CN105586408B

CN105586408B - 一种癌症筛检的方法

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Publication number: CN105586408B
Application number: CN201610036909.1A
Authority: CN
Inventors: 赖鸿政
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2008-04-29
Filing date: 2008-04-29
Publication date: 2021-03-23
Anticipated expiration: 2028-04-29
Also published as: CN101570779A; CN101570779B; CN105586408A; HK1133283A1

Abstract

一种癌症筛检的方法，包含下列步骤：(1)提供一受测检体；(2)检测该受测检体之基因组DNA中至少一个目标基因的CpG序列甲基化状态，该目标基因系由SOX1、PAX1、LMX1A、NKX6‑1、WT1以及ONECUT1所组成；(3)根据目标基因甲基化状态的有无，判断该检体是否具有癌症或癌症前病变；甲基化状态检测方法为甲基化特异性聚合酶连锁反应、定量甲基化特异性聚合酶连锁反应、亚硫酸盐定序、微数组、质谱仪分析或变性高效液相色谱等。

Description

一种癌症筛检的方法

本申请是申请日为2008年04月29日，中国专利申请第200810094659.2号的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种癌症筛检的方法，特别涉及一种以甲基化DNA作为生物标记的癌症筛检的方法，属于医学分子生物学领域。

背景技术

子宫颈癌是全球及中国台湾女性主要的死因之一，根据2002年世界卫生组织(WHO)的统计，子宫颈癌为全球女性癌症死因的第二位，仅次于乳癌；定期接受子宫颈癌筛检是预防子宫颈癌的最佳方法，常用子宫颈癌筛检的方式主要有两种，一是最常见的子宫颈抹片检查(Pap smear)，另一则为人类乳突病毒检验(HPV testing)；子宫颈抹片检查是取出子宫颈部之分泌物，以显微镜观察其中脱落之上皮细胞中，是否有癌病变产生，以早期侦测子宫颈癌；而HPV检验则是以反转录聚合酶连锁反应(reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR)检查样本中是否存在有人类乳突病毒(humanpapilloma virus,HPV)病毒基因的表现。

然而，由于子宫颈抹片检查(Pap smear)需要靠医师取样、检验师/病理医师判读抹片，除了容易产生高伪阴性率(High false negative rate)而延迟癌前病变的诊断与治疗之外，再者，所需的人力成本太高，这对许多发展中的国家来说，有推广上的困难；另一方面，人类乳突病毒检验(HPV testing)虽具有高敏感度，却容易造成高伪阳性率(Highfalse positive rate)，不仅让病患白白担心，也会浪费许多医疗资源在伪阳性患者的追踪检查上；因此，如何提高子宫颈癌检验方法的准确性及方便性，是推广子宫颈癌检验的重要课题之一。

在子宫颈癌的病原学上，感染致癌的人类乳突病毒(HPV)是最显着的危险因子；zur Hausen于2002年的报告显示，“高危险”人类乳突病毒(HPV)产生的E6/E7致癌蛋白(oncoprotein)会与肿瘤抑制基因p53/pRB作用，造成细胞周期调节异常；事实上，人类乳突病毒(HPV)的DNA可在所有的子宫颈癌病例中被侦测到。然而，感染人类乳突病毒(HPV)虽为产生子宫颈癌必要的条件，但却不足以导致子宫颈癌的发生；大约有60％低度鳞状细胞上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesions,LSIL)会复原(regress)，30％则会持续(persist)，5-10％会发展为高度鳞状细胞上皮内病变(high-grade squamousintraepithelial lesions,HSIL)，只有少于1％会变成子宫颈癌。HPV的持续感染以及病毒量(viral load)可能是发展成为高度鳞状细胞上皮内病变(HSIL)及癌症的决定因子；然而，子宫颈癌发生的分子机制仍有待确认。

其它的因子，如：环境及基因的改变，可能也在子宫颈角质细胞的恶化上扮演重要的角色；且不论是否由HPV所激活，基因的改变造成基因组的不稳定已长久被认为是子宫颈癌发生的重要机制，由细胞发生学上的研究显示，在子宫颈癌细胞内存在有非随机染色体的改变(non-random chromosomal changes)；另外，数个分子遗传学的研究则鉴识出一些时常发生去异质化(loss of heterozygosity,LOH)的位置，这些位置可能跟子宫颈癌发生时的肿瘤抑制基因(tumor suppressor genes,TSGs)有关联。

基因的缺失(genomic deletions)被认为是肿瘤形成的重要因素，长久以来，我们都习惯了基因组中的编码是仰赖ATCG四个碱基排列的观念，Knudson早在1975年即提出双重受创理论(two-hit theory)，指出一些同源肿瘤抑制基因伴随的突变或缺失可能造成或易造成癌症的发生；然而，其它影响表现型(phenotype)的讯息可能存于被修饰过的碱基5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine)中，5-甲基胞嘧啶被发现存在于哺乳类动物细胞内的回文序列5’-CpG-3’中，在哺乳类动物细胞内除了一些被称为“CpG岛”(CpG islands,CGIs)的区域之外，大多数的CpG双核苷酸对都被甲基化，CpG岛是指在大约1000个碱基对(1Kb)的区域内含有大量的GC-以及CpG-，通常位于基因的附近，且在广泛表现的基因之激活子附近被发现。胞嘧啶的甲基化发生在DNA合成后，自一甲基捐赠者s-腺核苷甲硫胺酸(S-adenosylmethionine,SAM)将一甲基经酵素转移到胞嘧啶第5个碳的位置上，该酵素反应系由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMTs)执行，DNMT1是哺乳类动物主要的甲基转移酶，系负责将半甲基化位置复制后修复(post-replicative restoration)为全甲基化，被称为维持甲基化(maintenance methylation)；反之，DNMT3A及DNMT3B则被认为主要负责甲基化新的位置，进行一种称为重新甲基化(de novo methylation)的步骤。

