CN107287294A - 一种宫颈癌相关基因甲基化程度的检测引物、探针、试剂盒及其应用 - Google Patents
一种宫颈癌相关基因甲基化程度的检测引物、探针、试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种宫颈癌相关基因甲基化程度的检测引物、探针、试剂盒及其应用。本发明发现宫颈组织中PAX1、FAM19A4、PHACTR3、DAPK四个基因的启动子区域的甲基化程度与宫颈癌极显著相关,可以作为辅助诊断宫颈癌的生物标志物,通过同时设计甲基化探针和非甲基化探针避免了非甲基化的DNA的影响,结果更可靠。与常规的宫颈癌诊断方法相比,本发明的方法具有快速、灵敏度和特异性高等优点,能够在早期及时对人宫颈癌进行诊断,使得早期准确诊断宫颈癌成为可能,避免了医疗资源的浪费。
Description
技术领域:
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种宫颈癌相关基因甲基化程度的检测引物、探针、试剂盒及其应用。
背景技术:
宫颈癌是全球女性最常见的生殖系统恶性肿瘤,其发病率仅次于乳腺癌。2008年我国宫颈癌新发病例12.19/10万,位于女性新发恶性肿瘤第6位;宫颈癌死亡病例3.90/10万;我国的宫颈癌均呈现与发达国家相反的、明显的上升趋势。由于已有的研究证实了高危型人乳头状瘤病毒(HPV)感染与宫颈癌发病密切相关,因此目前预防宫颈癌的发生一般都是通过检测女性是否感染了高危型的HPV病毒的角度来进行的。
2012年美国阴道镜和宫颈病理学会(ASCCP)制定的“宫颈癌预防及早期诊断筛查指南”指出:如HPV16或HPV16/18阳性则需立即转诊阴道镜检查。但临床证据表明,只有很少比例的女人感染高危型的HPV病毒后会发展到宫颈癌。HPV感染是一种极为常见的病毒感染,高达75%的女性在其一生中可能感染HPV;但这种感染是多数一过性的,可自行清除,只有持续性的高危型HPV感染才可能诱发宫颈癌前病变;并且即使HPV感染引发了子宫颈上皮内瘤变,真正发展到宫颈癌的机率也是很低的。因此就目前通过检测HPV病毒,甚至通过病理分析子宫颈上皮内瘤变来判断受检者患宫颈癌风险的方法,会导致临床的过度治疗,浪费大量的医疗资源。
因此,临床上急需能够即时、准确,并且费用能为患者所承受的精确宫颈癌早筛的技术出现。
基因甲基化是遗传表观学重要的组成部分。基因甲基化是肿瘤发生过程中的早期事件,是细胞的遗传本质和外界环境影响共同作用的结果。基因的启动子区域发生甲基化后,往往使得该基因的表达出现下调,随之影响了细胞内一系列的分子事件,最终导致细胞发生癌变。因此利用基因的甲基化来早期诊断肿瘤已经成为分子检验的一个热点领域;例如通过检测Septin9基因启动子区域的甲基化诊断试剂盒已经得到欧盟、美国FDA,以及中国FDA的批准,用于早期结直肠癌筛查。在宫颈癌筛查中,由于能直接收集到宫颈的上皮细胞,因此通过分析宫颈细胞中的甲基化程度来早期诊断宫颈癌,较其他内脏器官所发生的肿瘤,在临床上更容易操作。目前已经有众多研究报道通过全基因组方法来寻找在宫颈癌组织中发现甲基化,但在正常宫颈细胞中不发生甲基化的基因。
发明内容:
本发明的目的是提供一种宫颈癌相关基因甲基化程度的检测引物、探针、试剂盒及其应用。
本发明最关键的构思在于:检测靶基因甲基化时,采取了双探针定量PCR的方法,即甲基化位点的CpG岛同时针对C碱基和U碱基设计探针(原理参考图1),并采用甲基化值来评估样本中甲基化DNA所占的比例(甲基化程度)。有了甲基化值后,就方便确定阈值来自动化区分发生癌变和非癌变的临床样本。
甲基化值=100/[1+2(Ctm-Ctu)],其中Ctm是甲基化探针在qPCR过程中进入对数扩增时的起峰Ct值,Ctu是非甲基化探针在qPCR过程中进入对数扩增时的起峰Ct值,若Ct值>45个循环,则默认为45。
本发明的第一个目的是提供一种宫颈癌相关基因PAX1、FAM19A4、PHACTR3和DAPK启动子甲基化程度的检测引物,所述的检测引物如下所示:
针对PAX1基因:
PAX1-F:5’-TTAGGGGGTAGTTGAGTAAGTT-3’(如SEQ ID NO.1所示);
PAX1-R:5’-AAAATAACCTATAAATCCCCAAACAA-3’(如SEQ ID NO.2所示);
针对FAM19A4基因:
FAM19A4-F:5’-TTTTAGTAGTAGTTTTAGGTTTT-3(如SEQ ID NO.3所示)’;
FAM19A4-R:5’-ATCCCTTCCAACCCTTCTTA-3’(如SEQ ID NO.4所示);
针对PHACTR3基因:
PHACTR3-F:5’-GTTGGGGGAAGAGAGGTAGATT-3’(如SEQ ID NO.5所示);
