CN111363788A - 用于细胞内端粒酶活性的基于核酸探针的级联放大检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于细胞内端粒酶活性的基于核酸探针的级联放大检测方法，端粒酶延伸产物与脱氧核糖核酸序列C形成更稳定的双链，置换出脱氧核糖核酸序列G，脱氧核糖核酸序列G通过杂交打开了核酸探针1的荧光。此外，核酸探针1和核酸探针2的杂交打开了核酸探针2的发夹结构，并观察到较强的荧光。同时，释放出的脱氧核糖核酸序列G可以引发下一个链置换循环反应。体系中不存在端粒酶或存在其他非特异性蛋白时，核酸探针的构型不会发生改变，荧光信号无明显变化。该策略提供一种无需聚合酶链扩增且无需酶参与的方法，用于定性和定量检测细胞中端粒酶的活性，简便、快速、具有较高的灵敏度和选择性，在端粒酶检测方面具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于生物传感及分析技术领域，具体涉及一种用于细胞内端粒酶活性的基于核酸探针的级联放大检测方法。
背景技术
人体端粒酶是一种特殊的核糖核蛋白，可以增加端粒末端的端粒重复序列的数目，以维持连续的细胞增殖。在正常的人体细胞中，端粒酶的活性受到抑制，导致细胞分裂过程中端粒缩短，进而导致细胞衰老或凋亡。然而，在大多数恶性肿瘤细胞中，端粒酶被异常激活，从而导致端粒重复序列的延伸，并使肿瘤细胞永久存活。据报道，有85～90％的肿瘤组织表达高端粒酶活性，表明端粒酶与癌症之间有着密切的关系。现在，端粒酶已被认为是一种有价值的肿瘤生物标志物，并且有望作为肿瘤治疗的新靶标。因此，端粒酶及其抑制剂的灵敏检测对癌症的早期诊断、预防、治疗和预后评估具有重要意义。
自1985年发现端粒酶以来，已经开发了多种检测端粒酶活性的方案。由于端粒酶在单个细胞中的表达水平较低(Hela细胞中约为10-11IU)，因此很难直接检测端粒酶的活性。目前，端粒重复扩增方案被认为是端粒酶检测的黄金标准方法。通常，端粒酶介导的延伸产物通过聚合酶链反应进行扩增，并通过聚合酶链反应仪器进行定量检测。该方法非常灵敏和有效，但是需要昂贵的脱氧核糖核酸聚合酶、复杂的操作和专用仪器。为了克服这些不足，研究人员开发了一些无需聚合酶链反应的方法来扩增端粒酶介导的延伸反应或检测信号。纳米材料由于具有较高的比表面积和优异的生物相容性被广泛用于设计端粒酶活性检测策略。目前，已经报道了金纳米颗粒、金纳米棒、银纳米团簇和氧化石墨烯等纳米材料用于检测细胞裂解物中的端粒酶活性以及用于活细胞中端粒酶的成像。大多数基于纳米材料的策略都具有令人满意的性能，然而，纳米材料的制备和纯化通常需要很长时间，并且需要繁琐的操作步骤。更重要的是，有些策略是需要酶辅助的，这可能会产生假阳性信号并导致灵敏度相对较低，这些问题将限制它们在复杂的生物环境(例如血清、尿液、活细胞等)中的进一步应用。
为了克服上述方法的缺点，我们探索了一种基于脱氧核糖核酸的链置换反应的循环扩增策略，用于体外和体内检测端粒酶活性，我们设计了一种基于两个发夹结构核酸探针和脱氧核糖核酸链置换反应的级联扩增策略。它是一种不需要聚合酶链反应、且不需要酶参与的可靠策略，以荧光检测为主要分析手段，实现了对端粒酶的高灵敏度检测，可用于区分肿瘤细胞与正常细胞，以及端粒酶抑制剂的筛选。这种灵敏度高、特异性好、操作简便、检测快、成本低的生物传感策略，将为该领域今后的发展提供有价值的理论和实验依据。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术中端粒酶检测方法存在的不足，本发明提供一种基于核酸探针的级联放大方法用于细胞内端粒酶活性的检测，具有较高的特异性和灵敏度。
技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明基于核酸探针的级联放大方法用于检测细胞内端粒酶活性，包括以下步骤：