CpG双核苷酸对甲基化的遗失(loss of methylation)，意即一般的低度甲基化，是癌细胞内的第一个超遗传异常(epigenetic abnormality)；然而，在过去几年内的研究却显示，特定位置(例如：一些肿瘤抑制基因)的高度甲基化(site-specifichypermethylation)与其功能的丧失有关，这可能会在癌症生成时提供选择优势(selective advantages)；在激活子区域上CpG岛的高度甲基化，可以藉由组蛋白修饰(histone modification)伴随接续而来的基因默化现象(gene silencing)，来引起染色质改造(chromatin remodeling)；除了染色体缺失及基因突变之外，经由激活子的高度甲基化所造成肿瘤抑制基因的超遗传默化现象(epigenetic silencing)也常见于人类癌症中。

最近的流行病学研究显示，血清葉酸盐(serum folate)的浓度(一种甲基的主要来源)与HPV的感染和清除有关联；在甲基周期(methyl cycle)的代谢作用中，酵素的基因多型性(genetic polymorphisms)也曾被报导与子宫颈上皮内病变的发展有关；如同超基因演化的观念一般，DNA甲基化与子宫颈癌间关联的研究也同样盛行，子宫颈癌的DNA甲基化研究日与遽增，显示使用甲基化作为子宫颈癌筛检的可能性；由于遗传与环境交互作用的特性，肿瘤抑制基因甲基化程度因不同的基因及不同的族群而异，不同的疾病也会有不同的甲基化表现型(methylator phenotypes)；然而，子宫颈癌的甲基化表现型以及其与HPV基因型的关联仍未知，而子宫颈癌中有何特定的基因会被甲基化，以及需要多少基因方可达到临床应用的需求，这些问题仍是未来需要被确认的议题。

由此可见，上述常用子宫颈癌筛检方法仍有诸多缺失，亟待加以改良。

本发明人鉴于上述常用子宫颈癌筛检方法所衍生的各项缺点，、加以改良创新，并经多年苦心孤诣潜心研究后，终于成功研发完成本发明癌症筛检的方法。圆(wafer)的叠层(stacking)技术有望成为下一代高端(high end)半导体的核心技术。因此，各领域正在活跃地展开关于晶圆叠层的研发。

发明内容

本发明之目的即在于提供一种子宫颈癌筛检的方法，以作为第一线子宫颈癌的筛检(cancer screen)。

本发明之次一目的是在于提供一种子宫颈癌筛检的方法，该方法除了可作为第一线子宫颈癌的筛检之外，亦可作为第二线子宫颈癌的筛检，辅助人类乳突病毒检验(HPVtesting)，以达到更准确之子宫颈癌筛检效果。

本发明之另一目的系在于提供一种癌症诊断的方法，该方法除可应用在子宫颈癌的检测上，亦可应用于其它癌症(如：卵巢癌、肝癌)的检测，以辅助异常检体之诊断。

可达成上述发明目的之一种癌症筛检的方法，系检测受测检体细胞中目标基因甲基化的状态，以作为癌症有无的筛检指针，该方法包含下列步骤：

步骤1提供一受测检体；

步骤2检测该受测检体之基因组DNA中至少一个目标基因的CpG序列甲基化状态，该目标基因是由SOX1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WT1以及ONECUT1所组成；以及

步骤3根据该目标基因甲基化状态的有无，判断该检体是否具有癌症或癌前病变。

其中该受测检体为子宫颈抹片、腹水、血液、尿液、粪便、痰、口腔粘膜细胞、胃液、胆汁、子宫颈上皮细胞等。

其中该目标基因的CpG序列甲基化状态检测方法为甲基化特异性聚合酶连锁反应(methylation-specific PCR,MSP)、定量甲基化特异性聚合酶连锁反应(quantitativemethylation-specific PCR,QMSP)、亚硫酸盐定序(bisulfite sequencing,BS)、微数组(microarrays)、质谱仪分析(mass spectrometer)、变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)。

其中该目标基因SOX1是具有如SEQ ID No:1所示之核苷酸序列。

其中该目标基因PAX1是具有如SEQ ID No:2所示之核苷酸序列。

其中该目标基因LMX1A是具有如SEQ ID No:3所示之核苷酸序列。

其中该目标基因NKX6-1是具有如SEQ ID No:4所示之核苷酸序列。

其中该目标基因WT1是具有如SEQ ID No:5所示之核苷酸序列。

其中该目标基因ONECUT1是具有如SEQ ID No:6所示之核苷酸序列。

本发明进一步提供一种子宫颈癌筛检的方法，系检测受测检体细胞中目标基因甲基化的状态，以作为子宫颈癌有无的筛检指针，该方法包含下列步骤：

步骤1提供一受测检体；

步骤2检测该受测检体之基因组DNA中至少一个目标基因的CpG序列甲基化状态，该目标基因系由SOX1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WT1以及ONECUT1所组成；以及

