CN114214415A - 一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合及其应用 - Google Patents

一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114214415A
CN114214415A CN202111639060.4A CN202111639060A CN114214415A CN 114214415 A CN114214415 A CN 114214415A CN 202111639060 A CN202111639060 A CN 202111639060A CN 114214415 A CN114214415 A CN 114214415A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
cervical cancer
methylation
seq
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111639060.4A
Other languages
English (en)
Inventor
陈奎桥
陈绍宇
何瑰
欧焕金
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Lbp Medicine Science And Technology Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Lbp Medicine Science And Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Lbp Medicine Science And Technology Co ltd filed Critical Guangzhou Lbp Medicine Science And Technology Co ltd
Priority to CN202111639060.4A priority Critical patent/CN114214415A/zh
Publication of CN114214415A publication Critical patent/CN114214415A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合及其应用。所述引物探针组合包括检测PAX1基因、FAM19A4基因和miR124‑2基因甲基化的引物对和探针。本发明采用独特策略设计检测PAX1，FAM19A4和miR124‑2基因甲基化的引物组合，所述引物探针组合具备高特异性，能够直接利用血浆样本进行检测，且具有较好的检测效果，特异性和灵敏度高，有利于减轻受试者心理压力和额外的不便，追踪检测宫颈癌发生发展过程中的基因甲基化变化，解决宫颈癌发生发展过程监测困难问题。

Description

一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合及其 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合及其应用。
背景技术
宫颈癌是妇科常见恶性肿瘤，原位癌高发年龄为30至35岁，浸润癌为45至55岁，国家癌症中心2018年发布的数据显示，90％的宫颈癌患者确诊时已经发展成浸润癌，生存率大大降低，预后也较差，因此，宫颈癌早期筛查是有效预防宫颈癌的重要途径，宫颈癌早筛方案也为降低宫颈癌发病率和死亡率提供了有利支撑。
目前的宫颈癌筛查流程中，人乳头瘤病毒(HPV)初筛与HPV联合细胞学筛查为同等地位，但是，HPV灵敏度高但特异性低，很多为一过性感染，且部分腺癌中无HPV感染，需要1～2年内清除，并且反复感染，导致HPV阳性受检者的患癌恐慌，往往反复就医，难以避免反复检查，创伤活检增加感染机会，造成过度治疗；液基细胞学特异性高但灵敏度低，且临床应用自动化程度低及诊断需要经验，易造成漏检。目前指南中只纳入高危HPV及细胞学检查作为阴道镜检查的分流策略，但越来越多的其他分流技术及靶标数据也在积累。主要分为两类：(1)基于显微镜的，如p16/ki67双染、TERC基因扩增；(2)基于分子标志物的，如HPV病毒甲基化、宿主细胞人基因甲基化等，且有不少研究是多种分类策略联合，但大都通过宫颈脱落细胞样本进行检测，需要样本量大，样本选择面较窄。
DNA甲基化是最早被发现、也是研究最深入的表观遗传调控机制之一，在调控基因表达、维持染色质结构、基因印记、X染色体失活以及胚胎发育等生物学过程中发挥着重大的作用。与常规宫颈癌筛查和宫颈癌诊断方法相比，甲基化检测主要有如下特点：(1)能弥补TCT检测漏检率高、HPV检测假阳性高等目前国内常规宫颈癌筛查方法的不足；(2)可比常规TCT检测和阴道镜检更早发现宫颈细胞是否有癌前病变；(3)在宫颈癌手后的追踪监测中也有良好的预警作用，因此基因甲基化程度可作为检测宫颈细胞是否正常，以及宫颈癌发生、发展的动态指标，但目前常用的宫颈癌相关基因甲基化检测方法需提取提取待测宫颈组织的基因组DNA，如CN107287294A公开了一种宫颈癌相关基因甲基化程度的检测引物、探针、试剂盒及其应用，频繁取组织检测易引起额外创伤及增加受试者心理压力。
综上所述，提供一种准确率高、易操作、灵敏度高且无创的宫颈癌基因甲基化检测产品及方法，对于宫颈癌早期诊断领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合及其应用，本发明采用独特策略设计检测PAX1基因、FAM19A4基因和miR124-2基因甲基化的引物探针组合，所述引物探针组合具备高特异性，除了传统宫颈脱落细胞样本外，还能够直接利用血浆样本DNA进行检测，且检测具备高灵敏度、特异性和准确性。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合，所述引物探针组合包括检测PAX1基因、FAM19A4基因和miR124-2基因甲基化的引物对和探针，其中，PAX1基因的引物对的核酸序列包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列，PAX1基因的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列，FAM19A4基因的引物对的核酸序列包括SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列，FAM19A4基因的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列，miR124-2基因的引物对的核酸序列包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的序列，miR124-2基因的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.9所示的序列。