所用的荧光检测方法为：将端粒延伸产物、脱氧核糖核酸序列G，脱氧核糖核酸序列C、核酸探针1和核酸探针2加入到级联放大缓冲溶液中进行荧光发射光谱的扫描，激发波长为490nm，发射波长扫描范围为500nm～650nm。在最终的反应体系中，TS引物的浓度为5nM，脱氧核糖核酸序列G和脱氧核糖核酸序列C的浓度均为50nM，核酸探针1和核酸探针2的浓度分别为150nM和200nM。
TS引物、脱氧核糖核酸序列G、脱氧核糖核酸序列C、核酸探针1和核酸探针2都是溶解在脱氧核糖核酸序列保存液中配成的溶液，脱氧核糖核酸序列保存液的组成为50mMTris-HCl(pH 8.0)。
所述的荧光信号用荧光分光光度计进行检测，激发波长为490nm，发射波长扫描范围为500nm～650nm。
a.TS引物在端粒酶的存在下可延伸产生(TTAGGG)n的端粒重复序列，延伸产物可与脱氧核糖核酸序列C形成更加稳定的双链结构，从而将脱氧核糖核酸序列G置换下来，游离的脱氧核糖核酸序列G通过杂交与核酸探针1形成部分双链，打开核酸探针1的发夹结构，使其荧光恢复；以490nm为激发波长，进行荧光检测，记录520nm处的荧光发射强度，实现端粒酶的定性检测；
b.进一步加入核酸探针2后，核酸探针1与核酸探针2杂交形成双链打开了核酸探针2的发夹结构，使荧光信号进一步增强；同时，释放的脱氧核糖核酸序列G可以进一步触发下一个链置换循环；荧光信号的进一步增强有助于我们检测到更少量的端粒酶，提高端粒酶检测的灵敏度；
c.核酸探针1与核酸探针2分别在5’端和3’端标记有荧光基团，随着端粒酶含量的增加，520nm处的荧光信号强度也逐渐增加，通过记录该处的荧光发射强度，可实现端粒酶的定量检测。
d.在进行端粒酶抑制剂检测分析实验时，在预处理实验之前，将端粒酶抑制剂3’-叠氮基3’-脱氧胸苷(AZT)加入到Hela细胞提取物中，在37℃的温度下反应90分钟，而后重复上述步骤a-c，实现端粒酶抑制剂的检测分析；体系中AZT的最终浓度可选择为0、0.01、0.1、0.5、1、2mM；
其中，所述的TS引物的碱基组成如5’-SEQ ID NO：1-3’所示；脱氧核糖核酸序列C的碱基组成如5’-SEQ ID NO：2-3’所示；脱氧核糖核酸序列G的碱基组成如5’-SEQ ID NO：3-3’所示；核酸探针1的碱基组成如5’-FAM-SEQ ID NO：4-BHQ1-3’所示；核酸探针2的碱基组成如5’-BHQ1-SEQ ID NO：5-FAM-3’所示。
步骤a)中核酸探针1和核酸探针2上分别标记有荧光基团和猝灭基团，荧光基团为6-羟基荧光素，标记在核酸探针1的5’端和核酸探针2的3’端；猝灭基团为BHQ1标记在核酸探针1的3’端和核酸探针2的5’端。
端粒延伸反应缓冲溶液的组成为：0.1M Tris-HCl(pH 8.3)，15mM MgC12，10mMEGTA，0.5M KCl，0.05％tween 20，1mg/mL BSA，反应温度为37℃，反应时间为1小时；脱氧核糖核酸序列G与脱氧核糖核酸序列C的杂交缓冲溶液的组成为10mM Tris-HCl(pH 7.4)，50mM NaCl，10mM MgCl2，反应温度为37℃，反应时间为30分钟；级联放大反应的缓冲溶液的组成为：50mM Tris-HCl(pH 7.4)，5mM MgCl2，反应温度为37℃，反应时间为30分钟。
有益效果：本发明提供的一种基于核酸探针的级联放大方法用于细胞内端粒酶活性的检测，与现有技术相比，可实现对端粒酶的定性及定量检测。当体系中含有其它酶或蛋白质时，可以区分端粒酶与其他酶或蛋白质；在加入端粒酶抑制剂后，可通过荧光信号的强度变化明显检测到端粒酶活性被抑制，因此，本发明方法有望为实际临床样品中端粒酶的检测提供一种简便、快速、灵敏度高的方法。