步骤3根据目标基因甲基化状态的有无，判断该检体是否具有子宫颈癌及癌前病变。

其中该受测检体为子宫颈抹片、血液、尿液、子宫颈上皮细胞等。

其中该受测检体为异常之子宫颈抹片。

其中该受测检体为人类乳突病毒检验(HPV testing)呈阳性(positive)之子宫颈细胞检体。

其中该目标基因SOX1是具有如SEQ ID No:1所示之核苷酸序列。

其中该目标基因PAX1是具有如SEQ ID No:2所示之核苷酸序列。

其中该目标基因LMX1A是具有如SEQ ID No:3所示之核苷酸序列。

其中该目标基因NKX6-1是具有如SEQ ID No:4所示之核苷酸序列。

其中该目标基因WT1是具有如SEQ ID No:5所示之核苷酸序列。

其中该目标基因ONECUT1是具有如SEQ ID No:6所示之核苷酸序列。

本发明进一步提供一种卵巢癌筛检的方法，系检测受测检体细胞中目标基因甲基化的状态，以作为卵巢癌有无的筛检指针，该方法包含下列步骤：

步骤1提供一受测检体；

步骤2检测该受测检体之基因组DNA中至少一个目标基因的CpG序列甲基化状态，该目标基因系由SOX1、PAX1、LMX1A所组成；以及

步骤3根据目标基因甲基化状态的有无，判断该检体是否具有卵巢癌及癌前病变。

其中该受测检体为腹水、血液、尿液等。

其中该目标基因的CpG序列甲基化状态检测方法为甲基化特异性聚合酶连锁反应(methylation-specific PCR,MSP)、定量甲基化特异性聚合酶连锁反应(quantitativemethylation-specific PCR,QMSP)、亚硫酸盐定序(bisulfite sequencing,BS)、微数组(microarrays)、质谱仪分析(mass spectrometer)、变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)、焦磷酸定序(pyrosequencing)。

其中该目标基因SOX1是具有如SEQ ID No:1所示之核苷酸序列。

其中该目标基因PAX1是具有如SEQ ID No:2所示之核苷酸序列。

其中该目标基因LMX1A是具有如SEQ ID No:3所示之核苷酸序列。

本发明进一步提供一种肝癌筛检的方法，系检测受测检体细胞中目标基因甲基化的状态，以作为肝癌有无的筛检指针，该方法包含下列步骤：

步骤1提供一受测检体；

步骤2检测该受测检体之基因组DNA中至少一个目标基因的CpG序列甲基化状态，该目标基因是由SOX1、NKX6-1所组成；以及

步骤3根据目标基因甲基化状态的有无，判断该检体是否具有肝癌及癌前病变。

其中该受测检体为腹水、血液、尿液、粪便、胃液、胆汁等。

其中该目标基因SOX1是具有如SEQ ID No:1所示之核苷酸序列。

其中该目标基因NKX6-1是具有如SEQ ID No:4所示之核苷酸序列。

附图说明

请参阅以下有关本发明一较佳实施例的详细说明及其附图，将可进一步了解本发明的技术内容及其目的功效；有关该实施例的附图为：

图1为本发明癌症筛检方法所使用的各目标基因的CpG序列分析，各基因中具有CpG序列者以「│」标示；各基因MSP引子合成片段位置以「―」标示；各基因亚硫酸盐定序(BS)引子合成片段位置以

标示；

图2为针对本发明癌症筛检方法所使用的各目标基因，在混合的子宫颈癌组织样本(30个样本混合)与混合的正常子宫颈抹片样本(10个样本混合)中，进行甲基化特异性PCR(MSP)分析之结果；第1栏为混合的正常子宫颈抹片样本(10个样本混合)，第2栏为混合的子宫颈癌组织样本(30个样本混合)，第3栏为阴性对照组(negative control)，第4栏为阳性对照组(positive control)，第5栏为空白对照组(水)；

图3为针对本发明癌症筛检方法所使用的各目标基因，在个别的子宫颈癌组织样本与个别的正常子宫颈抹片样本中，进行甲基化特异性PCR(MSP)分析之结果，T1、T2、T3、T4代表4个个别的子宫颈癌组织样本，N1、N2、N3、N4代表4个个别的正常样本，标示U之字段表示以可专一辨认非甲基化基因序列的MSP引子(U)进行甲基化特异性PCR(MSP)之结果，标示M之字段表示以可专一辨认甲基化基因序列的MSP引子(M)进行甲基化特异性PCR(MSP)之结果；

图4A为针对本发明癌症筛检方法所使用的各目标基因，在没有处理5’-aza-2’-deoxycytidine之HeLa子宫颈癌细胞株中(AZC-，第1、2栏)，以及有处理5’-aza-2’-deoxycytidine之HeLa子宫颈癌细胞株中(AZC+，第3、4栏)，进行甲基化特异性PCR(MSP)分析的结果；标示U之字段表示以可专一辨认非甲基化基因序列的MSP引子(U)进行甲基化特异性PCR(MSP)之结果，标示M之字段表示以可专一辨认甲基化基因序列的MSP引子(M)进行甲基化特异性PCR(MSP)的结果；

图4B为针对本发明癌症筛检方法所使用的各目标基因，在没有处理5’-aza-2’-deoxycytidine之HeLa子宫颈癌细胞株中(AZC-，第5栏)，以及有处理5’-aza-2’-deoxycytidine之HeLa子宫颈癌细胞株中(AZC+，第6栏)，进行RT-PCR分析之结果；

图5A为针对本发明癌症筛检方法所使用的各目标基因，在没有处理5’-aza-2’-deoxycytidine之HeLa子宫颈癌细胞株中，进行亚硫酸盐定序(BS)分析的结果；

图5B为针对本发明癌症筛检方法所使用的各目标基因，在有处理5’-aza-2’-deoxycytidine之HeLa子宫颈癌细胞株中，进行亚硫酸盐定序(BS)分析之结果；

图6A为针对本发明癌症筛检方法所使用的各目标基因，在子宫颈鳞状细胞癌(SCC)中，进行亚硫酸盐定序(BS)分析的结果；

图6B为针对本发明癌症筛检方法所使用的各目标基因，在正常样本中，进行亚硫酸盐定序(BS)分析的结果。

具体实施方式

实施例一材料与方法

一、试验材料

试验材料包含一系列完整的子宫颈病变样本，包括正常样本(n＝45)、低度鳞状细胞上皮内病变(LSIL,n＝45)、高度鳞状细胞上皮内病变(HSIL,n＝58)、鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC,n＝109)；试验材料另包含一系列完整的卵巢肿瘤样本，包括卵巢良性肿瘤样本(n＝36)、卵巢边缘性肿瘤样本(n＝6)、卵巢恶性肿瘤样本(n＝122)；所有的子宫颈样本及卵巢样本均取自台北三军总医院的妇科肿瘤组织库，各样本的基因组DNA以Qiagene DNA套组抽取，并以PicoGreen萤光吸收法定量DNA，且以凝胶电泳检测DNA的品质。

另外，肝细胞样本则包含正常肝细胞样本(n＝13)、慢性肝炎(n＝15)、肝硬化(cirrhosis,n＝40)、肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC,n＝54)；所有的肝细胞样本均取自台北三军总医院一般外科肿瘤组织库，各肝细胞样本的基因组DNA也是以Qiagene DNA套组抽取，并以PicoGreen萤光吸收法定量DNA，且以凝胶电泳检测DNA的品质。

二、使用CpG岛微数组(CpG island microarrays)进行差异甲基化杂合反应(Differential Methylation Hybridization,DMH)

取30个子宫颈癌组织样本的DNA混合在一起，另外取10个正常子宫颈抹片样本的DNA混合在一起，样本的DNA以限制酶MseI酶切后，粘接(ligated)到连接子(linkers)上，随后以对甲基化敏感之限制酶(methylation-sensitive restriction enzymes)HpaII以及BstUI进行酶切，再将该DNA作为PCR的模版(template)进行20个循环(cycles)的扩增，并以萤光染剂标记，正常子宫颈抹片样本的DNA以萤光染剂Cy3标记，子宫颈癌组织样本的DNA则以萤光染剂Cy5标记；将标记好的样本DNA作为探针，与含有8,640CpG岛卷标(CpG islandtags)的CpG岛微数组(CpG island microarrays)进行杂交反应，以CGI数据库(网址：http://derlab.med.utoronto.ca/CpGIslands/)来辨识被挑选到的CpG岛。微数组数据以GenePix 6.0软件的圆形特征模式(circular-features mode)分析，标记重复挑选的选殖株(clone)，以及过滤去除掉不被接受的特征；Cy5对Cy3的比率(ratio)大于2.0的基因位(loci)为在混合的子宫颈癌组织样本中具有高度甲基化的基因，因此接受比率大于2.0的基因位。

三、亚硫酸盐修饰作用(Bisulfite modification)、甲基化特异性聚合酶连锁反应(methylation-specific PCR,MSP)以及亚硫酸盐定序(bisulfite sequencing，BS)

使用Chemicon公司出产之DNA修饰套组(DNA modification kit,Chemicon,Ternecula,CA)进行亚硫酸盐修饰作用：取1μg样本的基因组DNA(genomic DNA)，以亚硫酸钠对基因组DNA进行化学修饰，在单链DNA中，所有非甲基化的胞嘧啶都会发生脱氨基作用而转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不被修饰，仍保持5-甲基胞嘧啶的状态；最后，将反应后的样本DNA溶于70μl 55℃的TE缓冲液(TE buffer)中，以进行甲基化特异性PCR(MSP)。

另取人类周围血(peripheral blood)的正常DNA进行亚硫酸盐修饰作用，以作为具有非甲基化激活子序列的对照组；并将人类的正常DNA以SssI甲基转移酶(methyltransferase,New England Biolabs,Beverly,MA)处理，以得到具有甲基化对偶基因的阳性对照组。

取1μg经过亚硫酸盐修饰作用后的样本基因组DNA，以及对照组和阳性对照组DNA，以MSP引子进行甲基化特异性PCR扩增，该MSP引子分为两种，一种为可专一辨认非甲基化基因序列的MSP引子(U)，另一种为可专一辨认甲基化基因序列的MSP引子(M)，各目标基因的MSP引子序列如表一所示；甲基化特异性PCR反应物的总体积为25μl，包含1μl已修饰过的模版DNA、每一引子各1.5pmol、0.2mmol/L dNTPs以及1unit Gold Taq DNA polymerase(Applied Biosystems,Foster City,CA)；将混合好的反应物置于95℃下5分钟，接着以95℃解离(denature)30秒、适当引子粘合(annealing)温度粘合30秒、72℃合成30秒为循环，解离、粘合、合成步骤共重复35个循环，之后再置于72℃反应5分钟。扩增后的产物以含有溴化乙锭(ethidium bromide,EtBr)的2.5％琼脂胶体进行电泳分析，并置于紫外光下照射观察。

表一甲基化特异性PCR(MSP)所使用之MSP引子的序列

引子种类M代表可专一辨认甲基化基因序列的MSP引子。

引子种类U代表可专一辨认非甲基化基因序列的MSP引子。

所有的样本均进行至少两次独立的亚硫酸盐修饰作用及甲基化特异性PCR，在使用可专一辨认甲基化基因序列的MSP引子(M)所进行的PCR反应中，若同一样本无法合成出PCR产物两次以上，则视为该样本不具甲基化；将使用可专一辨认甲基化基因序列的MSP引子(M)所扩增之PCR产物选殖到pCR4-TOPO载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，选取至少5个独立的选殖株(clones)进行亚硫酸盐定序(BS)，亚硫酸盐定序(BS)所使用的引子如表二所示，使用377自动定序仪(Applied Biosystems,Foster City,CA)进行亚硫酸盐定序。

表二亚硫酸盐定序(BS)所使用之引子的序列

四、经由5’-杂氮-2’-脱氧胞苷(5’-aza-2’-deoxycytidine)处理，使甲基化基因在子宫颈癌细胞株内再表现

首先在HeLa子宫颈癌细胞株中，以甲基化特异性PCR(MSP)测试可能具有高度甲基化的基因之甲基化状态，并选出具有甲基化的基因。再将HeLa子宫颈癌细胞株以10μM的DNA甲基转移酶抑制剂5’-aza-2’-deoxycytidine(Sigma Chemical Co.)处理4天，使细胞株中原本因甲基化而不表现的基因可重新表现，并以RT-PCR分析基因的表现；使用QiagenRNeasy kit(Qiagen,Valencia,CA)抽取总RNA(total RNA)，并加入DNase I以去除掉DNA的污染；每一样本取1μg total RNA以Superscript II反转录酶(reverse transcriptase)及6碱基随机引物(random hexamer)(Invitrogen)进行cDNA合成；合成的cDNA以PCR mastermix reagents kit(Applied Biosystems)进行PCR扩增，并置于温度循环反应器(thermalcycler,GeneAmp 2400PE,Applied Biosystems)中反应，扩增后的cDNA再以RT-PCR分析基因的表现，各目标基因所使用的RT-PCR引子如表三所示。

表三 RT-PCR所使用之MSP引子的序列

五、人类乳突病毒(HPV)的侦测

以L1 consensus PCR及反向线点杂交技术(reverse line blot)侦测鳞状细胞癌(SCC)中是否有人类乳突病毒(HPV)DNA的出现，若有超过该杂交技术分析范围的结果，则以DNA定序确认新型人类乳突病毒(novel HPV type)之序列。

六、统计分析

以统计软件SAS version 9.1进行数据分析，基因的甲基化与各临床参数(包括HPV状态)之间的关系，系使用X²测试(X² test)及费雪氏准确检定(Fisher’s exact test)计算，并以罗吉斯回归模型(logistic regression model)计算并调整年龄与HPV感染的胜算比(Odds ratios,ORs)以及95％信赖区间(confidence intervals,CI)，统计的显着水准(the alpha level of statistical significance)订为p＝0.05；并计算使用HPV及甲基化标记(markers)以诊断子宫颈病变的灵敏度(sensitivity)及专一性(specificity)。

实施例二子宫颈癌甲基化指针基因之筛选

藉由CpG岛微数组(CpG island microarrays)进行差异甲基化杂合反应(DMH)，以筛选出在子宫颈鳞状细胞癌(SCC)内具有高度甲基化之基因；CpG岛微数组(CpG islandmicroarrays)结果显示，子宫颈癌组织样本与正常子宫颈抹片样本之间，共有216个点具有差异性甲基化，去除掉序列重复者之后，得到26个基因激活子区域CpG岛(promoter CGIs)。

针对这些基因激活子进行定序及分析，并挑选出6个基因，这些基因包含：SOX1(SEQ ID No:1)、PAX1(SEQ ID No:2)、LMX1A(SEQ ID No:3)、NKX6-1(SEQ ID No:4)、WT1(SEQ ID No:5)以及ONECUT1(SEQ ID No:6)，其详细资料如表四所示；由表四可知，这六个基因都是在发育过程中重要的转录因子(transcription factors)，SOX1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WT1分别对大脑、神经版(roof plate)、四肢、胰岛以及泌尿生殖器的发育很重要，ONECUT1对肝脏及胰脏基因的表现很重要，但目前却很少有研究显示这些基因与癌症的关连。

表四以CpG岛微数组辨识出子宫颈癌细胞中具甲基化的基因之详细资料

针对上述各基因转录起始点(+1)前后各约500bp核苷酸进行CpG序列分析，如图一所示，各基因中具有CpG序列者以「│」标示，并针对各基因设计其MSP引子(如表一所示)及亚硫酸盐定序(BS)引子(如表二所示)，各目标基因进行甲基化特异性PCR(MSP)以及亚硫酸盐定序(BS)所合成的片段位置也标示在图一中。

接着对混合的子宫颈癌组织样本(30个样本混合)与混合的正常子宫颈抹片样本(10个样本混合)进行甲基化特异性PCR(MSP)，以确认这6个基因的甲基化现象在不同的组织样本中是否具有差异，结果如图二所示，这6个基因在混合的子宫颈癌组织样本中均存在甲基化现象(如图二第2栏所示)，而在混合的正常子宫颈抹片样本中则没有甲基化现象(如图二第1栏所示)；进一步以个别的子宫颈癌组织样本进行测试，取4个子宫颈癌组织样本(T1、T2、T3、T4)及4个正常样本(N1、N2、N3、N4)进行甲基化特异性PCR(MSP)，分别以可专一辨认非甲基化基因序列的MSP引子(U)，以及可专一辨认甲基化基因序列的MSP引子(M)进行甲基化特异性PCR(MSP)，结果如图三所示，此六个基因在个别的子宫颈癌组织样本中均具有甲基化现象(如图三第1、3、5、7栏所示)，而同样的基因在正常样本中则侦测不到甲基化现象的发生(如图三第9、11、13、15栏所示)；根据上述结果，将此6个基因作为筛检子宫颈癌之甲基化指针基因。

实施例三子宫颈癌细胞株内DNA甲基化与基因表现的相关性

为了确认子宫颈癌甲基化指针基因的表现是否透过DNA甲基化作用来调节，以10μM的DNA甲基转移酶抑制剂5’-aza-2’-deoxycytidine(AZC)(Sigma Chemical Co.)处理HeLa子宫颈癌细胞株4天，再以甲基化特异性PCR(MSP)检查上述6个基因激活子去甲基化的情况；分别以可专一辨认非甲基化基因序列的MSP引子(U)，以及可专一辨认甲基化基因序列的MSP引子(M)进行甲基化特异性PCR(MSP)，结果如图四A所示，未处理5’-aza-2’-deoxycytidine(AZC)之HeLa子宫颈癌细胞株(AZC-)中，6个目标基因均具有甲基化现象(如图四A第1栏所示)，且侦测不到未甲基化的基因(如图四A第2栏所示)；而在处理5’-aza-2’-deoxycytidine(AZC)4天之HeLa子宫颈癌细胞株(AZC+)中，则可侦测到未甲基化的目标基因(如图四A第4栏所示)，显示经过甲基转移酶抑制剂5’-aza-2’-deoxycytidine(AZC)处理后的子宫颈癌细胞株中，上述6个目标基因均有部分已去除甲基化。

再以RT-PCR分析这6个基因在HeLa子宫颈癌细胞株中的表现，结果如图四B所示，经5’-aza-2’-deoxycytidine(AZC)处理后的细胞株中，均可侦测到这6个目标基因的mRNA(如图四B第6栏所示)，而未经5’-aza-2’-deoxycytidine(AZC)处理的细胞株中，则侦测不到任何一个目标基因的mRNA(如图四B第5栏所示)，由结果可知，这六个目标基因在子宫颈癌细胞中，确实会经由DNA甲基化作用来调节其基因表现，当基因具有甲基化现象时，基因的表现会受到抑制，去除甲基化作用之后，目标基因又会开始表现。

另以亚硫酸盐定序(BS)分析目标基因在HeLa子宫颈癌细胞株中是否存在高度甲基化(hypermethylation)现象，结果如图五所示，未经5’-aza-2’-deoxycytidine(AZC)处理的细胞株(图五A)中，目标基因高度甲基化的样本数比经过5’-aza-2’-deoxycytidine(AZC)处理的细胞株(图五B)要来的多；同样以亚硫酸盐定序(BS)分析子宫颈鳞状细胞癌(SCC)及正常样本，结果则如图六所示，在子宫颈鳞状细胞癌(SCC)(图六A)样本中，目标基因高度甲基化的样本数也明显较正常样本(图六B)来的多。

实施例四临床子宫颈样本内目标基因的甲基化分析

请参阅表五，正常样本、低度鳞状细胞上皮内病变(LSIL)、高度鳞状细胞上皮内病变(HSIL)以及鳞状细胞癌(SCC)样本的平均年龄分别为51.0±11.3、39.7±9.6、46.4±14.4以及53.3±10.9岁(p<0.05)；样本中高危险HPV DNA呈现阳性的比率各为：正常样本21.4％，低度鳞状细胞上皮内病变(LSIL)样本47.7％，高度鳞状细胞上皮内病变(HSIL)样本59.3％，鳞状细胞癌(SCC)样本88.9％。结果显示，感染HPV的病患较易罹患不同严重程度的子宫颈病变(LSIL、HSIL、SCC样本的胜算比各为3.1、5.2、29.9；95％信赖区间各为1.1-8.3、2.1-13.0、11.5-77.7)。

在不同严重程度的子宫颈病变样本中，以甲基化特异性PCR(MSP)分析目标基因的甲基化状态，目标基因的甲基化状态及人类乳突病毒(HPV)的有无之分析结果如表五所示，SOX1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WT1以及ONECUT1这6个基因在鳞状细胞癌(SCC)中均具有高频率甲基化现象，各基因在鳞状细胞癌(SCC)样本中甲基化的比例分别为：81.5％、94.4％、89.9％、80.4％、77.8％以及20.4％；而在正常子宫颈样本中各基因甲基化的比例则分别为：2.2％、0％、6.7％、11.9％、11.1％以及0％(p≦0.001)；因此，与正常子宫颈样本比较，这6个基因在鳞状细胞癌(SCC)样本中被甲基化的情况明显高出许多。

NKX6-1基因甲基化的频率在LSIL样本中为53.3％，在HSIL样本中为55.1％，在SCC样本中则为80.4％；统计结果显示，具有NKX6-1基因甲基化现象的病患罹患鳞状细胞癌(SCC)的风险较高(胜算比为29.8，95％信赖区间为10.4-85.2)。

PAX1基因甲基化的频率在LSIL样本中为2.3％，在HSIL样本中为42.1％，在SCC样本中则为94.4％；统计结果显示，具有PAX1基因甲基化现象的病患，罹患高度鳞状细胞上皮内病变(HSIL)及鳞状细胞癌(SCC)的风险较高(HSIL以及SCC样本的胜算比均为>999.9；95％信赖区间为＜0.1->999.9)。

SOX1、LMX1A以及ONECUT1三个基因在癌前病变(precancerous lesions)的样本中甲基化的频率很低，但在HSIL样本及SCC样本中甲基化的频率则大幅增加，分别为9.3％及81.5％、16％及89.9％、7.4％及20.4％；统计结果显示，具有SOX1、LMX1A或ONECUT1基因甲基化现象的病患，罹患鳞状细胞癌(SCC)的风险较高(三者的胜算比分别为200.2、124.5、7.3；95％信赖区间分别为25.8-999.9、33.0-470.1、2.0-25.9)。

WT1基因甲基化的频率随着病变严重程度增加而增加，在正常样本中WT1基因甲基化的频率为11.1％，在LSIL样本中为20.0％，在HSIL样本中为42.1％，在SCC样本中则为77.8％；统计结果显示，具有WT1基因甲基化现象的病患，罹患高度鳞状细胞上皮内病变(HSIL)及鳞状细胞癌(SCC)的风险较高(两者的胜算比分别为6.7、27.9；95％信赖区间分别为2.2-19.8、9.8-78.9)。

DNA甲基化指针的诊断表现

分析DNA甲基化的灵敏度(sensitivity)以及专一性(specificity)，以决定目标基因是否可作为高度子宫颈癌病变以及子宫颈癌筛检的生物指针，分析结果如表六所示；以HPV测试来筛检样本有无鳞状细胞癌(SCC)的灵敏度及专一性分别为83.1％以及85.5％(其95％信赖区间则分别为77.6-88.5以及79.6-91.4)；而分析SOX1、PAX1、LMX1A、NKX6-1以及WT1这5个基因的甲基化状态以筛检鳞状细胞癌(SCC)的有无，各基因甲基化状态对鳞状细胞癌(SCC)的灵敏度则为77.8％-94.4％，其专一性为88.1％-100％；当同时合并HPV测试与个别甲基化指针基因来检测疾病时(combined parallel testing,CPT)，意即只要HPV测试或任一甲基化指针基因的测试结果为阳性，则认定该测试样本的子宫颈癌筛检结果为阳性，其灵敏度介于97.2％-98.2％，而专一性介于66.7％-79.5％；当循序合并(combinedsequential testing,CST)HPV测试与个别甲基化指针基因时，意即首先进行HPV测试，并对HPV测试呈阳性反应之样本进行各指针基因的甲基化状态侦测，其灵敏度介于69.4％-85.0％，而所有测试的专一性均为100％。

当同时以高度鳞状细胞上皮内病变(HSIL)以及鳞状细胞癌(SCC)诊断标的时，以HPV测试来筛检样本有无HSIL或SCC的灵敏度及专一性分别为75.0％以及85.5％(其95％信赖区间则分别为70.2-79.8以及79.6-91.4)；而分析SOX1、PAX1、LMX1A、NKX6-1以及WT1这5个基因的甲基化状态以筛检样本有无HSIL或SCC，各基因甲基化状态对HSIL或SCC的灵敏度则介于57.4％-76.2％，其专一性介于88.1％-100％；当同时合并HPV测试与个别甲基化指针基因来检测疾病时(CPT)，其灵敏度可增加到85.8％-94.9％；而当循序合并(CST)HPV测试与个别甲基化指针基因时，所有测试的专一性均为100％；当同时合并(CPT)HPV测试与SOX1、PAX1、LMX1A三个基因的甲基化状态测试，以筛检样本有无鳞状细胞癌(SCC)时，其灵敏度可达100％，而以相同方法筛检样本中有无HSIL或SCC时，其灵敏度则为93.4％。