本发明选择有代表性的PAX1，FAM19A4和miR124-2作为检测基因，充分分析这些基因甲基化位点分布情况，采用独特设计策略设计检测的引物对和探针，所述引物对和探针具备高特异性，能够进行高灵敏度检测，可直接以血浆中低含量DNA样本进行检测，且检测具备高灵敏度、特异性和准确性，同时能够追踪检测宫颈癌发生发展过程中的基因甲基化变化，实现高效无创检测。
优选地，所述引物探针组合还包括内参基因的引物对和探针。
优选地，所述内参基因包括ACTB基因。
优选地，所述ACTB基因的引物对的核酸序列包括SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的序列，ACTB基因的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.12所示的序列。
SEQ ID NO.1：GAGATTGACGTGGAGGATACGTT。
SEQ ID NO.2：CCAAAATAAACTTCATCCGATTAA。
SEQ ID NO.3：TCGTACG TTGTAGTTTTTCGGTTAGACG。
SEQ ID NO.4：GGGCGCGTCGTTTGAGTA。
SEQ ID NO.5：TAATTAACCGAACCGCCCGA。
SEQ ID NO.6：CCTATCCCTACCTAACCCCGCGATC。
SEQ ID NO.7：ATGACGGAGAATATGTAATAGCGTG。
SEQ ID NO.8：CGTATTATTTTACTAAATACAATTAACCC。
SEQ ID NO.9：AATTCGCCCTAAATCCTTTCTAAAACAC。
SEQ ID NO.10：GTAGGTTTGAGGTGTTTTTAT。
SEQ ID NO.11：ACTCAACCTAAAAAAACCTACCT。
SEQ ID NO.12：CTCCTCCTCCCCCTCCTTAAAAA。
优选地，所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。
优选地，所述荧光基团包括FAM、JOE、VIC、HEX、ROX、CY3或CY5。
优选地，所述淬灭基团包括BHQ、TAMRA或MGB。
第二方面，本发明提供第一方面所述的用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合在制备检测宫颈癌相关基因甲基化的产品中的应用。
第三方面，本发明提供一种检测宫颈癌相关基因甲基化的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合。
优选地，所述试剂盒还包括PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品。
优选地，所述PCR反应液包括DNA聚合酶、dNTP、Mg2+和PCR缓冲液。
优选地，所述阳性质控品包含甲基化基因组DNA，所述阴性质控品包含非甲基化基因组DNA。
第四方面，本发明提供一种如第三方面所述的检测宫颈癌相关基因甲基化的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗目的的使用方法，所述使用方法包括：
对样本中DNA进行亚硫酸盐转化，以所述用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合对亚硫酸盐转化后的DNA样本进行实时荧光定量PCR扩增，对扩增完成的DNA样本进行荧光信号检测和结果判定。
优选地，所述样本包括人宫颈脱落细胞、阴道分泌物、宫颈组织、血浆、或血清从中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，所述检测宫颈癌相关基因甲基化的试剂盒能够直接利用血浆样本进行检测，且具有较好的检测效果，特异性和灵敏度高，有利于减轻受试者心理压力和额外的不便，追踪检测宫颈癌发生发展过程中的基因甲基化变化，解决宫颈癌发生发展过程监测困难问题。
优选地，所述使用方法包括以下步骤：
(1)收集样本，并将样本混匀后进行DNA的提取；
(2)对步骤(1)提取的DNA样本进行亚硫酸盐转化；
(3)采用所述用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合对步骤(2)亚硫酸盐转化后的DNA样本进行实时荧光定量PCR扩增反应；
(4)对步骤(3)PCR扩增完成的DNA样本进行荧光信号检测和结果判定。
优选地，所述结果判定包括：如果PCR扩增中PAX1基因、FAM19A4基因和miR124-2基因中的任一基因有扩增曲线，则计算Ct值，PAX1基因Ct值≤31，判断PAX1基因甲基化阳性；FAM19A4基因Ct值≤31，判断FAM19A4基因甲基化阳性；miR124-2基因Ct值≤30，判断miR124-2基因甲基化阳性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明采用独特策略设计检测PAX1，FAM19A4和miR124-2基因甲基化的引物组合，所述引物探针组合具备高特异性，能够直接利用血浆样本进行检测，且具有较好的检测效果，特异性和灵敏度高，有利于减轻受试者心理压力和额外的不便，追踪检测宫颈癌发生发展过程中的基因甲基化变化，解决宫颈癌发生发展过程监测困难问题。
附图说明
图1为模拟血浆样本检测扩增图；
图2为宫颈病变患者1血浆样本检测扩增图；
图3为宫颈病变患者2血浆样本检测扩增图；
图4为阳性质控品检测扩增图；
