WO2024075828A1 - アルツハイマー病を発症する可能性を判定するためのデータ収集方法及びキット - Google Patents

アルツハイマー病を発症する可能性を判定するためのデータ収集方法及びキット Download PDF

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伸行 小林
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学校法人慈恵大学
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a data collection method and kit for determining the likelihood of developing Alzheimer's disease.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2022-161607, filed on October 6, 2022, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • Alzheimer's disease is one of the most common forms of dementia. It is believed that Alzheimer's disease develops when amyloid beta and phosphorylated tau are deposited in brain tissue, but the mechanism of onset is unknown. Genetic factors, aging, lifestyle habits, infections, and other environmental factors are all involved in epigenetics, and it is assumed that these factors are involved in onset of the disease.
  • Non-Patent Documents 1-3 There are no blood biomarkers in clinical use for diagnosing Alzheimer's disease.
  • the inventors comprehensively quantified changes in blood DNA methylation levels in healthy individuals, patients with Alzheimer's disease, and patients with mild cognitive impairment, which is the precursor to Alzheimer's disease, and found that DNA methylation in the promoter region of the NCAPH2 (LMF2) gene was significantly decreased and DNA methylation in the promoter regions of the COASY gene and SPINT1 gene was significantly increased in patients with Alzheimer's disease and mild cognitive impairment.
  • LMF2 NCAPH2
  • the present invention aims to provide a technique useful for determining the possibility of a subject developing Alzheimer's disease by measuring the rate of DNA methylation of specific CpG islands among the CpG islands in the promoter region of the COASY gene.
  • a data collection method for determining the possibility that a subject will develop Alzheimer's disease comprising measuring a rate of methylation of DNA in a CpG island containing a cytosine residue selected from the group consisting of the 24th, 56th, 75th, 81st, 98th, 103rd, 115th, 126th, 134th, 142nd, 153rd, and 179th cytosine residues in the base sequence of the promoter region of the COASY gene shown in SEQ ID NO: 1 in a biological sample of the subject, wherein a higher rate than that of a control indicates a high possibility that the subject will develop Alzheimer's disease.
  • kits for determining the possibility that a subject will develop Alzheimer's disease comprising a primer or probe for amplifying DNA of a CpG island containing a cytosine residue selected from the group consisting of the 24th, 56th, 75th, 81st, 98th, 103rd, 115th, 126th, 134th, 142nd, 153rd, and 179th cytosine residues in the base sequence of the promoter region of the COASY gene shown in SEQ ID NO:1.
  • kits described in [3], wherein the primer for amplifying DNA of a CpG island containing the 24th cytosine residue in the base sequence of the promoter region of the COASY gene shown in SEQ ID NO: 1 is a primer set containing a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • the present invention provides a technology that is useful for determining the possibility of developing Alzheimer's disease in a subject.
  • the nucleotide sequence of the promoter region of the COASY gene shown in SEQ ID NO: 1 and the positions of CpG island numbers 1 to 14 are shown in Figure 1.
  • the shaded DNA (CG) indicates the positions of the CpG islands.
  • 1 is a graph showing the percentage of DNA methylation in CpG island numbers 1 to 9 in the promoter region of the COASY gene in non-demented elderly (NC) and patients with Alzheimer's disease (AD) and amnesic mild cognitive impairment (MCI).
  • a to I respectively show the percentage of DNA methylation in CpG island numbers 1 to 9.
  • FIG. 1 is a graph showing the percentage of DNA methylation in CpG island numbers 10 to 14 in the promoter region of the COASY gene in non-demented elderly (NC) and patients with Alzheimer's disease (AD) and amnesic mild cognitive impairment (MCI). J to N indicate the percentage of DNA methylation in CpG island numbers 10 to 14, respectively.
  • NC non-demented elderly
  • AD Alzheimer's disease
  • MCI amnesic mild cognitive impairment
  • FIG. 1 shows an amplification plot of TaqMan real-time PCR performed using a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and a probe for detecting methylated DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, and using as a template DNA of CpG island number 14 in the promoter region of the COASY gene, which has been bisulfitized with methylation rates of 100%, 75%, 50%, 25%, 5%, and 0%.
  • FIG. 1 shows an amplification plot of TaqMan real-time PCR performed using a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and a probe for detecting methylated DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, and using as a template DNA of CpG island number 14 in the promoter region of the COASY gene, which has been bisulfitized with
  • FIG. 1 shows an amplification plot of TaqMan real-time PCR performed using a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and a probe for detecting unmethylated DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, and using as a template DNA of CpG island number 14 in the promoter region of the COASY gene, which has been bisulfitized with methylation rates of 100%, 75%, 50%, 25%, 5%, and 0%.
  • FIG. 1 shows an amplification plot of TaqMan real-time PCR performed using a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and a probe for detecting unmethylated DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, and using as a template DNA of CpG island number 14 in the promoter region of the COASY gene, which has been bisulfitized with
  • FIG. 13 shows an amplification plot of TaqMan real-time PCR performed using a forward primer in which the third and twentieth thymine residues in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 are LNA, a reverse primer in which the eighth and twentieth adenine residues in the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 are LNA, and a probe for detecting methylated DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, and using as a template DNA of CpG island number 14 in the promoter region of the COASY gene that has been bisulfitized with methylation rates of 100%, 75%, 50%, 25%, 5%, and 0%.
  • FIG. 13 shows an amplification plot of TaqMan real-time PCR performed using a forward primer in which the third and twentieth thymine residues in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 are LNA, a reverse primer in which the eighth and twentieth adenine residues in the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 are LNA, and a probe for detecting unmethylated DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, and using as a template DNA of CpG island number 14 in the promoter region of the COASY gene that has been bisulfitized with methylation rates of 100%, 75%, 50%, 25%, 5%, and 0%.
  • N is a graph showing the percentage of DNA methylation at CpG island number 14 in the promoter region of the COASY gene in the blood of non-demented elderly (NC), Alzheimer's disease (AD) patients, and amnesic mild cognitive impairment (MCI) patients, using a forward primer in which the 3rd and 20th thymine residues in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 are LNA, a reverse primer in which the 8th and 20th adenine residues in the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 are LNA, and a probe for detecting methylated DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 or a probe for detecting unmethylated DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • NC non-demented elderly
  • AD Alzheimer's disease
  • MCI amnesic mild cognitive impairment
  • the present invention provides a data collection method for determining the possibility that a subject will develop Alzheimer's disease, the data collection method comprising measuring a percentage of DNA methylation in a CpG island containing a cytosine residue selected from the group consisting of the 24th, 56th, 75th, 81st, 98th, 103rd, 115th, 126th, 134th, 142nd, 153rd, and 179th cytosine residues in the base sequence of the promoter region of the COASY gene (NM_001042529) represented by SEQ ID NO:1, wherein a higher percentage of the methylation percentage compared to a control indicates a high possibility that the subject will develop Alzheimer's disease.
  • a cytosine residue selected from the group consisting of the 24th, 56th, 75th, 81st, 98th, 103rd, 115th, 126th, 134th, 142nd, 153rd, and 179th cytosine residues in
  • the method of this embodiment makes it possible to collect data for determining whether or not a subject is likely to develop Alzheimer's disease.
  • the data collection method does not include a step in which a doctor makes a judgment.
  • the method of this embodiment can also be described as a method for determining whether or not a subject is likely to develop Alzheimer's disease.
  • the rate of DNA methylation of a CpG island containing a cytosine residue selected from the group consisting of the 24th, 56th, 75th, 81st, 98th, 103rd, 115th, 126th, 134th, 142nd, 153rd, and 179th cytosine residues in the base sequence of the promoter region of the COASY gene shown in SEQ ID NO:1 is data for determining whether or not a subject is likely to develop Alzheimer's disease.
  • control is the DNA methylation rate of the CpG island in the promoter region of the COASY gene in a biological sample from a subject who is known in advance not to have Alzheimer's disease.
  • subjects who are known in advance not to have Alzheimer's disease include healthy individuals and healthy elderly people.
  • the percentage of DNA methylation in one or more CpG islands containing cytosine residues selected from the group consisting of cytosine residues at positions 24, 56, 75, 81, 98, 103, 115, 126, 134, 142, 153, and 179 in the base sequence of the promoter region of the COASY gene shown in SEQ ID NO:1 in a biological sample from a subject is measured, and if the percentage of DNA methylation in the CpG islands containing the cytosine residues is higher than that in a control, it can be determined that the subject is highly likely to develop Alzheimer's disease.
  • the numbers of the CpG islands containing the 24th, 56th, 75th, 81st, 98th, 103rd, 115th, 120th, 126th, 134th, 142nd, 153rd, 177th, and 179th cytosine residues in the base sequence of the promoter region of the COASY gene shown in SEQ ID NO:1 are referred to as CpG island numbers 14 to 1, respectively.
  • Figure 1 shows the base sequence of the promoter region of the COASY gene shown in SEQ ID NO:1 and the positions of the CpG islands with CpG island numbers 1 to 14 in the base sequence.
  • Table 1 shows the relationship between the CpG island numbers and the positions of the cytosine residues in SEQ ID NO:1.
  • the biological sample is not particularly limited as long as DNA containing data for determining the possibility that the subject will develop Alzheimer's disease can be collected, and examples include blood, hair, saliva, skin, etc., with blood being preferred because it is less invasive and contains a large amount of DNA. More specifically, genomic DNA present in the biological sample is extracted, and the rate of DNA methylation in the CpG island in the promoter region of the COASY gene is measured.
  • CpG islands are regions in which the frequency of CpG, a two-base sequence (dinucleotide) in which cytosine is followed by guanine, is higher than in other regions in the genome.
  • the letter "p” in CpG represents the phosphodiester bond between cytosine and guanine.
  • Many mammalian genes are known to contain CpG islands within or near their promoters.
  • the Cg numbers (probe ID numbers used in the Illumina Infinium HD Methylation Assay Kit (manufactured by Ilumina)) of CpG islands 7, 6, 5, 4, and 1 are CG15138339, CG19618279, CG05465955, CG25135457, and CG01756799, respectively.
  • Detection of methylation of cytosine residues can be suitably carried out by a method utilizing bisulfite (hydrogen sulfite) treatment of DNA fragments.
  • bisulfite treatment By bisulfite treatment, cytosine residues are deaminated and converted to uracil residues, but methylated cytosine residues remain.
  • Bisulfite treatment can be carried out using a commercially available kit.
  • An example of a commercially available kit is the EZ DNA Methylation Kit (manufactured by Zymo Research).
  • the methylation of cytosine residues can be detected.
  • the proportion of methylated cytosine residues can be measured.
  • methylation of cytosine residues can be detected by PCR using a primer that identifies cytosine or uracil residues, using the bisulfite-treated DNA fragment as a template.
  • quantitative PCR is performed, and the proportion of methylated cytosine residues can be measured by creating a high-resolution melting curve for the PCR product as a function of reaction temperature.
  • a probe capable of hybridizing to the target region can be designed, and the DNA fragments after bisulfite treatment are subjected to whole genome amplification using an enzyme, then fragmented by enzymatic treatment, which is then hybridized to beads to which the probe is bound, and fluorescently labeled nucleotides are incorporated by a single-base extension reaction.
  • the fluorescence intensity is measured using a fluorescent dye-labeled antibody, and the proportion of methylated cytosine residues can be measured.
  • This method can be performed using a commercially available kit.
  • the proportion of methylation can be measured by bead analysis using an iScan (Illumina) using an Illumina Infinium HD Methylation Assay Kit (Illumina).
  • the bisulfite-treated DNA fragments can be used as templates to perform PCR amplification of the target region, which can then be transcribed into RNA and cleaved in a base-specific manner using RNase. Fragments with different molecular weights for methylated and unmethylated DNA can then be detected using a time-of-flight mass spectrometer to measure the proportion of methylated cytosine residues.
  • This method can be performed using a commercially available kit. For example, the proportion of methylation can be measured by analysis using MassARRAY EpiTYPER (manufactured by SEQUENOM).
  • methylation of cytosine residues can be detected by PCR using a primer that distinguishes between cytosine residues or uracil residues, using the bisulfite-treated DNA fragment as a template.
  • the proportion of methylated cytosine residues can be measured by performing quantitative PCR using probes labeled with two types of fluorescent dyes that can distinguish between cytosine residues or uracil residues.
  • the present invention provides a kit for determining the possibility that a subject will develop Alzheimer's disease, comprising a primer or probe for amplifying DNA of a CpG island containing a cytosine residue selected from the group consisting of the 24th, 56th, 75th, 81st, 98th, 103rd, 115th, 126th, 134th, 142nd, 153rd, and 179th cytosine residues in the base sequence of the promoter region of the COASY gene shown in SEQ ID NO:1.
  • the kit of this embodiment makes it possible to measure the percentage of DNA methylation in a CpG island that contains a cytosine residue selected from the group consisting of the 24th, 56th, 75th, 81st, 98th, 103rd, 115th, 126th, 134th, 142nd, 153rd, and 179th cytosine residues in the base sequence of the promoter region of the COASY gene.
  • a primer for amplifying the DNA of a CpG island (CpG island number 14) containing the 24th cytosine residue in the base sequence of the promoter region of the COASY gene shown in SEQ ID NO: 1 among the above cytosine residues is, for example, a primer set containing a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9, as shown in Table 2 below.
  • the primer may incorporate Locked Nucleic Acid (LNA) in all or part. By incorporating LNA into the primer, the melting temperature (Tm) of the double stranded DNA can be increased, and the binding to the target can be improved.
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • the forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 preferably has LNA at the 3rd and 20th thymine residues.
  • the reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 preferably has LNA at the 8th and 20th adenine residues.
  • examples of probes that amplify DNA of a CpG island (CpG island number 14) that contains the 24th cytosine residue in the base sequence of the promoter region of the COASY gene shown in SEQ ID NO:1 include a probe that detects methylated DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO:4 and a probe that detects unmethylated DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO:5, as shown in Table 3 below.
  • the kit of this embodiment may contain bisulfite in addition to the above-mentioned primers or probes. It may also contain various reagents for DNA extraction, hybridization and ligation, PCR reactions, etc., restriction enzymes, etc.
  • the present invention provides a method for treating Alzheimer's disease, comprising: measuring a percentage of DNA methylation in a CpG island containing a cytosine residue selected from the group consisting of cytosine residues at positions 24, 56, 75, 81, 98, 103, 115, 126, 134, 142, 153, and 179 in a base sequence of a promoter region of the COASY gene as shown in SEQ ID NO:1 in a biological sample from the subject; and treating the subject for Alzheimer's disease if the percentage of methylation is higher than that of a control.
  • the present inventor has revealed that in biological samples from subjects who are likely to develop Alzheimer's disease, the rate of DNA methylation in CpG islands containing cytosine residues selected from the group consisting of cytosine residues at positions 24, 56, 75, 81, 98, 103, 115, 126, 134, 142, 153, and 179 in the base sequence of the promoter region of the COASY gene shown in SEQ ID NO: 1 is significantly higher than that in controls. Therefore, if the rate at which these cytosine residues are methylated is significantly higher than that in controls, it can be determined that the subject is likely to develop Alzheimer's disease.
  • control, biological sample, and method for measuring DNA methylation of CpG islands are the same as those described above.
  • Methods for treating Alzheimer's disease include pharmacological therapies such as Aricept (registered trademark) and Reminyl (registered trademark), as well as well-known non-pharmacological therapies for the patient's behavioral and psychological symptoms.
  • Example 1 The subject's peripheral blood DNA was bisulfite-treated, and the promoter region of the COASY gene shown in SEQ ID NO: 1 was amplified by PCR using the pyrosequencing method with the bisulfite-treated DNA as a template.
  • a biotin-modified forward primer (5'-[Biotin]-GATTATGGGATAGGAGAAGTGTT-3') in which the 5' side of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 was modified with biotin
  • a reverse primer (5'-CCTAATCCAAAATCCCTCTTAC-3') consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7
  • a sequence primer (5'-ACCACAAACTACTCCTAA-3') consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 were used.
  • the obtained PCR amplification product was adsorbed onto beads, and sequenced from the 3' side of the base sequence of the promoter region of the COASY gene after the bisulfite treatment using PyroMark Q24 Advanced (Qiagen).
  • the sequence there are 14 CpG islands, with the first CpG island having a CpG island number of 1 and the last CpG island having a CpG island number of 14.
  • Figure 1 shows the base sequence of the promoter region of the COASY gene and the positions of the CpG islands with CpG island numbers 1 to 14.
  • peripheral blood DNA from 173 patients with amnesic mild cognitive impairment (MCI) and Alzheimer's disease (AD) and 200 healthy elderly people (NC) was treated with bisulfite using an EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research), and the bisulfite-treated DNA was sequenced by pyrosequencing in the same manner as above to measure the DNA methylation rate of CpG islands 1-14 in the promoter region of the COASY gene.
  • the CpG islands of CpG island numbers 1, 3 to 6, and 8 to 14 contain the cytosine residues at positions 24, 56, 75, 81, 98, 103, 115, 126, 134, 142, 153, and 179 in the base sequence of the promoter region of the COASY gene shown in SEQ ID NO: 1, respectively.
  • AUC Area Under the Curve
  • Figures 3A and 3B show amplification plots when the HsCOASY_m_probe and the HsCOASY_um_probe were used, respectively.
  • the HsCOASY_m_probe for detecting methylated DNA was able to amplify a sample with a methylation rate of 100%, but no amplification was observed for the other samples.
  • the HsCOASY_um_probe for detecting unmethylated DNA was able to amplify a sample with a methylation rate of 0%, but no amplification was observed for the other samples. This suggests that the reason for this is that the amplification efficiency of the primer set used is poor.
  • the melting temperature (Tm) of the double strand was increased by incorporating LNA into the primers, using a forward primer (hereinafter referred to as COASY_F_LNA) in which the 3rd and 20th thymine residues of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 were replaced with LNA, and a reverse primer (hereinafter referred to as COASY_R_LNA) in which the 8th and 20th adenine residues of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 were replaced with LNA.
  • Figures 4A and 4B show amplification plots when the HsCOASY_m_probe and HsCOASY_um_probe were used, respectively. As shown in FIG.
  • the HsCOASY_m_probe for detecting methylated DNA was able to amplify samples with methylation rates of 100%, 75%, and 50%.
  • the HsCOASY_um_probe for detecting unmethylated DNA was able to amplify samples with methylation rates of 0%, 5%, 25%, and 50%.
  • the PCR in this experimental example was not performed by digital PCR, if this experiment is performed by digital PCR, the measurement sensitivity can be improved. Therefore, from the above results, it is considered that all samples can be amplified if digital PCR is performed using the HsCOASY_m_probe and the HsCOASY_um_probe.
  • a calibration curve was created using bisulfite-modified DNA with methylation rates of 100%, 75%, 50%, 25%, 5%, and 0%, and the amount of methylated DNA was quantified in each sample using the HsCOASY_m_ probe, and the amount of unmethylated DNA was quantified using the HsCOASY_um_ probe. The sum of the amount of methylated DNA and the amount of unmethylated DNA was corrected to be 100%.
  • Figure 5 the rate of DNA methylation in the CpG island of CpG island number 14 was significantly higher in the combined AD and MCI patients compared to the NCs (P ⁇ 0.0001, Welch's t test).
  • the present invention provides a technology for determining the possibility of developing Alzheimer's disease.

Abstract

被験者がアルツハイマー病を発症する可能性を判定するためのデータ収集方法であって、前記被験者の生体試料中の、配列番号１で示されるＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列における第２４番目、第５６番目、第７５番目、第８１番目、第９８番目、第１０３番目、第１１５番目、第１２６番目、第１３４番目、第１４２番目、第１５３番目、及び第１７９番目のシトシン残基からなる群より選択されるシトシン残基を含むＣｐＧアイランドのＤＮＡのメチル化の割合を測定することを含み、前記割合が対照と比較して高いことが、前記被験者がアルツハイマー病を発症する可能性が高いことを示す、データ収集方法。

Description

アルツハイマー病を発症する可能性を判定するためのデータ収集方法及びキット
　本発明は、アルツハイマー病を発症する可能性を判定するためのデータ収集方法及びキットに関する。
　本願は、２０２２年１０月６日に、日本に出願された特願２０２２－１６１６０７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　アルツハイマー病は、代表的な認知症の一つである。アミロイドβ及びリン酸化タウが脳組織に沈着し、アルツハイマー病が発症すると考えられているが、その発症機序は不明である。遺伝的要因、加齢、生活習慣や感染等の環境因子等がエピジェネティクスに関与しており、これらの因子が発症に関与すると想定されている。
　アルツハイマー病の早期発見のための診断は、専門医の診察によって行われているが、正確な診断は難しく、また、発症前の診断はできない。また、検査法としては髄液中のアミロイドβの検出やＰＥＴ（陽電子放出形コンピュータ断層撮影）診断等が用いられているが、髄液中のアミロイドβの検出は侵襲性が高く、ＰＥＴ診断は高価であり、実施施設が限定されており、保険適応はなされておらず、臨床的実用性に乏しい。
　アルツハイマー病を診断するための血液バイオマーカーとして、現在、臨床応用されているものはない。本発明者は、健常人、アルツハイマー病及びその前段階である軽度認知障害患者で、網羅的に血液ＤＮＡメチル化量の変化を定量し、アルツハイマー病患者及び軽度認知障害患者では、NCAPH2（LMF2）遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡのメチル化が有意に低下しており、また、COASY遺伝子、SPINT1遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡのメチル化が有意に上昇していることを見出し、これらのバイオマーカーが認知症疾患の早期診断、鑑別に有用となる可能性があることを報告した（非特許文献１～３）。
Kobayashi N, Shinagawa S, Nagata T, Shimada K, Shibata N, Ohnuma T, Kasanuki K, Arai H, Yamada H, Nakayama K, Kondo K. Development of Biomarkers Based on DNA Methylation in the NCAPH2/LMF2 Promoter Region for Diagnosis of Alzheimer's Disease and Amnesic Mild Cognitive Impairment. PLoS One 2016;11(1): e0146449. Kobayashi N, Shinagawa S, Nagata T, Shimada K, Shibata N, Ohnuma T, Kasanuki K, Arai H, Yamada H, Nakayama K, Kondo K. Usefulness of DNA Methylation Levels in COASY and SPINT1 Gene Promoter Regions as Biomarkers in Diagnosis of Alzheimer's Disease and Amnestic Mild Cognitive Impairment. PLoS One 2016;11(12): e0168816. Kobayashi N, Shinagawa S, Niimura H, Kida H, Nagata T, Tagai K, Shimada K, Oka N, Shikimoto R, Noda Y, Nakajima S, Mimura M, Shigeta M, Kondo K. Increased blood COASY DNA methylation levels a potential biomarker for early pathology of Alzheimer's disease. Sci Rep 2020;10(1): 12217.
　しかしながら、ＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域には複数のＣｐＧアイランドがあり、これらのＣｐＧアイランドのうち、どのＣｐＧアイランドのメチル化がアルツハイマー病に関連するかは知られていない。本発明者は、ＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランドのうち、特定のＣｐＧアイランドのＤＮＡのメチル化の割合がアルツハイマー病発症の可能性を判定するのに有用であることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、ＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランドのうち、特定のＣｐＧアイランドのＤＮＡのメチル化の割合を測定することによる、被験者がアルツハイマー病を発症する可能性を判定するために有用な技術を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］被験者がアルツハイマー病を発症する可能性を判定するためのデータ収集方法であって、前記被験者の生体試料中の、配列番号１で示されるＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列における第２４番目、第５６番目、第７５番目、第８１番目、第９８番目、第１０３番目、第１１５番目、第１２６番目、第１３４番目、第１４２番目、第１５３番目、及び第１７９番目のシトシン残基からなる群より選択されるシトシン残基を含むＣｐＧアイランドのＤＮＡのメチル化の割合を測定することを含み、前記割合が対照と比較して高いことが、前記被験者がアルツハイマー病を発症する可能性が高いことを示す、データ収集方法。
［２］前記生体試料が血液である、［１］に記載のデータ収集方法。
［３］配列番号１で示されるＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列における第２４番目、第５６番目、第７５番目、第８１番目、第９８番目、第１０３番目、第１１５番目、第１２６番目、第１３４番目、第１４２番目、第１５３番目、及び第１７９番目のシトシン残基からなる群より選択されるシトシン残基を含むＣｐＧアイランドのＤＮＡを増幅するためのプライマー又はプローブを含む、被験者がアルツハイマー病を発症する可能性を判定するためのキット。
［４］配列番号１で示されるＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列における第２４番目のシトシン残基を含むＣｐＧアイランドのＤＮＡを増幅するプライマーが、配列番号２で示される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号９で示される塩基配列からなるリバースプライマーとを含むプライマーセットである、［３］に記載のキット。
　本発明によれば、被験者におけるアルツハイマー病発症の可能性を判定するために有用な技術を提供することができる。
配列番号１で示されるＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列と、ＣｐＧアイランド番号１～１４の位置を図１に示す。網掛けのＤＮＡ（ＣＧ）がＣｐＧアイランドの位置を示す。 非認知症高齢者（ＮＣ）と、アルツハイマー病（ＡＤ）患者と健忘型軽度認知障害（ＭＣＩ）とを合わせた患者とにおけるＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランド番号１～９のＤＮＡのメチル化の割合を示したグラフである。Ａ～Ｉが、それぞれＣｐＧアイランド番号１～９のＤＮＡのメチル化の割合を示す。 非認知症高齢者（ＮＣ）と、アルツハイマー病（ＡＤ）患者と健忘型軽度認知障害（ＭＣＩ）とを合わせた患者とにおけるＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランド番号１０～１４のＤＮＡのメチル化の割合を示したグラフである。Ｊ～Ｎが、それぞれＣｐＧアイランド番号１０～１４のＤＮＡのメチル化の割合を示す。 配列番号２で示される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３で示される塩基配列からなるリバースプライマーと、配列番号４で示される塩基配列からなる、メチル化ＤＮＡを検出するプローブとを用いて、メチル化率１００％、７５％、５０％、２５％、５％、０％のバイサルファイト化した、ＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランド番号１４のＤＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲを行ったときの増幅プロットを示す。 配列番号２で示される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３で示される塩基配列からなるリバースプライマーと、配列番号５で示される塩基配列からなる、非メチル化ＤＮＡを検出するプローブとを用いて、メチル化率１００％、７５％、５０％、２５％、５％、０％のバイサルファイト化した、ＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランド番号１４のＤＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲを行ったときの増幅プロットを示す。 配列番号２で示される塩基配列の３番目と２０番目のチミン残基をＬＮＡとしたフォワードプライマーと、配列番号９で示される塩基配列の８番目と２０番目のアデニン残基をＬＮＡとしたリバースプライマーと、配列番号４で示される塩基配列からなる、メチル化ＤＮＡを検出するプローブとを用いて、メチル化率１００％、７５％、５０％、２５％、５％、０％のバイサルファイト化した、ＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランド番号１４のＤＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲを行ったときの増幅プロットを示す。 配列番号２で示される塩基配列の３番目と２０番目のチミン残基をＬＮＡとしたフォワードプライマーと、配列番号９で示される塩基配列の８番目と２０番目のアデニン残基をＬＮＡとしたリバースプライマーと、配列番号５で示される塩基配列からなる、非メチル化ＤＮＡを検出するプローブとを用いて、メチル化率１００％、７５％、５０％、２５％、５％、０％のバイサルファイト化した、ＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランド番号１４のＤＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲを行ったときの増幅プロットを示す。 配列番号２で示される塩基配列の３番目と２０番目のチミン残基をＬＮＡとしたフォワードプライマーと、配列番号９で示される塩基配列の８番目と２０番目のアデニン残基をＬＮＡとしたリバースプライマーと、配列番号４で示される塩基配列からなる、メチル化ＤＮＡを検出するプローブ又は配列番号５で示される塩基配列からなる、非メチル化ＤＮＡを検出するプローブとを用いて、非認知症高齢者（ＮＣ）と、アルツハイマー病（ＡＤ）患者と健忘型軽度認知障害（ＭＣＩ）患者とを合わせた患者の血液中のＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランド番号１４のＤＮＡメチル化の割合を示したグラフである。
［データ収集方法］
　１実施形態において、本発明は、被験者がアルツハイマー病を発症する可能性を判定するためのデータ収集方法であって、配列番号１で示されるＣＯＡＳＹ遺伝子（NM_001042529）のプロモーター領域の塩基配列における第２４番目、第５６番目、第７５番目、第８１番目、第９８番目、第１０３番目、第１１５番目、第１２６番目、第１３４番目、第１４２番目、第１５３番目、及び第１７９番目のシトシン残基からなる群より選択されるシトシン残基を含むＣｐＧアイランドのＤＮＡのメチル化の割合を測定することを含み、前記割合が対照と比較して高いことが、前記被験者がアルツハイマー病を発症する可能性が高いことを示す、データ収集方法を提供する。
　実施例において後述するように、本実施形態の方法によれば、被験者がアルツハイマー病を発症する可能性があるか否かを判定するためのデータを収集することができる。なお、データ収集方法は医師が判断する工程を含まない。本実施形態の方法は、被験者がアルツハイマー病を発症する可能性があるか否かを判定する方法等といいかえることもできる。
　本実施形態の方法において、配列番号１で示されるＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列における第２４番目、第５６番目、第７５番目、第８１番目、第９８番目、第１０３番目、第１１５番目、第１２６番目、第１３４番目、第１４２番目、第１５３番目、及び第１７９番目のシトシン残基からなる群より選択されるシトシン残基を含むＣｐＧアイランドのＤＮＡのメチル化の割合が、被験者がアルツハイマー病を発症する可能性があるか否かを判定するためのデータである。
　また、本実施形態の方法において、対照とは、アルツハイマー病を発症していないことが予め明らかである被験者の生体試料中の前記ＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランドのＤＮＡのメチル化の割合である。アルツハイマー病を発症していないことが予め明らかである被験者としては、健常者、健常高齢者等が挙げられる。
　本実施形態の方法において、被験者の生体試料中の配列番号１で示されるＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列における第２４番目、第５６番目、第７５番目、第８１番目、第９８番目、第１０３番目、第１１５番目、第１２６番目、第１３４番目、第１４２番目、第１５３番目、及び第１７９番目のシトシン残基からなる群より選択されるシトシン残基を含む１又は複数のＣｐＧアイランドのＤＮＡのメチル化の割合を測定し、前記シトシン残基を含むＣｐＧアイランドのＤＮＡのメチル化の割合が、対照における割合と比較して高い場合は、被験者がアルツハイマー病を発症する可能性が高いと判定することができる。
　本明細書において、配列番号１で示されるＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列における第２４番目、第５６番目、第７５番目、第８１番目、第９８番目、第１０３番目、第１１５番目、第１２０番目、第１２６番目、第１３４番目、第１４２番目、第１５３番目、第１７７番目、第１７９番目のシトシン残基をそれぞれ含むＣｐＧアイランドの番号をそれぞれＣｐＧアイランド番号１４～１と称する。図１に配列番号１で示されるＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列と、当該塩基配列におけるＣｐＧアイランド番号１～１４のＣｐＧアイランドの位置を示す。表１に前記ＣｐＧアイランド番号と配列番号１におけるシトシン残基の位置との関係を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本実施形態の方法において、生体試料としては、被験者がアルツハイマー病を発症する可能性を判定するためのデータを含むＤＮＡが収集できれば、特に制限はなく、例えば、血液、毛髪、唾液、皮膚等が挙げられるが、侵襲性が低く、ＤＮＡが豊富に含まれる点において、血液が好ましい。より具体的には、生体試料中に存在するゲノムＤＮＡを抽出し、前記ＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランドのＤＮＡのメチル化の割合を測定する。
　ＣｐＧアイランドとは、シトシンの次にグアニンが現れる２塩基配列（ジヌクレオチド）であるＣｐＧの出現頻度が、ゲノム中の他の領域と比べて高い領域のことである。ＣｐＧの「ｐ」の文字は、シトシンとグアニンの間のホスホジエステル結合を表している。哺乳類の遺伝子の多くは、プロモーター内部又は近傍にＣｐＧアイランドを含んでいることが知られている。
　本実施形態の方法で用いられるＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランドのうち、ＣｐＧアイランド番号７、６、５、４、１のＣｇ番号（Ｉｌｌｕｍｉｎａ　Ｉｎｆｉｎｉｕｍ　ＨＤ　Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｉｌｕｍｉｎａ社製）で用いられているプローブのＩＤ番号）は、それぞれ、CG15138339、CG19618279、CG05465955、CG25135457、CG01756799である。
　シトシン残基のメチル化の検出は、ＤＮＡ断片のバイサルファイト（亜硫酸水素塩）処理を利用する方法により好適に行うことができる。バイサルファイト処理により、シトシン残基は脱アミノ化されてウラシル残基に変換されるが、メチル化されたシトシン残基はそのまま残る。バイサルファイト処理は、市販のキットを用いて行うことができる。市販のキットとしては、例えば、ＥＺ　ＤＮＡ　Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ｚｙｍｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）等が挙げられる。
　そこで、バイサルファイト処理後のＤＮＡ断片をシークエンスすることにより、シトシン残基のメチル化を検出することができる。ここで、次世代シークエンサーを用いて全ＤＮＡ断片の塩基配列をシークエンスすることにより、メチル化されたシトシン残基の割合を測定することができる。
　あるいは、バイサルファイト処理後のＤＮＡ断片を鋳型とし、シトシン残基又はウラシル残基を識別するプライマーを用いたＰＣＲ法によってもシトシン残基のメチル化を検出することができる。ここで、定量的ＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物に対して、反応温度による高解像能の融解曲線を作成することで、メチル化されたシトシン残基の割合を測定することができる。
　あるいは、標的の領域にハイブリダイズ可能なプローブを設計し、バイサルファイト処理後のＤＮＡ断片を、酵素により全ゲノム増幅を行った後、酵素処理により断片化し、これをプローブが結合したビーズにハイブリダイズさせ、一塩基伸長反応によって、蛍光標識されたヌクレオチドを取り込ませ、蛍光色素標識抗体を用いて、蛍光強度を測定することで、メチル化されたシトシン残基の割合を測定することができる。この方法は、市販のキットを用いて行うことができる。例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ　Ｉｎｆｉｎｉｕｍ　ＨＤ　Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｉｌｕｍｉｎａ社製）を用い、ｉＳｃａｎ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）によるビーズ解析によりメチル化の割合を測定することができる。
　あるいは、バイサルファイト処理後のＤＮＡ断片を鋳型とし、標的領域のＰＣＲ増幅を行った後、ＲＮＡに転写し、ＲＮａｓｅを用いて塩基特異的に切断し、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとで異なる分子量を持つ断片を飛行時間型質量分析計で検出し、メチル化されたシトシン残基の割合を測定することができる。この方法は、市販のキットを用いて行うことができる。例えば、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ　ＥｐｉＴＹＰＥＲ（ＳＥＱＵＥＮＯＭ社製）による解析によりメチル化の割合を測定することができる。
　あるいは、バイサルファイト処理後のＤＮＡ断片を鋳型とし、シトシン残基又はウラシル残基を識別するプライマーを用いたＰＣＲ法によってもシトシン残基のメチル化を検出することができる。ここで、シトシン残基またはウラシル残基を識別可能な２種類の蛍光色素に標識されたプローブを用いて、定量的ＰＣＲを行うことにより、メチル化されたシトシン残基の割合を測定することができる。
［キット］
　１実施形態において、本発明は、配列番号１で示されるＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列における第２４番目、第５６番目、第７５番目、第８１番目、第９８番目、第１０３番目、第１１５番目、第１２６番目、第１３４番目、第１４２番目、第１５３番目、及び第１７９番目のシトシン残基からなる群より選択されるシトシン残基を含むＣｐＧアイランドのＤＮＡを増幅するためのプライマー又はプローブを含む、被験者がアルツハイマー病を発症する可能性を判定するためのキットを提供する。
　本実施形態のキットにより、前記ＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列における第２４番目、第５６番目、第７５番目、第８１番目、第９８番目、第１０３番目、第１１５番目、１２６番目、第１３４番目、第１４２番目、第１５３番目、及び第１７９番目のシトシン残基からなる群より選択されるシトシン残基を含むＣｐＧアイランドのＤＮＡのメチル化の割合を測定することができる。
　上記シトシン残基のうち、配列番号１で示されるＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列における第２４番目のシトシン残基を含むＣｐＧアイランド（ＣｐＧアイランド番号１４）のＤＮＡを増幅するプライマーとしては、例えば、下記表２に示す、配列番号２で示される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号９で示される塩基配列からなるリバースプライマーとを含むプライマーセット等が挙げられる。プライマーは、その全部又は一部にＬｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）を組み込んでもよい。プライマーにＬＮＡを組み込むことにより、ＤＮＡの二本鎖の融解温度（Ｔｍ）を高め、標的との結合性を高めることができる。例えば、配列番号２で示される塩基配列からなるフォワードプライマーは、３番目と２０番目のチミン残基がＬＮＡとなっていることが好ましい。また、配列番号９で示される塩基配列からなるリバースプライマーは、８番目と２０番目のアデニン残基がＬＮＡとなっていることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　上記シトシン残基のうち、配列番号１で示されるＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列における第２４番目のシトシン残基を含むＣｐＧアイランド（ＣｐＧアイランド番号１４）のＤＮＡを増幅するプローブとしては、例えば、下記表３に示す、配列番号４で示される塩基配列からなるメチル化ＤＮＡを検出するプローブ、配列番号５で示される塩基配列からなる非メチル化ＤＮＡを検出するプローブ等が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本実施形態のキットは、上記のプライマー又はプローブのほかにも、亜硫酸水素塩を含んでいてもよい。また、ＤＮＡの抽出、ハイブリダイゼーション及びライゲーション、ＰＣＲ反応等のための各種試薬、制限酵素等を更に含んでいてもよい。
［その他の実施形態］
　１実施形態において、本発明は、前記被験者の生体試料中の、配列番号１で示されるＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列における第２４番目、第５６番目、第７５番目、第８１番目、第９８番目、第１０３番目、第１１５番目、第１２６番目、第１３４番目、第１４２番目、第１５３番目、及び第１７９番目のシトシン残基からなる群より選択されるシトシン残基を含むＣｐＧアイランドのＤＮＡのメチル化の割合を測定することと、前記メチル化の割合が対照と比較して高い場合に、前記被験者に、アルツハイマー病の治療を行うことと、を含む、アルツハイマー病の治療方法を提供する。
　上述したように、本発明者は、アルツハイマー病を発症する可能性が高い被験者の生体試料では、配列番号１で示されるＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列における第２４番目、第５６番目、第７５番目、第８１番目、第９８番目、第１０３番目、第１１５番目、第１２６番目、第１３４番目、第１４２番目、第１５３番目、及び第１７９番目のシトシン残基からなる群より選択されるシトシン残基を含むＣｐＧアイランドのＤＮＡのメチル化の割合が、対照における割合と比較して有意に高いことを明らかにした。したがって、これらのシトシン残基がメチル化されている割合が、対照における割合と比較して有意に高い場合、被験者はアルツハイマー病を発症する可能性が高いと判断することができる。
　本実施形態の治療方法において、対照、生体試料、ＣｐＧアイランドのＤＮＡのメチル化の測定方法等は上述したものと同様である。
　アルツハイマー病を治療する方法としては、アリセプト（登録商標）、レミニール（登録商標）等の薬物療法の他、患者の行動・心理症状に対する非薬物療法等の公知の方法を用いることができる。
　次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実験例１］
　被験者の末梢血ＤＮＡをバイサルファイト処理し、当該バイサルファイト処理したＤＮＡを鋳型として、パイロシーケンス法によるＰＣＲで、配列番号１で示されるＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域を増幅した。プライマーとしては、配列番号６で示される塩基配列の５’側をビオチン修飾したビオチン修飾フォワードプライマー（5’-[Biotin]-GATTATGGGATAGGAGAAGTGTT-3’)と、配列番号７で示される塩基配列からなるリバースプライマー（5’-CCTAATCCAAAATCCCTCTTAC-3’）と、配列番号８で示される塩基配列からなるシークエンスプライマー（5’-ACCACAAACTACTCCTAA-3’）とを用いた。得られたＰＣＲ増幅産物をビーズに吸着させ、ＰｙｒｏＭａｒｋ　Ｑ２４　Ａｄｖａｎｃｅｄ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、当該バイサルファイト処理後のＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列の３’側からシークエンスした。前記シークエンスにおいてＣｐＧアイランドは１４箇所あり、最初に現れるＣｐＧアイランドのＣｐＧアイランド番号を１とし、最後に現れるＣｐＧアイランドのＣｐＧアイランド番号を１４とした。図１にＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列と、ＣｐＧアイランド番号１～１４のＣｐＧアイランドの位置を示す。
　次に、健忘型軽度認知障害（ＭＣＩ）患者とアルツハイマー病（ＡＤ）患者を合わせた１７３名と健常高齢者（ＮＣ）２００名の末梢血ＤＮＡ０．５～１．０μｇを、ＥＺ　ＤＮＡ　Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ｚｙｍｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて、バイサルファイト処理をし、当該バイサルファイト処理をしたＤＮＡを、上記と同様にパイロシーケンス法によってシークエンスし、ＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランド番号１～１４のＣｐＧアイランドのＤＮＡのメチル化の割合をそれぞれ測定した。
　その結果を図２Ａ及び図２Ｂに示す。図２Ａ及び図２Ｂに示したように、ＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列において、ＣｐＧアイランド番号２、７を除く、ＣｐＧアイランド番号１、３～６、８～１４のＣｐＧアイランドのＤＮＡのメチル化の割合が、アルツハイマー病（ＡＤ）患者及び健忘型軽度認知障害（ＭＣＩ）患者の方が、非認知症高齢者（ＮＣ）と比較して有意に高かった。ＣｐＧアイランド番号１、３～６、８～１４のＣｐＧアイランドは、それぞれ、配列番号１で示されるＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列における第２４番目、第５６番目、第７５番目、第８１番目、第９８番目、第１０３番目、第１１５番目、第１２６番目、第１３４番目、第１４２番目、第１５３番目、第１７９番目のシトシン残基を含んでいる。
　次に、ＣｐＧアイランド番号１～１４のＣｐＧアイランドについて、ＮＣとＡＤ患者及びＭＣＩ患者を合わせた患者とを分けるＲＯＣ曲線のＡｒｅａ　Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　Ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）を算出した。その結果を表４に示す。表４に示したように、ＣｐＧアイランド番号１４のＣｐＧアイランドのＤＮＡのメチル化量によるＡＵＣ値が最も高値であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
［実験例２］
　次に、ＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランド番号１４のＣｐＧアイランドのＤＮＡのメチル化量の測定法を構築した。
　配列番号２で示される塩基配列（5’-GATTATGGGATAGGAGAAGTG-3’）からなるフォワードプライマーと、配列番号３で示される塩基配列からなるリバースプライマー（5’-AACTACTCCTAAACCAAAATACAC-3’）とからなるプライマーセットと、配列番号４で示される塩基配列からなる、メチル化ＤＮＡを検出するプローブ（以下、ＨｓＣＯＡＳＹ＿ｍ＿プローブと称する）又は配列番号５で示される塩基配列からなる、非メチル化ＤＮＡを検出するプローブ（以下、ＨｓＣＯＡＳＹ＿ｕｍ＿プローブと称する）と、を用いて、メチル化率１００％、７５％、５０％、２５％、５％、０％のバイサルファイト化した、ＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランド番号１４のＣｐＧアイランドのＤＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲを行った。図３Ａ、図３Ｂに、それぞれＨｓＣＯＡＳＹ＿ｍ＿プローブ、ＨｓＣＯＡＳＹ＿ｕｍ＿プローブを用いた場合の増幅プロットを示す。
　図３Ａに示したように、メチル化ＤＮＡを検出するＨｓＣＯＡＳＹ＿ｍ＿プローブでは、メチル化率１００％のサンプルは増幅可能であったが、そのほかのサンプルは増幅を認めなかった。また、図３Ｂに示したように、非メチル化ＤＮＡを検出するＨｓＣＯＡＳＹ＿ｕｍ＿プローブでは、メチル化率０％のサンプルは増幅可能であったが、そのほかのサンプルは増幅を認めなかった。その理由としては、使用したプライマーセットでは増幅効率が不良であることが示唆された。
　そこで、プライマーにＬＮＡを組み込み、配列番号２で示される塩基配列の３番目と２０番目のチミン残基をＬＮＡとしたフォワードプライマー（以下、ＣＯＡＳＹ＿Ｆ＿ＬＮＡと称する）と、配列番号９で示される塩基配列の８番目と２０番目のアデニン残基をＬＮＡとしたリバースプライマー（以下、ＣＯＡＳＹ＿Ｒ＿ＬＮＡと称する）を用い、二本鎖の融解温度（Ｔｍ）を高めた。図４Ａ、図４ＢにそれぞれＨｓＣＯＡＳＹ＿ｍ＿プローブ、ＨｓＣＯＡＳＹ＿ｕｍ＿プローブを用いた場合の増幅プロットを示す。
　図４Ａに示したように、メチル化ＤＮＡを検出するＨｓＣＯＡＳＹ＿ｍ＿プローブでは、メチル化率１００％、７５％及び５０％のサンプルが増幅可能であった。また、図４Ｂに示したように、非メチル化ＤＮＡを検出するＨｓＣＯＡＳＹ＿ｕｍ＿プローブでは、メチル化率０％、５％、２５％及び５０％のサンプルが増幅可能であった。なお、本実験例のＰＣＲはデジタルＰＣＲで行わなかったが、本実験をデジタルＰＣＲで行えば、測定感度を向上させることができるため、上記の結果から、ＨｓＣＯＡＳＹ＿ｍ＿プローブ及びＨｓＣＯＡＳＹ＿ｕｍ＿プローブを用いてデジタルＰＣＲを行えば、全てのサンプルが増幅可能であると考えられる。
［実験例３］
　フォワードプライマーとしてＣＯＡＳＹ＿Ｆ＿ＬＮＡ、リバースプライマーとしてＣＯＡＳＹ＿Ｒ＿ＬＮＡを用い、プローブとして、メチル化ＤＮＡを検出するＨｓＣＯＡＳＹ＿ｍ＿プローブと、非メチル化ＤＮＡを検出するＨｓＣＯＡＳＹ＿ｕｍ＿プローブを用いて、ＡＤ患者とＭＣＩ患者を合わせた患者５名及びＮＣ９名の血液中ＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランド番号１４のＣｐＧアイランドのＤＮＡのメチル化量を測定した。具体的には、メチル化率１００％、７５％、５０％、２５％、５％、０％のバイサルファイト化されたＤＮＡを用いて、検量線を作成し、各サンプルで、ＨｓＣＯＡＳＹ＿ｍ＿プローブを用いてメチル化ＤＮＡ量を定量し、ＨｓＣＯＡＳＹ＿ｕｍ＿プローブを用いて非メチル化ＤＮＡ量を定量した。メチル化ＤＮＡ量と非メチル化ＤＮＡ量の合計は１００％になるように補正した。
　その結果を図５に示す。図５に示したように、ＡＤ患者とＭＣＩ患者を合わせた患者ではＮＣと比較して、ＣｐＧアイランド番号１４のＣｐＧアイランドのＤＮＡのメチル化の割合が有意に高値であった（P<0.0001, Welch’s t test）。
　本発明によれば、アルツハイマー病を発症する可能性を判定する技術を提供することができる。

Claims (4)

  1. 　被験者がアルツハイマー病を発症する可能性を判定するためのデータ収集方法であって、
    　前記被験者の生体試料中の、配列番号１で示されるＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列における第２４番目、第５６番目、第７５番目、第８１番目、第９８番目、第１０３番目、第１１５番目、第１２６番目、第１３４番目、第１４２番目、第１５３番目、及び第１７９番目のシトシン残基からなる群より選択されるシトシン残基を含むＣｐＧアイランドのＤＮＡのメチル化の割合を測定することを含み、
    　前記割合が対照と比較して高いことが、前記被験者がアルツハイマー病を発症する可能性が高いことを示す、データ収集方法。
  2. 　前記生体試料が血液である、請求項１に記載のデータ収集方法。
  3. 　配列番号１で示されるＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列における第２４番目、第５６番目、第７５番目、第８１番目、第９８番目、第１０３番目、第１１５番目、第１２６番目、第１３４番目、第１４２番目、第１５３番目、及び第１７９番目のシトシン残基からなる群より選択されるシトシン残基を含むＣｐＧアイランドのＤＮＡを増幅するためのプライマー又はプローブを含む、被験者がアルツハイマー病を発症する可能性を判定するためのキット。
  4. 　配列番号１で示されるＣＯＡＳＹ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列における第２４番目のシトシン残基を含むＣｐＧアイランドのＤＮＡを増幅するプライマーが、配列番号２で示される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号９で示される塩基配列からなるリバースプライマーとを含むプライマーセットである、請求項３に記載のキット。
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