在以个别甲基化指针基因筛检鳞状细胞癌(SCC)的结果中，以单独检测PAX1基因甲基化状态来筛检样本中有无鳞状细胞癌(SCC)的灵敏度为最高，其灵敏度可达94.4％(其95％信赖区间为90.0-98.8)，同样的，以PAX1基因甲基化状态筛检样本中有无HSIL或SCC的灵敏度也可达到76.2％(其95％信赖区间为69.7-82.7)，而两个测试的专一性则均为100％。

实施例五卵巢肿瘤样本内目标基因的甲基化分析

以甲基化特异性PCR(MSP)分析目标基因在卵巢肿瘤样本中的甲基化状态，目标基因的甲基化状态分析结果如表七所示，分析在各卵巢肿瘤样本中SOX1、PAX1以及LMX1A这3个基因的甲基化状态，结果显示，SOX1、PAX1以及LMX1A这3个基因在所有的卵巢良性肿瘤及卵巢边缘性肿瘤样本内，均不具甲基化现象；而在卵巢恶性肿瘤样本中，这3个基因甲基化的频率则大幅增加，SOX1基因甲基化的频率为55.7％，PAX1基因甲基化的频率为49.2％，LMX1A基因甲基化的频率则为32.8％。

表七卵巢肿瘤样本中目标基因的甲基化状态分析

实施例六肝细胞样本内目标基因的甲基化分析

以甲基化特异性PCR(MSP)分析目标基因在肝细胞样本中的甲基化状态，目标基因的甲基化状态分析结果如表八所示，在正常肝细胞样本中SOX1基因甲基化的频率为7.7％，相较之下，具有异常病变的肝细胞样本中，SOX1基因甲基化的频率则大幅提高，在慢性肝炎样本、肝硬化样本以及肝癌样本中，SOX1基因甲基化的频率分别为33.3％、27.5％、53.7％。另外，在正常肝细胞样本中NKX6-1基因甲基化的频率(10％)也明显比在肝癌样本中NKX6-1基因甲基化的频率(57％)低。

表八肝细胞样本中目标基因的甲基化状态分析

本发明所提供之癌症诊断的方法，与前述习用技术相互比较时，更具有下列之优点：

本发明所提供之癌症筛检的方法系以检体中特定基因的甲基化程度作为癌症有无的诊断指针，与习用子宫颈抹片及人类乳突病毒检验(HPV testing)方法比较，本发明之癌症诊断方法的敏感性及专一性均较前述两者高。

本发明所提供之癌症筛检的方法除了可作为第一线子宫颈癌的筛检之外，亦可合并或辅助人类乳突病毒检验(HPV testing)检验，作为第二线子宫颈癌的筛检，以达到更准确之子宫颈癌筛检效果。

本发明所提供之癌症诊断的方法除可应用在子宫颈癌的检测上，亦可应用于其它癌症(如：卵巢癌、肝癌)的检测，以辅助异常检体之诊断。

上列详细说明系针对本发明之一可行实施例之具体说明，惟该实施例并非用以限制本发明之专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为之等效实施或变更，例如：受测者检体中各目标基因甲基化程度的判断方式等变化之等效性实施例，均应包含于本案之专利范围中。

Claims

1.一种目标基因在制备癌症筛检试剂中的应用，其中所述癌症筛检试剂用于检测受测检体内目标基因的CpG序列甲基化的状态，所述目标基因包含SOX1基因，所述癌症为鳞状细胞癌、子宫颈癌、卵巢癌或肝癌。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述受测检体为子宫颈抹片、腹水、血液、尿液、粪便、痰、口腔黏膜细胞、胃液、胆汁、子宫颈上皮细胞或手术后的癌症组织离体样本。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述目标基因的CpG序列甲基化状态检测方法为甲基化特异性聚合酶连锁反应、定量甲基化特异性聚合酶连锁反应、亚硫酸盐定序、微数组、质谱仪分析、变性高效液相色谱、焦磷酸定序。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述目标基因SOX1的核苷酸序列如SEQ IDNo:1所示。

5.根据权利要求4所述的应用，其用于辨识目标基因甲基化序列的甲基化特异性聚合酶连锁反应所使用的引物对序列为：所述目标基因SOX1的引物对的核苷酸序列分别为SEQID No：7和SEQ ID No：8所示。

6.根据权利要求4所述的应用，其用于辨识目标基因非甲基化序列的甲基化特异性聚合酶连锁反应所使用的引物对序列为：所述目标基因SOX1的引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID No：9和SEQ ID No：10所示。

7.根据权利要求4所述的应用，其用于辨识目标基因甲基化序列的亚硫酸盐所使用的引物对序列为：所述目标基因SOX1的引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID No：31和SEQ IDNo：32所示。

8.根据权利要求4所述的应用，其用于辨识目标基因甲基化序列的定量甲基化特异性聚合酶连锁反应所使用的引物对序列为：所述目标基因SOX1的引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID No：47和SEQ ID No：48所示。