图5为阴性质控品检测扩增图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例设计用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合。
选择有代表性的PAX1、FAM19A4和miR124-2作为宫颈癌的候选检测基因，充分分析这些基因甲基化位点分布情况，设计检测的引物和探针，用于检测，引物探针序列如表1所示。
表1
Figure BDA0003442945610000061
Figure BDA0003442945610000071
实施例2
本实施例提供一种检测宫颈癌相关基因甲基化的试剂盒，所述试剂盒含有实施例1所设计引物、PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品和ddH2O，所述阳性质控品采用人甲基化基因组DNA，阴性质控品采用人非甲基化基因组DNA。
实施例3
本实施例利用实施例2中试剂盒进行检测，包括以下步骤：
(1)收集宫颈病变患者的样本和非宫颈病变者样本，使用凯杰集团(QIAGEN GMBH)QIAamp DNA Mini Kit(Cat：51304)核酸提取试剂进行DNA提取；
(2)将提取到样本DNA、阴性质控品和阳性质控品使用ZYMO RESEARCHCORPORATION的EZ DNAMethylation-Gold Kit(Cat：D5006)亚硫酸盐转化试剂盒进行亚硫酸转化；
(3)按表2配制荧光PCR反应体系，扩增程序为：95℃、5min；95℃、10s，60℃、30s，10个循环；95℃、10s，57℃、30s，35个循环，采集荧光；
表2
Figure BDA0003442945610000081
Figure BDA0003442945610000091
(4)结果判读：
1)阳性质控品反应管FAM，CY5，ROX，VIC均应有信号；阴性质控品VIC应有扩增信号，FAM，CY5，ROX无信号，内参基因VIC信号应有扩增曲线升起，则样本实验结果可信；
2)FAM信号有扩增曲线，且Ct值≤31，提示人PAX1基因甲基化阳性；若Ct值＞31，提示人PAX1基因甲基化阴性或甲基化程度低于最低检测限；
3)CY5信号有扩增曲线，且Ct值≤31，提示人FAM 19A4基因甲基化阳性；若Ct值＞31，提示人FAM 19A4基因甲基化阴性或甲基化程度低于最低检测限；
4)ROX信号有扩增曲线，且Ct值≤30，提示人miR124-2基因甲基化阳性；若Ct值＞30，提示人miR124-2基因甲基化阴性或甲基化程度低于最低检测限。
以上三个基因任意一个阳性即判读为检测样本阳性。
并对各样本进行组织学检测，与试剂盒检测结果对比，结果见表3。
表3
Figure BDA0003442945610000092
Figure BDA0003442945610000101
Figure BDA0003442945610000111
注：“-”为甲基化DNA检测阴性，“+”为甲基化检测阳性，组织学结果为宫颈癌和HSIL定义为阳性，组织学结果为阴性和LSIL定义为阴性。
将本发明试剂盒与组织学检测结果对比，计算3个靶标的灵敏度和特异性，如表4所示，由表4可知，FAM19A4和miR124-2基因甲基化在宫颈癌早期检测中的灵敏度和特异性弱于PAX1基因甲基化，PAX1基因甲基化检测的灵敏度达87％，特异性达88％。
表4
灵敏度 特异性
PAX1 87％ 88％
FAM19A4 80％ 53％
miR124-2 67％ 65％
实施例4
本实施例利用实施例2中试剂盒对模拟血浆样本检测，括以下步骤：
(1)模拟血浆样本制备
使用超声打断仪将宫颈癌PAX1基因甲基化阳性细胞株DNA(SiHa细胞)打断至200bp左右的片段，分别将100ng，50ng，25ng和10ng的片段化阳性细胞株DNA加至700μL的血浆中，混匀备用；
(2)模拟血浆的DNA提取
按照凯杰集团(QIAGEN GMBH)QIAamp DNABlood Midi Kit(Cat：51185)的血液DNA提取试剂盒进行DNA提取；
(3)DNA亚硫酸盐转化
将回收得到的DNA使用ZYMO RESEARCH CORPORATION的EZ DNA Methylation-GoldKit(Cat：D5006)亚硫酸盐转化试剂盒进行亚硫酸转化；
(4)模拟血浆样本检测
按表5配制反应体系，PCR扩增程序为：95℃、5min；95℃、10s，60℃、30s，10个循环；95℃、10s，57℃、30s，35个循环，采集荧光；
表5
Figure BDA0003442945610000121
Figure BDA0003442945610000131
(4)结果判读
a.阳性质控品反应管FAM，VIC均应有信号；阴性质控品VIC应有扩增信号，FAM无信号，内参基因VIC信号应有扩增曲线升起，则样本实验结果可信；
b.FAM信号有扩增曲线，且Ct值≤31，提示人PAX1基因甲基化阳性；若Ct值大于31，提示人PAX1基因甲基化阴性或甲基化程度低于最低检测限。
检测结果如表6所示，扩增图如图1所示，由上述结果可知，本发明试剂盒能够有效检测到血浆中短片段DNA的甲基化水平。
表6
Figure BDA0003442945610000132
实施例5
本实施例利用实施例2中试剂盒对真实血浆样本进行检测，包括以下步骤：
(1)收集宫颈病变患者的血浆样本2例，按照美基生物的游离DNA小提试剂盒(1mL)进行DNA提取；
(2)将阴性质控品、阳性质控品和回收得到的病人DNA使用Zymo D5002亚硫酸盐转化试剂盒进行亚硫酸转化；
(3)按表7配制反应体系，PCR扩增程序为：95℃、5min；95℃、10s，60℃、30s，10个循环；95℃、10s，57℃、30s，35个循环，采集荧光；
表7
浓度 加入量
PCR反应液 - 7.2μL
PAX1上游引物 10μM 0.8μL
PAX1下游引物 10μM 0.8μL
PAX1探针 10μM 0.8μL
ACTB上游引物 10μM 0.4μL
ACTB下游引物 10μM 0.4μL
ACTB探针 10μM 0.4μL
模板 - 5μL
水 - 34.2μL
总体系 50μL
(4)结果判读
a.阳性质控品反应管FAM，VIC均应有信号；阴性质控品VIC应有扩增信号，FAM无信号，内参基因VIC信号应有扩增曲线升起，则样本实验结果可信；