PHACTR3-R:5’-CTTCCAAAAACAAATACCCAAAC-3’(如SEQ ID NO.6所示);
针对DAPK基因:
DAPK-F:5’-TTTTGGAGGTGGGAAAGTTG-3’(如SEQ ID NO.7所示);
DAPK-R:5’-AAAAACACCCTTTATTAAAACTAAAC-3’(如SEQ ID NO.8所示)。
本发明的第二个目的是提供一种宫颈癌相关基因PAX1、FAM19A4、PHACTR3和DAP K甲基化程度的检测探针,所述的检测探针如下所示:
针对PAX1基因:
PAX1-M:5’-AAATAAAACGCGACGCATTAT-3’(如SEQ ID NO.9所示);
PAX1-U:5’-AAATAAAACACAACACATTATAACCC-3’(如SEQ ID NO.10所示);
针对FAM19A4基因:
FAM19A4-M:5’-CCGTACCGCCTCCCCGCGAAAA-3’(如SEQ ID NO.11所示);
FAM19A4-U:5’-CCATACCACCTCCCCACAAAA-3’(如SEQ ID NO.12所示);
针对PHACTR3基因:
PHACTR3-M:5’-AACCCAAAACCGACGCTAAACGA-3’(如SEQ ID NO.13所示);
PHACTR3-U:5’-AATAACCCAAAACCAACACTAAAC-3’(如SEQ ID NO.14所示);
针对DAPK基因:
DAPK-M:5’-ACCCCGCGCGCGCGTAAA-3’(如SEQ ID NO.15所示);
DAPK-U:5’-ACCCCTCAACCCCACACACACAT-3’(如SEQ ID NO.16所示);
M表示甲基化探针,U表示非甲基化探针,探针的5’端标记有荧光报告基团,3’端标记有荧光淬灭基团,同一基因的甲基化探针和非甲基化探针的5’端标记的荧光报告基团是不同的荧光报告基团。
所述的荧光报告基团优选为FAM、TET、VIC、HEX或ROX,所述的荧光淬灭基团优选为TAMRA、BHQ1、BHQ2或MGB。
本发明的第三个目的是提供一种含有上述的检测引物和检测探针的检测试剂盒。
优选,所述的检测试剂盒还包括2×Premix Ex Taq。
本发明的第四个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的宫颈癌相关基因PAX1、FAM19A4、PHACTR3和DAPK甲基化程度的检测方法,包括以下步骤:提取待测宫颈组织的基因组DNA,将提取的基因组DNA进行亚硫酸盐转化,以亚硫酸盐转化的基因组DNA为模板,分别用针对PAX1基因的上述的检测引物和检测探针、针对FAM19A4基因的上述的检测引物和检测探针、针对PHACTR3基因的上述的检测引物和检测探针、针对DAPK基因的上述的检测引物和检测探针进行双探针荧光定量PCR扩增,根据甲基化探针和非甲基化探针的荧光报告基团的荧光信号,读取并记录甲基化探针的起峰Ct值和非甲基化探针的起峰Ct值,根据公式:甲基化值=100/[1+2(Ctm-Ctu)],分别计算得到PAX1、FAM19A4、PHACTR3和DAPK基因的甲基化值,其中,Ctm为甲基化探针的起峰Ct值,Ctu为非甲基化探针的起峰Ct值。
所述的双探针荧光定量PCR扩增,其反应体系优选为20μL:包括2×Premix Ex Taq10μL、上游引物0.25μM、下游引物0.25μM、甲基化探针0.40μM、非甲基化探针0.40μM和亚硫酸盐转化后的DNA模板5μL,其余由水补足至20μL。
所述的双探针荧光定量PCR扩增,其反应条件优选为:95℃预变性5min;95℃变性15s,60℃退火延伸40s,共50个循环;4℃保存。
本发明的第五个目的是提供PAX1、FAM19A4、PHACTR3和DAPK基因作为辅助诊断宫颈癌生物标志物中的应用。
本发明的第六个目的是提供上述的检测引物和检测探针在辅助诊断宫颈癌中的应用。
本发明的有益效果:本发明发现宫颈组织中PAX1、FAM19A4、PHACTR3、DAPK四个基因的启动子区域的甲基化程度与宫颈癌极显著相关,可以作为辅助诊断宫颈癌的生物标志物,通过同时设计甲基化探针和非甲基化探针避免了非甲基化DNA的影响,结果更可靠。与常规的宫颈癌诊断方法相比,本发明的方法具有快速、灵敏度和特异性高等优点,能够在早期及时对人宫颈癌进行诊断,使得早期准确诊断宫颈癌成为可能,避免了医疗资源的浪费。
附图说明:
图1是甲基化探针和非甲基化探针及引物设计的原理参考图,其中M代表CpG岛的C碱基甲基化,U代表CpG岛的C碱基非甲基化。
图2是FAM19A4基因甲基化的检测结果,a为非宫颈癌组织,b为宫颈癌组织。
图3是宫颈癌组患者和非宫颈癌对照的宫颈细胞中的甲基化值分布散点图。
具体实施方式:
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1:
本发明针对人PAX1、FAM19A4、PHACTR3、DAPK四个基因的甲基化位点的CpG岛同时设计针对C碱基(经过亚硫酸盐处理后,甲基化的CpG岛的C碱基仍然保持C碱基)的甲基化探针和U碱基(经过亚硫酸盐处理后,没有甲基化的CpG岛的C碱基变成了U碱基)的非甲基化探针及特异性引物。每个基因设计一对引物,一条甲基化探针和一条非甲基化探针,甲基化探针检测甲基化位点,非甲基化探针检测非甲基化位点。
1、PCR引物设计:
表1.四个基因PCR引物序列
注:F表示上游引物,R表示下游引物
2、探针设计:
本发明针对每个基因设计一条甲基化探针和一条非甲基化探针。8条探针序列如表2。
表2. 四个基因探针序列
注:M表示甲基化探针,U表示非甲基化探针
3、宫颈组织,和宫颈细胞刷片DNA提取
宫颈细胞刷片和保存液购自广东潮州凯普生物化学公司。分别取800μL临床上经过病理已经确认为宫颈癌患者的宫颈刷片样本和非宫颈癌对照人群的宫颈宫颈刷片样本到1.5mL离心管,12000rpm离心3-5min,去掉上清,收集宫颈细胞。然后用天根生化科技(北京)有限公司生产的组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。
4、DNA的甲基化修饰转化
用美国ZYMO Research公司的EZ DNA Methylation-Gold KitTM对基因组DNA进行亚硫酸盐转化。经过亚硫酸盐处理后,DNA中发生了甲基化的CpG岛上的C碱基仍然保持C碱基,而没有发生甲基化的CpG岛上的C碱基则变成了U碱基,这样就造成了甲基化的DNA和非甲基化的DNA的序列差异,可以为后续的核酸检测方法检出。经亚硫酸盐转化后的DNA可以立即使用或放入-20℃保存待用,作为后续荧光定量PCR反应的模板。
5、荧光定量检测:以步骤4的经亚硫酸盐转化后的DNA为模板,用针对FAM19A4基因的引物对FAM19A4-F/FAM19A4-R(见表1)及探针FAM19A4-M和FAM19A4-U(见表2)进行荧光定量PCR(qPCR)扩增。qPCR反应体系和反应条件见表3和表4。
表3.qPCR反应体系
qPCR反应体系 | 组成 |
2×Premix Ex Taq(TakaRa公司) | 10μL |
上游引物 | 0.25μM(终浓度) |
下游引物 | 0.25μM(终浓度) |
甲基化探针 | 0.40μM(终浓度) |
非甲基化探针 | 0.40μM(终浓度) |
亚硫酸盐转化后的DNA模板 | 5μL |
ddH2O | 补足到20μL |
表4.qPCR反应条件
6、结果分析
在非宫颈癌组织中,FAM19A4基因甲基化的检测结果见图2a,非甲基化探针在qPCR过程中进入对数扩增时的起峰Ct值为29,甲基化探针在qPCR过程中进入对数扩增时的起峰Ct值为45。在宫颈癌组织中,FAM19A4基因甲基化的检测结果见图2b,非甲基化探针在qPCR过程中进入对数扩增时的起峰Ct值为30,甲基化探针在qPCR过程中进入对数扩增时的起峰Ct值为33。代入公式:甲基化值=100/[1+2(Ctm-Ctu)],计算得到FAM19A4基因在非宫颈癌组织中的甲基化值为0.015,在宫颈癌组织中的甲基化值为11.1。
实施例2:
按照实施例1的方法提取20个宫颈癌患者的宫颈刷片样本(宫颈癌组)和20个非宫颈癌对照人群的宫颈刷片样本(非宫颈癌组)的基因组DNA,然后对提取的基因组DNA进行亚硫酸盐转化,将亚硫酸盐转化后的DNA作为模板,分别针对PAX1基因的引物对PAX1-F/PAX1-R及探针PAX1-M和PAX1-U、针对FAM19A4基因的引物对FAM19A4-F/FAM19A4-R及探针FAM19A4-M和FAM19A4-U、针对PHACTR3基因的引物对PHACTR3-F/PHACTR3-R及探针PHACTR3-M和PHACTR3-U、针对DAPK基因的引物对DAPK-F/DAPK-R及探针DAPK-M和DAPK–U(表1和表2),按照实施例1的qPCR反应体系和反应条件,分别进行qPCR扩增(ThermoFisher公司的ABI7500荧光定量仪器)。根据4个基因的甲基化探针和非甲基化探针在qPCR过程中进入对数扩增时的起峰Ct值,代入公式:甲基化值=100/[1+2(Ctm-Ctu)],分别计算4个基因的甲基化值,结果如表5,以表5的数据作图展示的效果如图3。
表5.宫颈癌组和非宫颈癌组的4个基因甲基化值的平均值
宫颈癌组(20人份) | 非宫颈癌组(20人份) |
11.21 | 0.42 |
13.4 | 0.12 |
34.22 | 1.4 |
9.56 | 0.98 |
5.68 | 0.88 |
23.3 | 0.32 |
12.4 | 1.21 |
15.6 | 1.1 |
33.23 | 1.09 |
10.28 | 0.09 |
15.6 | 0.18 |
33.17 | 0.13 |
8.68 | 0.21 |
7.8 | 1.32 |
35.47 | 0.45 |
22.1 | 0.56 |
16.74 | 0.67 |
24.39 | 0.99 |
43.2 | 1.45 |
13.6 | 1.16 |
从表5可知,宫颈癌患者的宫颈细胞中PAX1、FAM19A4、PHACTR3和DAPK 4个基因甲基化值的平均值达19.5,极显著高于非宫颈癌对照的宫颈细胞中PAX1、FAM19A4、PHACTR3和DAPK 4个基因甲基化值的平均值(P﹤0.01),可见,本发明能准确区分出宫颈癌患者和非宫颈癌对照,因此,PAX1、FAM19A4、PHACTR3和DAPK基因可以作为辅助诊断宫颈癌生物标志物。我们定义当PAX1、FAM19A4、PHACTR3和DAPK 4个基因甲基化值的平均值>1.8,即log2甲基化值>0.848时,就怀疑所检测的宫颈刷片样本中含有宫颈癌细胞,可以通过病理方法对宫颈细胞的癌变情况进行进一步确认。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>广州中心法则生物科技有限公司
<120>一种宫颈癌相关基因甲基化程度的检测引物、探针、试剂盒及其应用
<160>16
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
ttagggggta gttgagtaagt t 21
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
aaaataacct ataaatcccc aaacaa 26
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ttttagtagt agttttaggt ttt 23
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
atcccttcca acccttctta 20
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
gttgggggaa gagaggtaga tt 22
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
cttccaaaaa caaataccca aac 23
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
ttttggaggt gggaaagttg 20
<210>8
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
aaaaacaccc tttattaaaa ctaaac 26
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
aaataaaacg cgacgcatta t 21
<210>10
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
aaataaaaca caacacatta taaccc 26
<210>11
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
ccgtaccgcc tccccgcgaa aa 22
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
ccataccacc tccccacaaa a 21
<210>13
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
aacccaaaac cgacgctaaa cga 23
<210>14
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
aataacccaa aaccaacact aaac 24
<210>15
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
accccgcgcg cgcgtaaa 18
<210>16
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
acccctcaac cccacacaca cat 23
Claims (10)
1.一种宫颈癌相关基因PAX1、FAM19A4、PHACTR3和DAPK甲基化程度的检测引物,其特征在于,所述的检测引物如下所示:
针对PAX1基因:
PAX1-F:5’-TTAGGGGGTAGTTGAGTAAGTT-3’;
PAX1-R:5’-AAAATAACCTATAAATCCCCAAACAA-3’;
针对FAM19A4基因:
FAM19A4-F:5’-TTTTAGTAGTAGTTTTAGGTTTT-3’;
FAM19A4-R:5’-ATCCCTTCCAACCCTTCTTA-3’;
针对PHACTR3基因:
PHACTR3-F:5’-GTTGGGGGAAGAGAGGTAGATT-3’;
PHACTR3-R:5’-CTTCCAAAAACAAATACCCAAAC-3’;
针对DAPK基因:
DAPK-F:5’-TTTTGGAGGTGGGAAAGTTG-3’;
DAPK-R:5’-AAAAACACCCTTTATTAAAACTAAAC-3’。
2.一种宫颈癌相关基因PAX1、FAM19A4、PHACTR3和DAPK甲基化程度的检测探针,其特征在于,所述的检测探针如下所示:
针对PAX1基因:
PAX1-M:5’-AAATAAAACGCGACGCATTAT-3’;
PAX1-U:5’-AAATAAAACACAACACATTATAACCC-3’;
针对FAM19A4基因:
FAM19A4-M:5’-CCGTACCGCCTCCCCGCGAAAA-3’;
FAM19A4-U:5’-CCATACCACCTCCCCACAAAA-3’;
针对PHACTR3基因:
PHACTR3-M:5’-AACCCAAAACCGACGCTAAACGA-3’;
PHACTR3-U:5’-AATAACCCAAAACCAACACTAAAC-3’;
针对DAPK基因:
DAPK-M:5’-ACCCCGCGCGCGCGTAAA-3’;
DAPK-U:5’-ACCCCTCAACCCCACACACACAT-3’;
M表示甲基化探针,U表示非甲基化探针,探针的5’端标记有荧光报告基团,3’端标记有荧光淬灭基团,同一基因的甲基化探针和非甲基化探针的5’端标记的荧光报告基团是不同的荧光报告基团。
3.根据权利要求2所述的检测探针,其特征在于,所述的荧光报告基团为FAM、TET、VIC、HEX或ROX,所述的荧光淬灭基团为TAMRA、BHQ1、BHQ2或MGB。
4.一种含有权利要求1所述的检测引物和权利要求2所述的检测探针的检测试剂盒。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒,其特征在于,所述的检测试剂盒还包括2×Premix Ex Taq。
6.一种非疾病的诊断和治疗目的的宫颈癌相关基因PAX1、FAM19A4、PHACTR3和DAPK甲基化程度的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:提取待测宫颈组织的基因组DNA,将提取的基因组DNA进行亚硫酸盐转化,以亚硫酸盐转化的基因组DNA为模板,分别用针对PAX1基因的权利要求1所述的检测引物和权利要求2所述的检测探针、针对FAM19A4基因的权利要求1所述的检测引物和权利要求2所述的检测探针、针对PHACTR3基因的权利要求1所述的检测引物和权利要求2所述的检测探针、针对DAPK基因的权利要求1所述的检测引物和权利要求2所述的检测探针进行双探针荧光定量PCR扩增,根据甲基化探针和非甲基化探针的荧光报告基团的荧光信号,读取并记录甲基化探针的起峰Ct值和非甲基化探针的起峰Ct值,根据公式:甲基化值=100/[1+2(Ctm-Ctu)],分别计算得到PAX1、FAM19A4、PHACTR3和DAPK基因的甲基化值,其中,Ctm为甲基化探针的起峰Ct值,Ctu为非甲基化探针的起峰Ct值。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述的双探针荧光定量PCR扩增,其反应体系为20μL:包括2×Premix Ex Taq 10μL、上游引物0.25μM、下游引物0.25μM、甲基化探针0.40μM、非甲基化探针0.40μM和亚硫酸盐转化后的DNA模板5μL,其余由水补足至20μL。
8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述的双探针荧光定量PCR扩增,其反应条件为:95℃预变性5min;95℃变性15s,60℃退火延伸40s,共50个循环;4℃保存。
9.PAX1、FAM19A4、PHACTR3和DAPK基因作为辅助诊断宫颈癌生物标志物中的应用。
10.权利要求1所述的检测引物和权利要求2所述的检测探针在辅助诊断宫颈癌中的应用。
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