附图说明
图1为本发明利用核酸探针和级联放大方法检测端粒酶活性的工作原理图。
图2为本发明利用核酸探针和级联放大方法检测端粒酶活性的可行性分析图。可以看出，加入端粒酶后，体系的荧光信号强度明显高于未加入端粒酶的对照组，并且在进一步地加入核酸探针2以后，荧光信号强度更进一步增强，可以检测到更少数量细胞中的端粒酶活性。
图3为本发明利用核酸探针和级联放大方法检测端粒酶活性的灵敏度分析图。该图表明了荧光信号强度与细胞数量之间的关系。
图4为本发明利用核酸探针和级联放大方法检测端粒酶活性的特异性分析图。
图5为本发明利用核酸探针和级联放大方法检测端粒酶抑制剂的分析。
具体实施方式
下面结合附图，用端粒酶的检测实施例来进一步说明本发明。
荧光检测所用的仪器为荧光分光度计(RF-5301，日本)。荧光光谱测量条件：氙灯激发，激发和发射狭缝宽度为5.0nm和5.0nm，电压为950V，响应时间Auto，激发波长为490nm，发射波长扫描范围500～650nm；用600μL石英比色皿进行测量，样品体积400μL；室温。
本发明实施例中所用的寡核苷酸均购自上海生物工程技术有限公司，序列分别为：TS引物如5’-SEQ ID NO：1-3’所示：5’-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3’；脱氧核糖核酸序列C如5’-SEQ ID NO：2-3’所示：5’-AAC CCT AAC CCT AAC TCT GCT C-3’；脱氧核糖核酸序列G如5’-SEQ ID NO：3-3’所示：5’-GAG TTA GGG TTA GGG CGG GAA TC-3’；核酸探针1如5’-FAM-SEQ ID NO：4-BHQ1-3’所示：5’-FAM-GGG ATG GGT TAG GGC GGG AAT CAG AGG GCGGGA TGG GGA TTC CCG CCC TAA CCC TAA CTC-BHQ1-3’；核酸探针2如5’-BHQ1-SEQ ID NO：5-FAM-3’所示：5’-BHQ1-GAT GAT GGG TTA GGG CGG GAA TCC CCA TCC CGC CCT CTG ATTCCC GCC CTA ACC CAT CCC-FAM-3’。所用端粒酶提取自Hela细胞。端粒延伸反应缓冲溶液的组成为：0.1M Tris-HCl(pH 8.3)，15mM MgC12，10mM EGTA，0.5M KCl，0.05％tween 20，1mg/mL BSA，反应温度为37℃，反应时间为1小时；脱氧核糖核酸序列G与脱氧核糖核酸序列C的杂交缓冲溶液的组成为10mM Tris-HCl(pH 7.4)，50mM NaCl，10mM MgCl2，反应温度为37℃，反应时间为30分钟；级联放大反应的缓冲溶液的组成为：50mM Tris-HCl(pH 7.4)，5mM MgCl2，反应温度为37℃，反应时间为30分钟。
端粒酶抑制剂与细胞提取物的反应温度为37℃，反应时间为90分钟。体系中AZT的最终浓度分别为0、0.01、0.1、0.5、1、2mM。
实施例1：
1)将2μL的TS引物(1μM)、2μL dNTPs(10mM)以及端粒酶提取物加入到端粒缓冲溶液中进行端粒延伸反应，同时将10μL初始浓度为2μM的脱氧核糖核酸序列C与脱氧核糖核酸序列G混合杂交形成脱氧核糖核酸序列G/脱氧核糖核酸序列C双链；
2)将反应完的端粒酶延伸产物与脱氧核糖核酸双链反应，端粒酶延伸产物可与脱氧核糖核酸序列C形成更加稳定的双链结构而将脱氧核糖核酸序列G置换下来，游离的脱氧核糖核酸序列G通过杂交与核酸探针1形成部分双链打开了核酸探针1的发夹结构，使其荧光恢复；以490nm为激发波长，进行荧光检测，记录520nm处的荧光发射强度，实现端粒酶的定性检测；
