAGGTG(SEQ ID NO:6)
		RP-P3	VIC-CTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2(SEQ ID NO:9)

二、使用方法

1、RNA的提取

2、荧光定量纳米粒子PCR反应

按照表8配制荧光定量纳米粒子PCR反应体系

表8：

使用实施例1的荧光定量纳米粒子PCR仪进行多重PCR反应，反应程序如表9所示。

表9：

3、结果判读

同实施例4。

应用例1一种检测新型冠状病毒2019-nCoV的荧光定量纳米粒子PCR试剂盒的灵敏度

一、实验方法

使用实施例4的荧光定量纳米粒子PCR试剂盒检测新型冠状病毒梯度，浓度分别为200cpoies/μl、20copies/μl、2copies/μl、0.2copies/μl，以对比例1的荧光定量PCR试剂盒和对比例2的荧光定量纳米粒子PCR试剂盒作为对照。

二、实验结果

结果如图4到6所示，实施例4的荧光定量纳米粒子PCR试剂盒的最低检测限为1copy，而对比例1的荧光定量PCR试剂盒只能检测至10copies，1copy上样量的假病毒未检测出扩增信号。对比例2的的荧光定量纳米粒子PCR试剂盒最低检测线为100copies。利用金纳米颗粒制备得到的荧光定量纳米粒子PCR试剂盒，金纳米颗粒可能干扰了荧光信号的采集，降低了体系的灵敏度。

应用例2一种检测新型冠状病毒2019-nCoV的荧光定量纳米粒子PCR试剂盒的特异性

一、实验方法

使用实施例4的荧光定量纳米粒子PCR试剂盒检测SARS和MERS假病毒，以对比例1的荧光定量PCR试剂盒作为对照。

二、实验结果

结果如图7和图8所示，对照例1的荧光定量PCR试剂盒出现SARS假病毒ORF1ab 基因的非特异性扩增，而实施例的4的荧光定量纳米粒子PCR试剂盒出现SARS假病毒 ORF1ab基因的非特异性扩增，说明其特异性要高于对比例1的荧光定量PCR试剂盒。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 广东粤港澳大湾区国家纳米科技创新研究院

<120> 一种检测新型冠状病毒的荧光定量纳米粒子PCR的引物、引物探针组合及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cggaagccaa tatggatcaa g 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttggatgatc tatgtggcaa cg 22

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catacaatgt aacacaagct ttcgg 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttccttgtct gattagttcc tggtc 25

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agatttggac ctgcgagcg 19

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aacaactgaa tagccaaggt g 21

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctttggtggt gcatcgtgtt gtctg 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acgtggtcca gaacaaaccc aagga 25

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctgacctgaa ggctctgcgc g 21

Claims

1.一种荧光定量纳米粒子PCR的引物，其特征在于，所述引物的5’端修饰有纳米颗粒，所述纳米颗粒为导体或者半导体纳米颗粒。

2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述纳米颗粒的直径为1～200nm。

3.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述纳米颗粒的激发波长或者发射波长在490nm～700nm之外。

4.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物的5’端通过Poly A与纳米颗粒连接。

5.一种检测新型冠状病毒2019-nCoV的荧光定量纳米粒子PCR的引物探针组合，其特征在于，所述引物如权利要求1到4任一所述。

6.根据权利要求5所述的引物探针组合，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：1到4所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7到8所示。

7.根据权利要求6所述的引物探针组合，其特征在于，还含有核苷酸序列如SEQ ID NO：5到6所示的引物，核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的探针。

8.一种检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒，其特征在于，含有权利要求5所述的引物探针组合。

9.一种新型冠状病毒2019-nCoV的非诊断目的的检测方法，其特征在于，使用权利要求5所述的引物探针组合。

10.根据权利要求所述的检测方法，其特征在于，利用含有激光加热装置的PCR仪进检测，所述激光加热装置包括：恒温浴组件和激光光源组件，所述恒温浴组件在PCR反应中为循环过程中的退火和延伸步骤提供热量，所述恒温浴的温度为PCR反应中退火/延伸的温度，所述激光光源通过照射纳米颗粒，实现纳米颗粒周围微环境升温，从而提供PCR反应中热变性的温度。