b.FAM信号有扩增曲线，且Ct值≤31，提示人PAX1基因甲基化阳性；若Ct值大于31，提示人PAX1基因甲基化阴性或甲基化程度低于最低检测限。
检测结果如表8所示，扩增图如图2-图5所示，由上述结果可知，将本发明试剂盒应用到病人血浆样本中具有较好的检测效果，特异性和灵敏度高，有利于减轻心理压力和额外的不便，追踪检测宫颈癌发生发展过程中的基因甲基化变化，解决宫颈癌发生发展过程监测困难问题。
表8
PAX1Ct值 ACTBCt值
宫颈病变患者样本1 29.68 21.98
宫颈病变患者样本2 29.72 20.34
阳性质控品 24.14 24.31
阴性质控品 无 17.59
综上所述，本发明采用独特策略设计检测PAX1，FAM19A4和miR124-2基因甲基化的引物组合，能够进行准确率高，易操作，灵敏度高的宫颈癌早期检测，实现对宫颈癌早期检测，弥补了HPV检测和液基细胞学检测的不足，避免过度治疗。同时，能够起到动态检测宫颈癌发生发展过程中的基因甲基化变化的效果，减轻心理压力和额外的不便，实现了无创追踪监测宫颈癌基因甲基化变化。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 广州安必平医药科技股份有限公司
<120> 一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合及其应用
<130> 2121-12-28
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gagattgacg tggaggatac gtt 23
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccaaaataaa cttcatccga ttaa 24
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcgtacgttg tagtttttcg gttagacg 28
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gggcgcgtcg tttgagta 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
taattaaccg aaccgcccga 20
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cctatcccta cctaaccccg cgatc 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgacggaga atatgtaata gcgtg 25
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cgtattattt tactaaatac aattaaccc 29
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aattcgccct aaatcctttc taaaacac 28
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gtaggtttga ggtgttttta t 21
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
actcaaccta aaaaaaccta cct 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ctcctcctcc ccctccttaa aaa 23

Claims (10)

1.一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括检测PAX1基因、FAM19A4基因和miR124-2基因甲基化的引物对和探针；
其中，PAX1基因的引物对的核酸序列包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列，PAX1基因的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列；
FAM19A4基因的引物对的核酸序列包括SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列，FAM19A4基因的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列；
miR124-2基因的引物对的核酸序列包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的序列，miR124-2基因的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.9所示的序列。
2.根据权利要求1所述的用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合还包括内参基因的引物对和探针；
优选地，所述内参基因包括ACTB基因；
优选地，所述ACTB基因的引物对的核酸序列包括SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的序列，所述ACTB基因的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.12所示的序列。
3.根据权利要求1或2所述的用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合，其特征在于，所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；
优选地，所述荧光基团包括FAM、JOE、VIC、HEX、ROX、CY3或CY5；
优选地，所述淬灭基团包括BHQ、TAMRA或MGB。
4.权利要求1-3任一项所述的用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合在制备检测宫颈癌相关基因甲基化的产品中的应用。
5.一种检测宫颈癌相关基因甲基化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合。