3)进一步地加入核酸探针2后，核酸探针1与核酸探针2杂交形成双链，打开了核酸探针2的发夹结构，使荧光信号进一步增强；同时，释放的脱氧核糖核酸序列G可以进一步触发下一个链置换循环；荧光信号的进一步增强有助于检测到更少量的端粒酶，提高端粒酶检测的灵敏度。
实施例2：端粒酶检测的灵敏度分析
1)向各离心管加入2μL的TS引物(1μM)、2μL dNTPs(10mM)以及不同细胞数量的端粒酶提取物，细胞数量分别为0、1250、2500、5000、10000、20000、25000、37500。产生端粒酶延伸产物以后，与脱氧核糖核酸双链反应置换出脱氧核糖核酸序列G，而后置换下来的脱氧核糖核酸序列G与核酸探针1杂交打开了核酸探针1的发夹结构，使核酸探针1的荧光信号恢复。随着细胞数量的增加，核酸探针1的荧光信号也逐渐增强，在0～37500个Hela细胞提取物范围内，核酸探针1的荧光信号强度与细胞数量成正比，可以据此线性关系对端粒酶进行定量检测，检测限为1250个Hela细胞。
2)进一步地，在级联放大反应中加入了核酸探针2，检测了细胞数量分别为0、20、200、1000、2000、4000、5000的Hela细胞提取物，发现在此细胞范围内荧光信号强度与细胞数量成正比，检测限为20个Hela细胞，表明该级联放大方法提高了检测的灵敏度。
实施例3：端粒酶检测的特异性分析
向各离心管中加入2μL的TS引物(1μM)和2μL dNTPs(10mM)，然后分别加入Hela细胞提取物、A549细胞提取物、热失活的Hela细胞提取物、牛血清蛋白(BSA)、限制性内切核酸酶(EcoRI)、溶菌酶(Lys)，另有一组加入CHAPS裂解液作为空白对照组。从图4可以看出，Hela细胞和A549细胞提取物的实验组的荧光信号强度明显高于空白组和其他蛋白和酶的实验组，因为体系中不存在端粒酶时，TS引物无法延伸产生端粒重复序列，脱氧核糖核酸双链不会解开而释放单链序列，因而核酸探针1和核酸探针2的发夹结构不会被打开，荧光不会恢复。而当体系中存在端粒酶时，端粒酶延伸产物会将脱氧核糖核酸序列G从脱氧核糖核酸双链中置换出来，继而打开核酸探针1的发夹结构，使其恢复荧光；进一步地，核酸探针1会打开核酸探针2的发夹结构进而形成稳定的双链，使荧光信号进一步增强，也使得其与其他对照组的区别更加明显。表明该方法具有良好的特异性。
实施例4：端粒酶抑制剂的检测分析
在预处理实验之前，将端粒酶抑制剂3’-叠氮基3’-脱氧胸苷(AZT)加入到Hela细胞提取物中，在37℃的温度下反应90分钟，而后将处理过的细胞提取物加入到反应体系中，体系中AZT的最终浓度分别为0、0.01、0.1、0.5、1、2mM。如图5所示，随着AZT浓度的增加，荧光信号强度逐渐降低，表明由于AZT对端粒酶活性的抑制作用，更少的核酸探针1和核酸探针2的发夹结构被打开。当抑制剂的浓度增加到2mM时，大约50％的端粒酶活性被抑制，该结果表明，所提出的方法能够动态地响应细胞内端粒酶活性，并且可以作为一种潜在工具用于筛选端粒酶抑制剂用作抗癌药物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
<110>南京邮电大学
<120>用于细胞内端粒酶活性的基于核酸探针的级联放大检测方法
<160>5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
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gatgatgggt tagggcggga atccccatcc
cgccctctga ttcccgccct aacccatccc 60
Claims (8)
1.一种用于检测细胞内的端粒酶活性的基于核酸探针的级联放大检测方法，其特征是包括以下步骤：
