KR102152893B1

KR102152893B1 - 간세포암종 특이 mlh1 유전자에 대한 순환 종양 dna 변이 검출 용도

Info

Publication number: KR102152893B1
Application number: KR1020190099360A
Authority: KR
Inventors: 김순선; 정재연; 은정우; 조효정
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2019-05-15
Filing date: 2019-08-14
Publication date: 2020-09-07

Abstract

본 발명은 간세포암종 특이 MLH1 유전자에 대한 순환 종양 DNA 변이 검출 용도에 관한 것으로서, 본 발명은 조직검사 및 영상촬영 기술을 사용하지 않고 비침습적 생물학적 시료인 환자의 혈액을 이용해 간편하고, 효과적이며, 예후 예측이 가능한 간세포암종 변이 (somatic mutation)를 확인할 수 있는 조성물을 제공한다.

Description

간세포암종 특이 MLH1 유전자에 대한 순환 종양 DNA 변이 검출 용도{Use for detection of hepatocellular carcinoma specific MLH1 circulating tumor DNA mutation}

본 발명은 간세포암종 특이 예후 지표로서의 MLH1 유전자에 대한 순환 종양 DNA (circulating tumor DNA, ctDNA) 변이 검출에 관한 것이다. 본 발명을 이용하여 혈액 내 ctDNA에 존재하는 간세포암종 특이 MLH1 변이를 검출할 수 있으며, 간세포암종 특이 바이오마커 조성물, 이를 포함하는 간세포암종 진단 및 예후 예측용 키트 및 이에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

간세포암종 (hepatocellular carcinoma)은 한국인에게 많이 생기는 암종 중 하나로, 2015년에는 발생률이 10만명당 남자 29.5명, 여자 8.2명으로 남성에서 4위, 여성에서 6위를 차지하였고, 사망률도 높아 2015년 전체 암사망자 중 간세포암종이 남성에서 2위, 여성에서 3위를 차지하였다.

간세포암종은 조기 진단될 경우 간절제술, 간이식과 같은 수술적 치료법 및 고주파열치료, 경동맥화학색전술 등 비수술적 치료법 등으로 높은 치료성적을 얻을 수 있다. 간세포암종의 병기별 생존율은 1기 52.0%, 2기 36.0%로 조기에는 상당한 생존률을 보이나 3기에서는 15.0%에 불과하고 4기로 진행되면 6%대로 급격한 감소를 보인다.

간세포암종은 진단을 위해 조직검사가 필수가 아닌 대표적인 암이며, 간 조직검사는 출혈, 감염, 기흉 등 여러 가지 위험한 합병증을 초래할 수 있어 대부분의 간세포암종은 조직검사 없이 영상학적으로 진단된다. 따라서 조직을 이용한 연구에 제한이 있다. 또한 같은 암이라 하더라도 조직검사로 얻은 조직의 위치 및 시간에 따라 다양하고 이질적인 변이를 보일 수 있는데, 혈액은 조직검사와 달리 치료 과정 중 여러번 채혈이 가능하고, 전체 종양의 특성을 반영할 수 있어 간세포암종에서 혈액을 이용한 액체 생체검사는 혁신 기술 중 하나로 알려져 있다.

실제로 간세포암종의 이질성에 관한 한 연구에 따르면, 23명의 간세포암종 환자를 분류해보았을 때, 형태학적 이질성은 87%에서 관찰되었고, 면역염색 (CK7, CD44, AFP, EpCAM, glutamine synthetase) 이질성은 39%에서, 간세포암종 유발 유전자로 잘 알려진 TP53, CTNNB1 두 개 유전자 시퀀싱을 이용한 유전적 이질성은 22%에서 관찰되었다. 간세포암종에서 발견되는 유전적 변화가 이 두 개 유전자에 국한되지 않는다는 점을 고려한다면 유전학적 이질성은 매우 복잡할 것으로 예상할 수 있다.

순환 종양 DNA (circulating tumor DNA, ctDNA)는 인간의 몸에서 죽어가는 (apoptotic or necrotic) 종양 세포에서 배출되며, 암 환자에서 종양의 크기 및 진행과 연관이 있다고 보고되고 있다. 종양세포에서 분비되는 ctDNA는 특징적인 유전적 혹은 후생학적 변화를 동반한다고 알려져있다 (예, point mutation, copy number variation, chromosomal rearrangement, DNA methylation pattern).

간세포암종 환자에서 이러한 혈액의 ctDNA를 이용한다면, 조직 생검 없이 간세포암종 환자에서 종양 조직의 유전학적 이질성을 극복할 수 있는 특이 변이를 검출할 수 있다. 이는 환자의 고통을 경감시키고, 치료 중 연속적인 평가를 가능하게 함으로써 간세포암종 환자의 치료 방향을 결정하고, 예후를 예측하여 정밀의료를 실현하는데 도움이 될 수 있다.

한국공개특허 10-2016-0059446 (2016.05.26 공개)

본 발명의 목적은 MLH1(chr3:37025749_T>A) 단일염기다형성 마커를 함유하는 간세포암종 진단용 SNP 마커 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 MLH1(chr3:37025749_T>A) 단일염기다형성 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 함유하는 간세포암종 진단용 조성물 및 이를 포함하는 간세포암종 진단용 키트를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 MLH1(chr3:37025749_T>A) 단일염기다형성 마커의 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는 간세포암종 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 MLH1(chr3:37025749_T>A) 단일염기다형성 마커를 함유하는 간세포암종 예후 예측용 SNP 마커 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 MLH1(chr3:37025749_T>A) 단일염기다형성 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 함유하는 간세포암종 예후 예측용 조성물 및 이를 포함하는 간세포암종 예후 예측용 키트를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 MLH1(chr3:37025749_T>A) 단일염기다형성 마커의 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는 간세포암종 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 함유하는 간세포암종 진단용 SNP 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 함유하는 간세포암종 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 간세포암종 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 분리된 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출한 DNA로부터 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계; 및 상기 확인된 유전자형이 변이형인 경우, 간세포암종이라고 판단하는 단계를 포함하는 간세포암종 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 함유하는 간세포암종 예후 예측용 SNP 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 함유하는 간세포암종 예후 예측용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 간세포암종 예후 예측용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 분리된 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출한 DNA로부터 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계; 및 상기 확인된 유전자형이 변이형인 경우, 간세포암종 예후가 나쁠 것으로 예측하는 단계를 포함하는 간세포암종 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

도 1은 본 발명에서 사용된 순환 종양 DNA (ctDNA) 추출 프로토콜이다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명에 사용된 ctDNA 표적 심층 염기서열분석(targeted deep sequencing; TDS) 파이프라인 및 FastQC의 ctDNA 데이터 질 측정의 예이다.
도 3은 본 발명의 간세포암종 환자 59명의 ctDNA를 TDS 시행하여 확인한 체세포 돌연변이 프로파일이다.
도 4는 본 발명의 TDS에서 발굴된 12개 유전자 영역별 변이 빈도 및 기능적 변이 유형 분석이다.
도 5는 본 발명의 MLH1, CTNNB1, PTEN, STK11 유전자 변이에 대한 ddPCR 결과 대표 2D 이미지이다.
도 6은 본 발명의 간세포암종 환자 62명 검증 코호트 혈액에서 ddPCR 검출 결과이다.
도 7a 및 도 7b는 본 발명의 ddPCR 분석에서 ctDNA 변이가 검출된 22명의 유전자 변이 지도 및 TDS 시행 환자와 ddPCR 시행 환자에서의 ctDNA 특이 4개 유전자 (MLH1, CTNNB1, PTEN, STK11) 빈도이다.
도 8a 및 도 8b는 간세포암종 환자 37명의 간조직 DNA에서 MLH1, STK11 변이 검출 결과 및 ctDNA 변이 검출 여부와의 결과이다.
도 9a 및 도 9b는 간세포암종 진행성 병기에서 MLH1의 변이 [mut는 변이 (mutation)를 의미함] 유무에 따른 생존률 및 CTNNB1/PTEN/STK11 변이 유무에 따른 생존률이다.
도 10은 본 발명의 MLH1의 변이 및 ctDNA 정량값에 따른 간세포암종 환자의 생존률이다.

본 발명은 간세포암종 특이 예후 지표로서의 MLH1 유전자에 대한 순환 종양 DNA (circulating tumor DNA, ctDNA) 변이 검출 용도에 대한 것으로, 본 발명자들은 조직검사 및 영상촬영 기술을 사용하지 않고 비침습적 생물학적 시료인 환자의 혈액을 이용해 간편하고, 효과적이며, 예후 예측이 가능한 간세포암종 변이 (somatic mutation)를 확인하기 위해, 다음과 같은 방법들을 수행하고, 본 발명을 완성하였다.

1. 간세포암종 환자의 혈액에서 순환 종양 DNA (circulating tumor DNA, ctDNA) 추출 및 표적 심층 염기서열분석(targeted deep sequencing; TDS)을 이용한 유전자 변이 검출

2. TDS에서 검출된 변이 검증을 위한 드랍렛 디지털 중합효소연쇄반응(droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR) 분석

3. ctDNA 특이 후보 유전자와 간세포암종 환자의 임상적 연계성 분석

본 발명은 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 함유하는 간세포암종 진단용 SNP 마커 조성물을 제공한다.

상세하게는 상기 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 대립유전자형은 T>A일 수 있다.

상기 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 단일염기다형성(SNP) 변이는 MLH1(chr3:37025749_T>A)이며, rs63750447로 표시하여 기재할 수 있다. 상기 단일염기다형성(SNP) 변이는 Chromosome 3 상의 MLH1 유전자 내에 존재하며, 대립유전자형은 T>A이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "n N>M" (이때, n은 정수이고, N 및 M은 각각 독립적으로 A, C, T 또는 G이다.)은 유전자 염기서열에서 n번째 N 염기가 M 염기로 변이된 것을 의미한다.

상기 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드는 다중염기기재 방식에 따라 작성하였는데, T 또는 A일 수 있으므로 "w"라고 기재하였다.

본 명세서에서 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한, 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)를 포함한다.

본 명세서에서 용어 "다형성(polymorphism)"은 단일 유전자 좌위에 두 가지 이상의 대립 유전자가 존재하는 경우를 의미하며, '다형성부위(polymorphic site)'란 상기 대립 유전자가 존재하는 유전자 좌위를 의미한다. 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 상이한 것을 ‘단일염기다형성’, 즉 SNP(single nucleotide polymorphism)라고 한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 간세포암종 진단용 키트를 제공한다. 상기 키트는 PCR 키트 또는 DNA 칩 키트가 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 "프로브"는 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.

상기 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.

바람직하게는, 상기 DNA는 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 분리된 시료로부터 DNA를 추출하는 단계에서, DNA는 대상의 혈액, 피부세포, 점막 세포 및 모발 등 모든 세포로부터 분리될 수 있다. 해당 세포로부터 DNA를 추출하는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 기술 또는 시판되고 있는 DNA 추출용 키트를 사용할 수 있다. 본 발명의 실시예에서 상기 시료는 혈액이 가장 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 유전자형을 확인하는 단계에서는 유전자 서열 분석이 수행될 수 있다. 서열분석은 당업계에 공지된 방법을 모두 이용할 수 있으며, 구체적으로는 이에 제한되는 것은 아니나, 자동염기서열분석기를 사용하거나, 표적 심층 염기서열분석(targeted deep sequencing; TDS), 드랍렛 디지털 중합효소연쇄반응(droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR), 파이로시퀀싱(pyrosequencing), PCR-RELP법(restriction fragment length polymorphism), PCR-SSCP법(single strand conformation polymorphism), PCR-SSO법(specific sequence oligonucleotide), PCR-SSO법과 도트 하이브리드화법을 조합한 ASO(allele specific oligonucleotide) 하이브리드화법, TaqMan-PCR법, MALDI-TOF/MS법, RCA법(rolling circle amplification), HRM(high resolution melting)법, 프라이머 신장법, 서던 블롯 하이브리드화법 및 도트 하이브리드화법 등의 공지의 방법 중 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 간세포암종 예후 예측용 키트를 제공한다. 상기 키트는 PCR 키트 또는 DNA 칩 키트가 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 "예후 예측"은 질환의 경과 및 결과를 미리 예측하는 행위를 의미한다. 보다 구체적으로, 예후 예측이란 질환의 치료 후 경과는 환자의 생리적 또는 환경적 상태에 따라 달라질 수 있으며, 이러한 환자의 상태를 종합적으로 고려하여 치료 후 병의 경과를 예측하는 모든 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명의 목적상 상기 예후 예측은 간세포암종 치료 후, 질환의 경과 및 완치 여부를 미리 예상하여 간세포암종 환자의 무병 생존율 또는 생존율을 예측하는 행위로 해석될 수 있다. 예를 들어, "예후가 좋다"라고 예측하는 것은 간세포암종 치료 후 간세포암종 환자의 무병 생존율 또는 생존율이 높은 수준을 나타내어, 간세포암종 환자가 치료될 가능성이 높다는 것을 의미하고, "예후가 나쁘다"라고 예측하는 것은 간세포암종 치료 후 간세포암종 환자의 무병 생존율 또는 생존율이 낮은 수준을 나타내어, 간세포암종 환자로부터 암이 재발하거나 또는 암으로 인하여 사망할 가능성이 높다는 것을 의미한다.

본 발명은 PCR 키트 또는 DNA 칩 키트 형태로 적용될 수 있는데, 상기 키트는 본 발명에서 제공하는 SNP의 염기를 증폭을 통해 확인하거나, 또는 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 간세포암종을 진단하거나, 간세포암종의 예후를 예측할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "DNA 칩"이란, 수십만 개의 DNA의 각 염기를 한 번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다. 상기 DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지 않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구이다.

이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

< 실시예 1> 간세포암종 환자의 혈액에서 순환 종양 DNA (circulating tumor DNA, ctDNA ) 추출 및 표적 심층 염기서열분석(targeted deep sequencing; TDS )을 이용한 유전자 변이 검출

간세포암종 특이 체세포 돌연변이(somatic mutation)를 환자 혈액에서 추출한 ctDNA에서 확인하기 위하여, 간세포암종 환자 59명에서 도 1의 프로토콜대로 ctDNA 전용튜브를 이용하여 전향적으로 수집된 혈액을 이용하여 샘플링 후 가능한 2시간 내에 (최대 6시간내) ctDNA prep을 시행하였다.

총 69개 유전자, 1,963개 변이 영역을 검출할 수 있는 패널을 제작하여 표적 심층 염기서열분석(targeted deep sequencing; TDS)을 진행한 결과(도 2a 및 도 2b), 12개 유전자 영역에서 25개 변이 영역이 검출됨을 확인하였다(도 3).

TP53이 17%로 가장 빈도 높게 검출되었으며, KIT과 STK11이 14%로 동일하게 검출되었고, 다음으로는 MLH1이 10%, CTNNB1과 PTEN이 동일하게 7%, CDKN2A가 3%, SMO, VHL, NFE2L2, NPM1, EGFR이 각 2%로 검출되었다.

혈액 ctDNA에서 검출된 12개 유전자 변이 영역별로 조사하여 변이 지도(도 4)를 그렸을 때, 변이가 검출된 총 47명의 환자에서 KIT(chr4:54727315_A>G) 영역이 8명 변이가 일어났으며 약 17%로 가장 빈도가 높았다. 다음으로는 MLH1(chr3:37025749_T>A) 영역과 STK11(chr19:1223126_C>G) 영역이 각각 6명씩 (13%) 검출되었으며, PTEN(chr10:87864461_C>G) 영역이 4명으로 9%로 검출되었다. CTNNB1(chr3:41224610_C>T)과 STK11(chr19:1207009_C>G)이 2명으로 4% 변이가 검출되었다.

< 실시예 2> TDS에서 검출된 변이 검증을 위한 드랍렛 디지털 중 합효소연쇄반응 (droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR ) 분석

TDS에서 검출된 12개 유전자 중 검증코호트에서 혈액 ctDNA의 특이 변이 유전자를 검출하기 위하여 변이 영역의 빈도와 아미노산 변화를 고려하여 최종적으로 MLH1(chr3:37025749_T>A), STK11(chr19:1223126_C>G), PTEN(chr10:87864461_C>G), CTNNB1(chr3:41224610_C>T)를 선정하였다.

혈액내 소량의 ctDNA 변이를 정확히 검출하기 위한 검증법으로 본 발명자들은 ddPCR를 선택하였고, 실험 방법은 아래와 같다.

Droplet Digital PCR System은 20ul의 PCR 반응을 2만개 droplet으로 쪼개어 증폭시킨 후, target DNA를 계수하는 시스템이다. QZ200 Droplet Digital PCR Workflow는 분석하고자 하는 시료와 Probe (FAM, HEX/VIC) 또는 EvaGreen 형광염료를 포함하여 PCR 반응액을 20ul로 준비하여 PCR 반응액과 오일을 카트리지에 분주해 Droplet Generator에 장착하여 2분 만에 자동으로 각 샘플당 2만개의 droplet이 생성된다. 생성된 droplets를 96-well PCR plate에 옮긴 후, 그 plate를 일반 96-well 타입의 PCR에 장착하여 PCR 반응을 진행한다. PCR 반응이 완료되면 plate를 그대로 옮겨서 Droplet Reader로 장착한 뒤 Reader와 연동된 QuantaSoft를 통해 최대 96개 샘플의 형광 신호를 각각 감지 및 positive와 negative droplet의 수를 세어, 자동으로 분석하고자 하는 유전자의 copy 수를 계산하여 분석까지 완료하게 된다.

본 발명에서는 4개 유전자에 대한 변이를 측정하기 위하여 각각의 유전자에 대한 야생형(wild), 돌연변이(mutant) 형광을 다음과 같이 설정 후 분석을 시행하였다. 도 5는 결과에 대한 대표적인 2D 이미지이다.

총 62명의 간세포암종 환자의 검증코호트 혈액 샘플에서 4개의 ctDNA 특이 유전자 변이에 대한 결과는 도 6과 같다.

ddPCR 시행 간세포암종 환자 62명 중에서 4개의 유전자 변이를 분석한 결과, 총 22명의 환자에서 24개의 ctDNA 특이 변이를 검출할 수 있었으며, 이 중에서 11명은 TDS에서도 동일하게 변이가 검출된 것으로 확인되었다(도 7a).

64명의 TDS 시행 환자와 62명의 ddPCR 시행 환자의 ctDNA 특이 유전자 변이를 비교해 본 결과, 전체 변이 검출 빈도는 ddPCR이 높게 나타났으며, CTNNB1의 경우, TDS 시행 환자에서는 4명 검출되었지만 검증 코호트인 ddPCR에서는 검출되지 않았다. PTEN과 SKT11은 동일한 비율로 검출되었고, MHL1의 경우는 TDS에 비해서 약 2배 가량 높은 검출율을 보였다(도 7b).

< 실시예 3> 간세포암종 특이 후보 유전자의 조직 DNA(tumor DNA, tDNA) 변이 검증 및 ctDNA 변이와의 비교 분석

ctDNA에서 검출된 유전자 변이가 간세포암종 조직으로부터 유래된 것인지 확인하기 위해 ddPCR을 시행한 62명의 간세포암종 환자 중 조직 확보가 가능한 37명의 환자를 대상으로 조직 DNA(tDNA)를 추출하고 이를 ddPCR 방법으로 분석하였다.

유전자는 ctDNA ddPCR에서 가장 검출빈도가 높았던 MLH1과 STK11 유전자를 선정하였다.

도 8a는 37개의 간세포암종 tDNA에서 ddPCR을 실시한 결과이며, 도 8b는 ctDNA ddPCR과 비교한 결과이다. MLH1과 STK11 모두 혈액 ctDNA에서 변이가 검출된 환자의 경우 조직 cDNA에서도 동일하게 변이가 관찰되었으며, MLH1의 경우 1명의 환자에서 조직에서만 변이가 관찰되었다.

< 실시예 4> ctDNA 특이 후보 유전자 변이, ctDNA 정량값과 간세포암종 환자의 임상적 연계성 분석

ctDNA를 추출하여 TDS를 시행하거나 ddPCR을 시행한 총 107명의 환자들의 임상 정보를 활용하여 ctDNA 특이 유전자 변이, ctDNA 정량값과 간세포암종 환자의 임상적 연관성에 대하여 분석하고자 하였다.

혈액 ctDNA 특이 유전자 변이와 임상적 연관성을 확인한 결과 MLH1의 경우 바르셀로나 병기 (BCLC stage)와 통계적으로 유의한 연관성이 있는 것으로 나타났고 (P=0.025), STK11, PTEN, CTNNB1의 경우 단독 유전자 변이와 임상적 연관성이 없는 것으로 나타났다 (표 1).

Total set (n=107)	*MLH1*	*STK11*	*PTEN*	*CTNNB1*	*4 genes*
Gender (Male)	P=0.811	P=0.088	P=0.183	P=0.344	P=0.138
Age (>50 years)	P=0.624	P=0.493	P=0.783	P=0.236	P=0.971
Etiology	P=0.731	P=0.956	P=0.41	P=0.788	P=0.497
Child Pugh class	P=0.735	P=0.605	P=0.111	P=0.657	P=0.669
MELD	P=0.794	P=0.807	P=0.903	P=0.865	P=0.508
AFP (>200ng/ml)	P=0.092	P=0.301	P=0.434	P=0.566	P=0.771
PIVKA-II (>40mAU/mL)	P=0.662	P=0.715	P=0.594	P=0.241	P=0.731
Vascular invasion	P=0.671	P=0.352	P=0.682	P=0.89	P=0.354
BCLC stage	P=0.025*	P=0.735	P=0.072	P=0.866	P=0.097

107명의 간세포암종 환자를 대상으로 4개의 유전자 변이 유무를 기준으로 하여 사망과의 연관성을 분석한 결과, 전체 병기에서 사망과의 연관성을 보이는 유전자 변이는 관찰되지 않았으나, 진행성 병기에 해당하는 BCLC C 병기와, mUICC IV 병기에서 MLH1의 변이가 있는 환자군이 예후가 불량한 것으로 판명되었다(도 9a). CTNNB1, PTEN, STK11 유전자 변이 유무와 BCLC C 병기와, mUICC IV 병기에 있는 간세포암종 환자의 예후 분석을 시행한 결과 통계적으로 유의하지 않은 결과를 보였다(도 9b).

따라서 환자의 예후와 관련된 혈액 ctDNA 특이 유전자 변이로는 MLH1임을 확인할 수 있었다.

또한 107명의 간세포암종 환자를 대상으로 ctDNA 양(정량값)과 임상적 연관성에 대하여 분석하였으며 ctDNA 정량값은 다음과 같은 식으로 계산하였다.

ctDNA 양 (ng/mL) = ctDNA 농도 (ng/ul) × 추출 buffer 양 (ul) / Plasma 양 (ml)

ctDNA 정량값의 중간값 (5.77 ng/ml)을 기준으로 ctDNA 정량값이 높은 군과 낮은 군으로 나누어 간세포암종 병기 및 혈관 침범 여부에 따라 비교하였을 때, BCLC 및 mUICC 병기가 높을수록 ctDNA 정량값이 높은 군의 비율이 통계적으로 유의하게 증가하며, 혈관침범 여부와도 연관성이 있는 것으로 나타났다. 또한 ctDNA 정량값이 높은 군의 생존률이 낮았다(도 10a).

또한 107명의 간세포암종 환자를 대상으로 ctDNA 정량값 및 MLH1 서열변이를 함께 조합하여 사망과의 연관성을 분석하였을 때도, ctDNA 정량값이 낮으면서 MLH1이 야생형(wild type)인 환자군이 가장 예후가 좋았고, ctDNA 정량값이 높고, MLH1이 야생형(wild type)인 환자군이 그 다음으로 예후가 좋았으며, ctDNA 정량값이 높고 MLH1이 변이형(mutant type)인 환자군은 생존율이 가장 생존률이 나쁜 것으로 나타났다(도 10b).

이로써, 혈액 내 ctDNA 양은 간세포암종의 병기와 밀접한 연관이 있으며 생존에 영향을 주는 것으로 보이며, ctDNA 특이 유전자 변이 (MLH1)가 검출된 환자는 더욱 그 위험도가 증가함에 따라 간세포암종 환자의 예후에 유기적인 영향을 미친다고 할 수 있다.

따라서 본 발명에서 진행한 ctDNA 유래 특정 MLH1의 변이는 간세포암종 환자의 혈액으로 감지할 수 있는 새로운 타겟으로 제시할 수 있으며, 간세포암종 환자의 불량한 예후를 감지할 수 있는 신규 바이오마커이다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Use for detection of hepatocellular carcinoma specific MLH1 circulating tumor DNA mutation <130> ADP-2019-0224 <150> KR 10-2019-0056971 <151> 2019-05-15 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggacttgctg gcccctctgg ggagatggtt aaatccacaa caagtctgac ctcgtcttct 60 acttctggaa gtagtgataa ggtctatgcc caccagatgg wtcgtacaga ttcccgggaa 120 cagaagcttg atgcatttct gcagcctctg agcaaacccc tgtccagtca gccccaggcc 180 attgtcacag aggataagac a 201

Claims

서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 함유하는 간세포암종 진단용 SNP 마커 조성물.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 대립유전자형은 T>A인 것을 특징으로 하는 간세포암종 진단용 SNP 마커 조성물.
서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 함유하는 간세포암종 진단용 조성물.
제3항의 조성물을 포함하는 간세포암종 진단용 키트.
분리된 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
상기 추출한 DNA로부터 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계; 및
상기 확인된 유전자형이 변이형인 경우, 간세포암종이라고 판단하는 단계를 포함하는 간세포암종 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 시료는 혈액인 것을 특징으로 하는 간세포암종 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 DNA는 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)인 것을 특징으로 하는 간세포암종 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 함유하는 간세포암종 예후 예측용 SNP 마커 조성물.
제8항에 있어서, 상기 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 대립유전자형은 T>A인 것을 특징으로 하는 간세포암종 예후 예측용 SNP 마커 조성물.
서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 함유하는 간세포암종 예후 예측용 조성물.
제10항의 조성물을 포함하는 간세포암종 예후 예측용 키트.
분리된 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
상기 추출한 DNA로부터 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계; 및
상기 확인된 유전자형이 변이형인 경우, 간세포암종 예후가 나쁠 것으로 예측하는 단계를 포함하는 간세포암종 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 시료는 혈액인 것을 특징으로 하는 간세포암종 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 DNA는 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)인 것을 특징으로 하는 간세포암종 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.