6.根据权利要求5所述的检测宫颈癌相关基因甲基化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品；
优选地，所述PCR反应液包括DNA聚合酶、dNTP、Mg2+和PCR缓冲液；
优选地，所述阳性质控品包含甲基化基因组DNA，所述阴性质控品包含非甲基化基因组DNA。
7.一种如权利要求5或6所述的检测宫颈癌相关基因甲基化的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗目的的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括：
对样本中DNA进行亚硫酸盐转化，以所述用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合对亚硫酸盐转化后的DNA样本进行实时荧光定量PCR扩增，对扩增完成的DNA样本进行荧光信号检测和结果判定。
8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述样本包括人宫颈脱落细胞、阴道分泌物、宫颈组织、血浆或血清中的任意一种或至少两种的组合。
9.根据权利要求7或8所述的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步骤：
(1)收集样本，并将样本混匀后进行DNA的提取；
(2)对步骤(1)提取的DNA样本进行亚硫酸盐转化；
(3)采用所述用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合对步骤(2)亚硫酸盐转化后的DNA样本进行实时荧光定量PCR扩增反应；
(4)对步骤(3)PCR扩增完成的DNA样本进行荧光信号检测和结果判定。
10.根据权利要求7-9任一项所述的使用方法，其特征在于，所述结果判定包括：如果PCR扩增中PAX1基因、FAM19A4基因和miR124-2基因中的任一基因有扩增曲线，则计算Ct值，PAX1基因Ct值≤31，判断PAX1基因甲基化阳性；FAM19A4基因Ct值≤31，判断FAM19A4基因甲基化阳性；miR124-2基因Ct值≤30，判断miR124-2基因甲基化阳性。
CN202111639060.4A 2021-12-29 2021-12-29 一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合及其应用 Pending CN114214415A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111639060.4A CN114214415A (zh) 2021-12-29 2021-12-29 一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111639060.4A CN114214415A (zh) 2021-12-29 2021-12-29 一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114214415A true CN114214415A (zh) 2022-03-22

Family

ID=80706844

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111639060.4A Pending CN114214415A (zh) 2021-12-29 2021-12-29 一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114214415A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115807087A (zh) * 2022-11-04 2023-03-17 神州医疗科技股份有限公司 一种用于宫颈癌pax1-sox1-sfrp1基因甲基化检测的引物探针组合及其应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150225796A1 (en) * 2011-09-15 2015-08-13 Self-Screen B.V. Methylation analysis on self-samples as triage tool for hpv-positive women
US20150284815A1 (en) * 2012-10-12 2015-10-08 Self-Screen B.V. Prdm14 and fam19a4, molecular diagnostic markers for hpv-induced invasive cancers and their high-grade precursor lesions
CN107287294A (zh) * 2017-06-14 2017-10-24 广州中心法则生物科技有限公司 一种宫颈癌相关基因甲基化程度的检测引物、探针、试剂盒及其应用
CN108060231A (zh) * 2018-02-24 2018-05-22 韩林志 用于宫颈癌基因FAM19A4、miR-124-2甲基化检测的引物对、试剂盒及方法
CN112646882A (zh) * 2020-07-03 2021-04-13 苏州凯爱健康科技有限公司 一种用于宫颈高级别病变及宫颈癌检测的组合物及诊断试剂
CN113265456A (zh) * 2021-03-17 2021-08-17 苏州凯爱健康科技有限公司 一种检测宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化的引物和探针组合
CN113423843A (zh) * 2018-12-04 2021-09-21 香港精准医学技术有限公司 用于宫颈癌早期检测的dna甲基化生物标志物
CN113549694A (zh) * 2021-08-27 2021-10-26 深圳市优圣康生物科技有限公司 一种新型宫颈癌甲基化基因检测方法