1)预处理：将TS引物1μM、dNTPs 10mM以及端粒酶提取物加入到端粒延伸缓冲溶液中进行端粒延伸反应，得到端粒延伸产物；同时将10μL初始浓度为2μM的脱氧核糖核酸序列C与脱氧核糖核酸序列G在杂交反应缓冲溶液中混合杂交形成脱氧核糖核酸序列G/脱氧核糖核酸序列C双链即脱氧核糖核酸双链；
2)荧光检测：将反应完的端粒酶延伸产物与脱氧核糖核酸双链在级联放大反应缓冲溶液中反应，依次加入核酸探针1、核酸探针2，进行荧光发射光谱的扫描：以490nm为激发波长，发射波长扫描范围为500nm～650nm；核酸探针1和核酸探针2均标记有荧光基团和猝灭基团，用于报告荧光信号，该荧光强度与体系中端粒酶的活性成正比，若存在端粒酶则核酸探针1、2显示出对应强度的荧光信号，若不存在端粒酶则荧光信号无明显变化；其中，核酸探针1的碱基组成如5’-FAM-SEQ ID NO：4-BHQ1-3’所示；核酸探针2的碱基组成如5’-BHQ1-SEQ ID NO：5-FAM-3’所示。
2.根据权利要求1所述的用于检测端粒酶活性的基于核酸探针的级联放大检测方法，其特征是，核酸探针1和核酸探针2上分别标记有荧光基团和猝灭基团，荧光基团为6-羟基荧光素，标记在核酸探针1的5’端和核酸探针2的3’端；猝灭基团为BHQ1，标记在核酸探针1的3’端和核酸探针2的5’端。
3.根据权利要求1所述的用于检测端粒酶活性的基于核酸探针的级联放大检测方法，其特征是，步骤1中所用的端粒延伸反应缓冲溶液的组份及其浓度为：0.1M Tris-HCl，15mMMgC12，10mM EGTA，0.5M KCl，0.05％tween 20，1mg/mL BSA；反应条件为：pH＝8.3，反应温度为37℃，反应时间为1小时。
4.根据权利要求1所述的用于检测端粒酶活性的基于核酸探针的级联放大检测方法，其特征是，脱氧核糖核酸序列G与脱氧核糖核酸序列C的杂交缓冲溶液的组成为10mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM MgCl2，pH＝7.4，反应温度为37℃，反应时间为30分钟。
5.根据权利要求1所述的用于检测端粒酶活性的基于核酸探针的级联放大检测方法，其特征是，所用的级联放大反应的缓冲溶液的组成为：50mM Tris-HCl(pH 7.4)，5mMMgCl2，反应温度为37℃，反应时间为30分钟。
6.根据权利要求1所述的用于检测端粒酶活性的基于核酸探针的级联放大检测方法，其特征是，在加入核酸探针1之后，荧光强度与体系中的细胞数量具有良好的线性关系，其线性回归方程是y＝4.65x+46.6；进一步加入核酸探针2之后，荧光强度与细胞数量之间的线性回归方程为y＝75.85x+205.4，其中y表示体系的荧光强度，x表示体系中的细胞数量。
7.根据权利要求1所述的用于检测端粒酶活性的基于核酸探针的级联放大检测方法，其特征是，在最终的反应体系中TS引物的浓度为5nM，脱氧核糖核酸序列G和脱氧核糖核酸序列C的浓度均为50nM，核酸探针1和核酸探针2的浓度分别为150nM和200nM；TS引物、脱氧核糖核酸序列G、脱氧核糖核酸序列C、核酸探针1和核酸探针2都是溶解在脱氧核糖核酸序列保存液中配成的溶液，脱氧核糖核酸序列保存液的组成为50mM Tris-HCl，pH 8.0。
8.根据权利要求1所述的用于检测端粒酶活性的基于核酸探针的级联放大检测方法，其特征是，在预处理实验之前，将端粒酶抑制剂3’-叠氮基3’-脱氧胸苷AZT加入到Hela细胞提取物中，在37℃的温度下反应90分钟，而后进行预处理并检测荧光信号，实现端粒酶抑制剂的检测分析，体系中AZT的最终浓度为0、0.01、0.1、0.5、1、2mM。
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