RU2760573C1 (ru) * 2021-01-20 2021-11-29 Общество с ограниченной ответственностью "Эс Джи" Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для выявления эпигенетических маркеров рака шейки матки

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150225796A1 (en) * 2011-09-15 2015-08-13 Self-Screen B.V. Methylation analysis on self-samples as triage tool for hpv-positive women
US20150284815A1 (en) * 2012-10-12 2015-10-08 Self-Screen B.V. Prdm14 and fam19a4, molecular diagnostic markers for hpv-induced invasive cancers and their high-grade precursor lesions
CN107287294A (zh) * 2017-06-14 2017-10-24 广州中心法则生物科技有限公司 一种宫颈癌相关基因甲基化程度的检测引物、探针、试剂盒及其应用
CN108060231A (zh) * 2018-02-24 2018-05-22 韩林志 用于宫颈癌基因FAM19A4、miR-124-2甲基化检测的引物对、试剂盒及方法
CN113423843A (zh) * 2018-12-04 2021-09-21 香港精准医学技术有限公司 用于宫颈癌早期检测的dna甲基化生物标志物
CN112646882A (zh) * 2020-07-03 2021-04-13 苏州凯爱健康科技有限公司 一种用于宫颈高级别病变及宫颈癌检测的组合物及诊断试剂
RU2760573C1 (ru) * 2021-01-20 2021-11-29 Общество с ограниченной ответственностью "Эс Джи" Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для выявления эпигенетических маркеров рака шейки матки
CN113265456A (zh) * 2021-03-17 2021-08-17 苏州凯爱健康科技有限公司 一种检测宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化的引物和探针组合
CN113549694A (zh) * 2021-08-27 2021-10-26 深圳市优圣康生物科技有限公司 一种新型宫颈癌甲基化基因检测方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115807087A (zh) * 2022-11-04 2023-03-17 神州医疗科技股份有限公司 一种用于宫颈癌pax1-sox1-sfrp1基因甲基化检测的引物探针组合及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108977543B (zh) 一种基于联合检测sdc2和sfrp2基因甲基化水平的结直肠癌早期诊断试剂
CN113755603B (zh) 子宫内膜癌早期筛查诊断用标志物、引物探针及试剂盒
US10221458B2 (en) Method for screening cancer
CN112646882B (zh) 一种用于宫颈高级别病变及宫颈癌检测的组合物及诊断试剂
CN112941189B (zh) 宫颈癌早筛分子标志物znf671基因甲基化检测的引物探针组合物及试剂盒和使用方法
CN113265456B (zh) 一种检测宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化的引物和探针组合
CN113249485A (zh) 一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合和试剂盒及其应用
CN115820847A (zh) 一种用于宫颈癌相关基因甲基化的检测试剂及其应用
CN111793674A (zh) 一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法
CN105177164B (zh) 一种用于宫颈癌早期筛查的分子标记和检测引物
CN112375824B (zh) Msc作为宫颈癌诊断、预后和/或治疗标志物的应用
CN112375825B (zh) 一种宫颈癌诊断、预后判断试剂盒
CN113549694A (zh) 一种新型宫颈癌甲基化基因检测方法
CN114214415A (zh) 一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合及其应用
CN117089614A (zh) 一种宫颈癌相关基因dna甲基化pcr-荧光探针法检测试剂盒
CN108949923B (zh) 一种扩增msf1基因的方法及试剂盒与应用
TWI385252B (zh) 一種癌症篩檢的方法
EP4130297A1 (en) Markers, primers, probes and kit for early screening and diagnosis of endometrial cancer
CN115961038A (zh) 一种用于检测胃癌的组合物，试剂盒及其用途
CN115976202A (zh) 一种用于检测宫颈癌相关基因甲基化的引物探针组合和试剂盒
CN115948562B (zh) 检测基因甲基化的试剂在宫颈癌诊断中的应用以及试剂盒
CN114457156B (zh) 一种用于宫颈癌甲基化检测的引物和探针组合、试剂盒及其使用方法
CN116103406B (zh) 检测宫颈高级别鳞状上皮内病变的引物探针组合及应用
CN116970705B (zh) 用于尿路上皮癌基因甲基化检测的核酸产品、试剂盒及应用
CN115725734B (zh) Znf781基因在制备宫颈癌诊断试剂中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination