CN117089614A - 一种宫颈癌相关基因dna甲基化pcr-荧光探针法检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及宫颈癌DNA甲基化筛查技术领域，尤其涉及IPC C12Q1，更具体的涉及，一种宫颈癌相关基因DNA甲基化PCR‑荧光探针法检测试剂盒。本发明中的试剂盒包括核酸扩增试剂和对照品，所述试剂盒检测的为6种宫颈癌相关抑癌基因，包括FAM19A4、PHACTR3、SST、ZIC1、PAX1、ZNF671，所述的核酸扩增试剂和对照品包括甲基化反应液A、甲基化反应液B、甲基化PCR Master MIX、阴性对照、阳性对照。本发明提供了一个新的基因联合检测试剂盒，能够体外定性检测人宫颈脱落细胞样本中与宫颈癌发生和进展紧密相关的基因启动子区CpG岛DNA甲基化，提高了宫颈癌筛查的准确性和特异性。
Description
技术领域
本发明涉及宫颈癌DNA甲基化筛查技术领域，尤其涉及IPC C12Q1，更具体的涉及，一种宫颈癌相关基因DNA甲基化PCR-荧光探针法检测试剂盒。
背景技术
宫颈癌的主要类型分为：宫颈鳞癌、腺癌及腺鳞癌，占所有宫颈癌的90％以上。高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的持续感染是导致宫颈癌发生及癌前病变的首要因素。
目前的宫颈细胞学检测主要采用宫颈液基细胞学检查法(thinprep cytologictest，TCT)，取材于宫颈的新旧鳞-柱上皮交界间的移行带处，观察宫颈鳞-柱交界部位有无异型上皮变化。HPV检测主要检测高危型HPV。根据2022年《宫颈癌筛查工作方案》中的“高危型HPV检测流程图”，HPV16/18型阳性的感染者全部纳入阴道镜检查。而HPV16/18以外的其他高危型阳性或者未分型检测方法任何高危型阳性的感染者，经宫颈细胞学检查，无论异常还是可疑的患者，也都全部纳入阴道镜检查。因此，那些本属于轻度宫颈不典型增生(LSIL，也即CIN I)，或者没有明确诊断意义的不典型鳞状上皮细胞(ASCUS)，或者正常的感染者，本无必要做阴道镜检查取组织活检，根据《ACOG临床指南》可按宫颈炎处理或者不处理，3-6个月随访即可。
DNA甲基化是公认的癌前阶段和进展阶段最常见的表观遗传学异常。抑癌基因DNA甲基化是肿瘤发生早期阶段抑癌基因功能失活的关键机制之一。宫颈癌的一些关键抑癌基因DNA甲基化已经在许多研究中被证实。一些单一基因的DNA甲基化检测试剂盒，检测的特异性和准确度低，容易造成假阴性，漏检率高。因此，本领域需要开发一种高检测率、高特异性、高准确度的多基因联合检测的宫颈癌相关基因DNA甲基化检测试剂盒。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明第一方面提供了一种宫颈癌相关基因DNA甲基化PCR-荧光探针法检测试剂盒，包括核酸扩增试剂和对照品；
优选的，所述宫颈癌相关基因DNA甲基化PCR-荧光探针法检测试剂盒检测的为6种宫颈癌相关抑癌基因，包括FAM19A4、PHACTR3、SST、ZIC1、PAX1、ZNF671。
优选的，所述核酸扩增试剂包括甲基化反应液A、甲基化反应液B、甲基化PCRMaster MIX。
优选的，所述甲基化反应液A包括FAM19A4、PHACTR3、SST、ZIC1、PAX1、ZNF671中三种基因的引物和荧光探针，以及内部质控基因ACTB的引物和荧光探针、工艺用水。
优选的，所述甲基化反应液A包括ZNF671引物、ZNF671-FAM荧光探针、FAM19A4引物、FAM19A4-CY5荧光探针、PHACTR3引物、PHACTR3-Texas Red荧光探针、ACTB引物、ACTB-VIC荧光探针。
优选的，所述ZNF671引物包括40～60μmol/L ZNF671-上游引物(SEQ ID NO.1)、40～60μmol/L ZNF671-下游引物(SEQ ID NO.2)；所述ZNF671-FAM荧光探针为40～60μmol/LZNF671-FAM(SEQ ID NO.3)；
所述FAM19A4引物包括40～60μmol/L FAM+19A4-上游引物(SEQ ID NO.4)、40～60μmol/L FAM19A4-下游引物(SEQ ID NO.5)；所述FAM19A4-CY5荧光探针为40～60μmol/LFAM19A4-CY5荧光探针(SEQ ID NO.6)；
所述PHACTR3引物包括40～60μmol/L PHACTR3-上游引物(SEQ ID NO.7)、40～60μmol/L PHACTR3-下游引物(SEQ ID NO.8)；所述PHACTR3-Texas Red荧光探针为40～60μmol/L PHACTR3-Texas Red荧光探针(SEQ ID NO.9)；
所述ACTB引物包括40～60μmol/L ACTB-上游引物(SEQ ID NO.19)、40～60μmol/LACTB-下游引物(SEQ ID NO.20)；所述ACTB-VIC荧光探针为40～60μmol/L ACTB-VIC荧光探针(SEQ ID NO.21)。
优选的，所述ZNF671-上游引物、ZNF671-下游引物、ZNF671-FAM荧光探针、FAM19A4-上游引物、FAM19A4-下游引物、FAM19A4-CY5荧光探针、PHACTR3-上游引物、PHACTR3-下游引物、PHACTR3-Texas Red荧光探针、ACTB-上游引物、ACTB-下游引物、ACTB-VIC荧光探针、工艺用水的体积比为(3～5)：(3～5)：2：(3～5)：(3～5)：2：(3～5)：(3～5)：2：3：3：2；进一步优选的为3：3：2：3：3：2：3：3：2：3：3：2。
优选的，所述甲基化反应液A中工艺用水与甲基化反应液A的体积比为159：175。
优选的，所述甲基化反应液B包括FAM19A4、PHACTR3、SST、ZIC1、PAX1、ZNF671中三种基因的引物和荧光探针，以及内部质控基因ACTB的引物和荧光探针。
优选的，所述甲基化反应液B包括ZIC1引物、ZIC1-FAM荧光探针、PAX1引物、PAX1-CY5荧光探针、SST引物、SST-Texas Red荧光探针、ACTB引物、ACTB-VIC荧光探针。
优选的，所述ZIC1引物包括40～60μmol/L ZIC1-上游引物(SEQ ID NO.10)、40～60μmol/L ZIC1-下游引物(SEQ ID NO.11)；所述ZIC1-FAM荧光探针为40～60μmol/L ZIC1-FAM(SEQ ID NO.12)；
所述PAX1引物包括40～60μmol/L PAX1-上游引物(SEQ ID NO.13)、40～60μmol/LPAX1-下游引物(SEQ ID NO.14)；所述PAX1-CY5荧光探针为40～60μmol/L PAX1-CY5荧光探针(SEQ ID NO.15)；
所述SST引物包括40～60μmol/L SST-上游引物(SEQ ID NO.16)、40～60μmol/LSST-下游引物(SEQ ID NO.17)；所述SST-Texas Red荧光探针为40～60μmol/L SST-TexasRed荧光探针(SEQ ID NO.18)；
所述ACTB引物包括40～60μmol/L ACTB-上游引物(SEQ ID NO.19)、40～60μmol/LACTB-下游引物(SEQ ID NO.20)；所述ACTB-VIC荧光探针为40～60μmol/L ACTB-VIC荧光探针(SEQ ID NO.21)。
本发明中，通过设计特定的FAM19A4、PHACTR3、SST、ZIC1、PAX1、ZNF671的引物序列和荧光探针，提高了DNA甲基化检测的特异性和准确性。本发明人发现，特定的FAM19A4、PHACTR3、SST、ZIC1、PAX1、ZNF671的引物序列和荧光探针只能扩增发生甲基化的基因，采用核酸扩增技术，结合特异性识别扩增基因区段中甲基化胞嘧啶C的Taqman荧光标记探针，通过荧光信号的变化定性检测经重亚硫酸盐转化后的宫颈脱落细胞DNA样本中宫颈癌相关基因FAM19A4，PHACTR3，SST，ZIC1，PAX1和ZNF671的DNA甲基化，防止检错、漏检现象。
优选的，所述ZIC1-上游引物、ZIC1-下游引物、ZIC1-FAM荧光探针、PAX1-上游引物、PAX1-下游引物、PAX1-CY5荧光探针、SST-上游引物、SST-下游引物、SST-Texas Red荧光探针、ACTB-上游引物、ACTB-下游引物、ACTB-VIC荧光探针、工艺用水的体积比(3～5)：(3～5)：2：(3～5)：(3～5)：2：(3～5)：(3～5)：2：3：3：2；进一步优选的为3：3：2：3：3：2：3：3：2：3：3：2。
优选的，所述甲基化反应液B中工艺用水与甲基化反应液A的体积比为159：175。
优选的，所述甲基化PCR Master MIX包括DNA Taq酶、dNTPs、MgCl2、PCR Buffer、水。
优选的，所述甲基化PCR Master MIX的制备方法为：将5000μL 5X PCR Buffer(MgCl2 free)，1000μL DNA Taq酶(1.5U/μL)，500μL MgCl2(200mM)，250μL dNTP Mix(25mMeach)，6250μL工艺用水，总体积13000μL，充分混匀，分装后存放于-20℃。
优选的，所述甲基化反应液A、甲基化反应液B、甲基化PCR Master MIX的体积比为1：1：(1.5～4)；进一步优选的，为3.5：3.5：13。
优选的，所述对照品包括阴性对照和阳性对照。
优选的，所述的阴性对照为非甲基化DNA。
优选的，所述阴性对照的配制过程为用工艺用水稀释非甲基化DNA至1ng/μL。
优选的，所述非甲基化DNA购自上海生工有限公司。
优选的，所述的阳性对照为宫颈癌细胞株基因组DNA。
优选的，所述阳性对照的配制过程为用工艺用水稀释宫颈癌Hela细胞株基因组DNA原液至1ng/μL。
优选的，所述的宫颈癌细胞株基因组DNA购自上海思泰得医学检验实验室有限公司。
本发明第二方面提供了宫颈癌相关基因DNA甲基化PCR-荧光探针法检测试剂盒的使用方法：抽提DNA，甲基化检测前样本处理，荧光PCR检测：荧光PCR试剂准备、扩增条件设定、检测通道设定、参比荧光设定，检测，M值计算，结果判定。
优选的，所述的宫颈癌相关基因DNA甲基化PCR-荧光探针法检测试剂盒的具体使用方法，包括以下步骤：
S1：抽提DNA：
使用上海源奇生物医药科技有限公司生产的“核酸提取或纯化试剂”(订货编号：W064)进行核酸提取。
S2：甲基化检测前样本处理：
取出10ng DNA样本，使用上海源奇生物医药科技有限公司生产的“甲基化检测前样本处理试剂盒”(订货编号：W062)转化DNA样本。
S3：荧光PCR检测：
3.1荧光PCR试剂准备：从试剂盒中取出甲基化反应液A，甲基化反应液B，甲基化PCR Master MIX。室温融化并混匀后，1500～2500rpm离心10～15s。
配制甲基化基因检测的荧光PCR反应液，PCR反应液体系1人份均按表1配制：
表1
建议采用Master mix配制上述荧光PCR预混液，分别按每孔20μL分装于荧光PCR孔板内。分装完荧光PCR预混液后，再分别向孔内加入5μL亚硫酸盐转化后的DNA样本，封盖混匀。阴性对照和阳性对照需要在甲基化检测前重亚硫酸盐处理步骤中加入。
3.2.扩增条件设定见表2；
表2
3.3.检测通道设定见表3；
表3
3.4.参比荧光设定见表4；
表4
| 机型 | 参比荧光设定 |
| 天隆Gentier 96R | none |
S4：检测：
(1)扩增曲线显示设置：使用天隆Gentier分析软件分析荧光定量PCR检测数据，Y-axis显示区间初始定义为-100至1,000，可根据实际检测情况调整Y-axis显示区间。
(2)基线的确定：软件默认循环的荧光信号基线。在实验中，一般选择曲线波动较小，较稳定的那段作为基线，用户可根据实际情况自行酌情调整。起点要避开开始几个循环由于高温导致的信号增高，设在信号已经降到背景高度且能维持平稳的地方，终点要避免覆盖信号已经开始有明显增长的地方。
(3)阈值的确定：在阴性对照无扩增和阳性对照有扩增的情况下，阈值设定在阳性对照的扩增曲线的拐点处，且高于无扩增曲线样本的最高点，确定起始阈值，在天隆Gentier机型中推荐阈值设在100。
S5：M值计算：
将荧光定量PCR检测数据文件以excel格式输出，计算每个基因的CT值导入M值计算软件，计算M值及判断阴阳性。
所述M值的计算公式为：
M＝c+a1*FAM19A4+a2*PHACTR3+a3*SST+a4*ZIC1+a5*PAX1+a6*ZNF671
c为1.240～1.250之间，a1位于-0.001～-0.003之间，a2位于-0.003～-0.004之间，a3位于-0.009～-0.010之间，a4位于-0.010～-0.012之间，a5位于-0.025～-0.03之间，a6位于-0.010～-0.013之间。所述判断阴阳性的cut-off值为0.4～0.6之间。
S6：结果判定
a、有效性判定：
阴性对照的内参ACTB扩增曲线正常且VIC荧光通道的CT值<36，M值判断阴性则有效，反之，阴性对照无效，需重复本次实验。
阳性对照的内参ACTB扩增曲线正常且VIC荧光通道的CT值<36，M值判断阳性则有效，反之，阳性对照无效，需重复本次实验。
待测样品中内参基因ACTB在VIC荧光通道必须有信号升起且CT值<36，否则提示加入的DNA质量不佳，或者含有PCR抑制剂，或者重亚硫酸盐转化不完全，需要重新提取DNA或重新进行重亚硫酸盐转化后重做。
b、判定：
在该项检测甲基化评分中，把检测基因和内参基因ACTB的CT值输入本试剂盒附带的计算软件，其中各个基因无扩增时，CT值定义为50，得出甲基化综合分值M值。
阳性结果：待测样本ACTB的CT值＜36，M值判断样本为阳性。
阴性结果：待测样本ACTB的CT值＜36，M值判断样本为阴性。
无效结果：如果ACTB的CT值≥36，说明本次结果无效，建议复检。
优选的，所述宫颈癌相关基因DNA甲基化PCR-荧光探针法检测试剂盒所用的样本为宫颈刷采集的宫颈脱落细胞、组织粘液、分泌物采集的宫颈细胞样本。
优选的，所述的样本保存情况如下：宫颈刷采集管(样本量＞1ml)，室温保存2天，2～8℃条件下保存1周；细胞保存液收集宫颈细胞(样本量＞1ml)，室温可保存4周，细胞不会变形。
优选的，所述样本需要采用宫颈细胞DNA提取及纯化试剂盒进行抽提，提取完的DNA建议立即进行检测，临时存放4℃不超过7天，短期于-20℃以下保存不超过1年。
优选的，所述的样本DNA总量不低于10ng。
优选的，所述判断阴阳性的cut-off值为0.4～0.6之间。
本发明提供了一个新的基因联合检测试剂盒，通过对FAM19A4、PHACTR3、SST、ZIC1、PAX1、ZNF671的DNA甲基化程度的检测，提高了宫颈癌筛查的准确性和特异性。本发明人意外发现，通过选择检测宫颈癌相关抑癌基因FAM19A4、PHACTR3、SST、ZIC1、PAX1、ZNF671的DNA甲基化程度，并根据FAM19A4、PHACTR3、SST、ZIC1、PAX1、ZNF671在宫颈癌中的DNA甲基化情况，设计出6基因的模型，得出甲基化综合分值M值的计算公式，当待测样本ACTB的CT值＜36，M值计算软件判断阳性则判断样本为阳性；待测样本ACTB的CT值＜36，M值计算软件判断阴性则判断样本为阴性。本试剂盒对阳性参考品检测均为阳性，对阴性参考品检测均为阴性，具有优异的准确度。
本发明提供了一种试剂盒，能够体外定性检测人宫颈脱落细胞样本中与宫颈癌发生和进展紧密相关的基因启动子区CpG岛DNA甲基化，适用于高危型HPV检测阳性的21岁以上女性人群，帮助识别是否需要进行阴道镜检查，达到分流管理的目的。本发明人发现在高危型HPV检测中，HPV16/18以外的其他高危型阳性或者未分型检测方法任何高危型阳性的感染者，无论异常还是可疑的患者，也都全部纳入阴道镜检查。而其中的轻度宫颈不典型增生(LSIL，也即CIN I)，或者没有明确诊断意义的不典型鳞状上皮细胞(ASCUS)，本无必要做阴道镜检查取组织活检，而本试剂盒能够高准确度，高特异性的检测出LSIL、ASCUS阴性，HSIL，宫颈癌阳性，避免不必要的阴道镜检测。
有益效果
1、本发明提供了一个新的基因联合检测试剂盒，通过对FAM19A4、PHACTR3、SST、ZIC1、PAX1、ZNF671的DNA甲基化程度的检测，提高了宫颈癌筛查的准确性和特异性。
2、本发明提供了一种试剂盒，能够体外定性检测人宫颈脱落细胞样本中与宫颈癌发生和进展紧密相关的基因启动子区CpG岛DNA甲基化，适用于高危型HPV检测阳性的21岁以上女性人群，帮助识别是否需要进行阴道镜检查，达到分流管理的目的。
3、本发明中，通过设计特定的FAM19A4、PHACTR3、SST、ZIC1、PAX1、ZNF671的引物序列和荧光探针，提高了DNA甲基化检测的特异性和准确性。
4、本试剂盒设置了阴性对照、阳性对照和内部质控基因ACTB，提高了试剂盒的检测的质量及检测的特异性。本试剂盒通过设置阴性对照和阳性对照，用于评估样本检测前重亚硫酸盐转化处理质量是否合格以及试剂盒检测的特异性，本试剂盒同时还设置了内部质控基因ACTB的检测，用于评估检测样本DNA是否足量以及重亚硫酸盐转化质量是否合格，从而提高了试剂盒的检测质量。
附图说明
图1为实施例1中ACTB-VIC、ZIC1-FAM、SST-Texas Red、PAX1-CY5检测结果图。
具体实施方式
实施例1
本实施例第一方面提供了一种宫颈癌相关基因DNA甲基化PCR-荧光探针法检测试剂盒，包括核酸扩增试剂和对照品；
所述宫颈癌相关基因DNA甲基化PCR-荧光探针法检测试剂盒检测的为6种宫颈癌相关抑癌基因，包括FAM19A4、PHACTR3、SST、ZIC1、PAX1、ZNF671。
所述核酸扩增试剂包括甲基化反应液A、甲基化反应液B、甲基化PCR Master MIX。
所述甲基化反应液A的配制过程为：将60μL ZNF671-上游引物(50μmol/L)，60μLZNF671-下游引物(50μmol/L)，40μL ZNF671-FAM荧光探针(50μmol/L)，60μL FAM19A4-上游引物(50μmol/L)，60μL FAM19A4-下游引物(50μmol/L)，40μL FAM19A4-CY5荧光探针(50μmol/L)，60μL PHACTR3-上游引物(50μmol/L)，60μL PHACTR3-下游引物(50μmol/L)，40μLPHACTR3-Texas Red荧光探针(50μmol/L),60μL ACTB-上游引物(50μmol/L)，60μL ACTB-下游引物(50μmol/L)，40μL ACTB-VIC荧光探针(50μmol/L)，6360μL工艺用水，充分混匀，分装至336μmol/管。
所述甲基化反应液B的配制过程为：将60μL ZIC1-上游引物(50μmol/L)，60μLZIC1-下游引物(50μmol/L)，40μL ZIC1-FAM荧光探针(50μmol/L)，60μLPAX1-上游引物(50μmol/L)，60μL PAX1-下游引物(50μmol/L)，40μLPAX1-CY5荧光探针(50μmol/L)，60μL SST-上游引物(50μmol/L)，60μL SST-下游引物(50μmol/L)，40μL SST-Texas Red荧光探针(50μmol/L)，60μL ACTB-上游引物(50μmol/L)，60μL ACTB-下游引物(50μmol/L)，40μL ACTB-VIC荧光探针(50μmol/L)，6360μL工艺用水，充分混匀，分装至336μmol/管。
所述的FAM19A4、PHACTR3、SST、ZIC1、PAX1、ZNF671、ACTB的引物，荧光探针如表5所示。
表5
所述甲基化反应液A、甲基化反应液B中的引物和荧光探针由生工生物工程(上海)有限公司合成。
所述甲基化PCR Master MIX包括DNA Taq酶、dNTPs、MgCl2、PCR Buffer、水。
所述甲基化PCR Master MIX的制备方法为：将5000μL 5X PCR Buffer(MgCl2free)，1000μL DNA Taq酶(1.5U/μL)，500μL MgCl2(200mM)，250μL dNTP Mix(25mM each)，6250μL工艺用水，总体积13000μL，充分混匀，分装至1248μmol/管存放于-20℃。
所述5X PCR Buffer、DNA Taq酶、MgCl2均购自苏州新海生物科技股份有限公司。
所述dNTP Mix购自上海罗氏制药有限公司。
所述对照品包括阴性对照和阳性对照。
所述的阴性对照为非甲基化DNA。
所述阴性对照的配制过程为用工艺用水稀释非甲基化DNA至1ng/μL。
所述非甲基化DNA由上海生工公司提供。
所述的阳性对照为宫颈癌细胞株基因组DNA。
所述阳性对照的配制过程为用工艺用水稀释宫颈癌Hela细胞株基因组DNA原液至1ng/μL。
所述的宫颈癌细胞株基因组DNA由上海思泰得医学检验实验室有限公司提供。
所述的工艺用水均满足《YYT 1244-2014体外诊断试剂用纯化水》的要求。
本实施例第二方面提供了宫颈癌相关基因DNA甲基化PCR-荧光探针法检测试剂盒的使用方法：抽提DNA、甲基化检测前样本处理、荧光PCR检测、检测、M值计算、结果判定。
所述的宫颈癌相关基因DNA甲基化PCR-荧光探针法检测试剂盒的具体使用方法，包括以下步骤：
S1：抽提DNA：
使用上海源奇生物医药科技有限公司生产的“核酸提取或纯化试剂”(订货编号：W064)进行核酸提取。
S2：甲基化检测前样本处理：
取出10ng DNA样本，使用上海源奇生物医药科技有限公司生产的“甲基化检测前样本处理试剂盒”(订货编号：W062)转化DNA样本。
S3：荧光PCR检测：
3.1.荧光PCR试剂准备：从试剂盒中取出甲基化反应液A，甲基化反应液B，PCRMaster MIX(甲基化)。室温融化并混匀后，2000rpm离心10s。
配制甲基化基因检测的荧光PCR反应液，PCR反应液体系1人份均按表1配制；
建议采用Master mix配制上述荧光PCR预混液，分别按每孔20μL分装于荧光PCR孔板内。分装完荧光PCR预混液后，再分别向孔内加入5μL亚硫酸盐转化后的DNA样本，封盖混匀。阴性对照和阳性对照需要在甲基化检测前重亚硫酸盐处理步骤中加入。
3.2.扩增条件设定见表2；
3.3.检测通道设定见表3；
3.4.参比荧光设定见表4；
S4：检测：
(1)扩增曲线显示设置：使用天隆Gentier分析软件分析荧光定量PCR检测数据，Y-axis显示区间初始定义为-100至1,000，可根据实际检测情况调整Y-axis显示区间。其中ACTB-VIC、ZIC1-FAM、SST-Texas Red、PAX1-CY5检测结果见图1.
(2)基线的确定：软件默认循环的荧光信号基线。在实验中，一般选择曲线波动较小，较稳定的那段作为基线，用户可根据实际情况自行酌情调整。起点要避开开始几个循环由于高温导致的信号增高，设在信号已经降到背景高度且能维持平稳的地方，终点要避免覆盖信号已经开始有明显增长的地方。
(3)阈值的确定：在阴性对照无扩增和阳性对照有扩增的情况下，阈值设定在阳性对照的扩增曲线的拐点处，且高于无扩增曲线样本的最高点，确定起始阈值，在天隆Gentier机型中推荐阈值设在100。
S5：M值计算：
将荧光定量PCR检测数据文件以excel格式输出，计算每个基因的CT值导入M值计算软件，计算M值及判断阴阳性。
所述M值的计算公式为：
M＝c+a1*FAM19A4+a2*PHACTR3+a3*SST+a4*ZIC1+a5*PAX1+a6*ZNF671
c为1.243，a1为-0.001，a2为-0.003，a3为-0.009，a4为-0.011，a5位于-0.028之间，a6位于-0.010；
所述判断阴阳性的cut-off值为0.4～0.6之间。
S6：结果判定
a、有效性判定：
阴性对照的内参ACTB扩增曲线正常且VIC荧光通道的CT值<36，M值<0.451则有效，反之，阴性对照无效，需重复本次实验。
阳性对照的内参ACTB扩增曲线正常且VIC荧光通道的CT值<36，M值≥0.451则有效，反之，阳性对照无效，需重复本次实验。
待测样品中内参基因ACTB在VIC荧光通道必须有信号升起且CT值<36，否则提示加入的DNA质量不佳，或者含有PCR抑制剂，或者重亚硫酸盐转化不完全，需要重新提取DNA或重新进行重亚硫酸盐转化后重做。
b、判定：
在该项检测甲基化评分中，把检测基因和内参基因ACTB的CT值输入本试剂盒附带的计算软件，其中各个基因无扩增时，CT值定义为50，得出甲基化综合分值M值。
阳性结果：待测样本ACTB的CT值＜36，M值判断阳性则判断样本为阳性。
阴性结果：待测样本ACTB的CT值＜36，M值判断阴性则判断样本为阴性。
无效结果：如果ACTB的CT值≥36，说明本次结果无效，建议复检。
所述宫颈癌相关基因DNA甲基化PCR-荧光探针法检测试剂盒所用的样本为宫颈刷采集的宫颈脱落细胞、组织粘液、分泌物采集的宫颈细胞样本。
所述的样本保存情况如下：宫颈刷采集管(样本量＞1ml)，室温保存2天，4℃条件下保存1周；细胞保存液收集宫颈细胞(样本量＞1ml)，室温可保存4周，细胞不会变形。
所述样本需要采用宫颈细胞DNA提取及纯化试剂盒进行抽提，提取完的DNA建议立即进行检测，临时存放4℃不超过7天，短期于-20℃以下保存不超过1年。
所述的样本DNA总量为20ng。
性能测试
1、对试剂盒进行观察。试剂盒外观：试剂盒外观完好，各管封闭性能良好，无渗漏，标识清晰，装量准确。
2、能从宫颈细胞样本中提取的人类基因组DNA中检测FAM19A4、PHACTR3、SST、ZIC1、PAX1、ZNF671基因DNA甲基化情况，不能检测出其他基因DNA甲基化。
3、使用实施例1中的宫颈癌相关基因DNA甲基化PCR-荧光探针法检测试剂盒，并通过相应的使用方法对6份阳性参考品进行检测，检测结果均为甲基化阳性，即为宫颈癌阳性。各阳性参考品为P1～P6，如表6所示。所述的阳性参考品均来自上海思泰得医学检验实验室有限公司。
表6
4、使用实施例1中的宫颈癌相关基因DNA甲基化PCR-荧光探针法检测试剂盒，并通过相应的使用方法对9份阴性参考品进行检测，检测结果均为甲基化阴性，即为宫颈癌阴性。各阴性参考品为N1～N9，如表7所示。所述的阴性参考品均来自于上海思泰得医学检验实验室有限公司。
表7
5、使用实施例1中的宫颈癌相关基因DNA甲基化PCR-荧光探针法检测试剂盒，并通过相应的使用方法对检测限参考品进行检测，检测限参考品包括3份，命名为精密度参考品L1、L2、L3，为健康人外周血白细胞DNA-2％ Hela细胞株DNA、健康人外周血白细胞DNA-1％Hela细胞株DNA和健康人外周血白细胞DNA-0.5％ Hela细胞株DNA。对企业检测限参考品L1、L2、L3进行检测，本试剂盒检测结果应均为：阳性。见表8。所述的检测限参考品均来自于上海思泰得医学检验实验室有限公司。
在最低DNA总量为10ng条件下，本试剂盒的检测限为0.5％甲基化DNA。6个基因的最低检出限见表9。
表8
表9
| 基因名称 | 甲基化比率 |
| FAM19A4 | 2％ |
| PHACTR3 | 2％ |
| SST | 0.5％ |
| ZIC1 | 0.5％ |
| PAX1 | 1％ |
| ZNF671 | 1％ |
6、使用实施例1中的宫颈癌相关基因DNA甲基化PCR-荧光探针法检测试剂盒，并通过相应的使用方法对精密度参考品进行检测，精密度参考品包括2种，命名为精密度参考品A1和A2，为健康人外周血白细胞DNA-5％ Hela细胞株DNA和健康人外周血白细胞DNA-1％Hela细胞株DNA。对企业精密度参考品A1和A2进行检测，本试剂盒检测结果应均为：阳性，且CT值的变异系数(CV，％)应≤5％。结果见表10。所述的精密度参考品均来自于上海思泰得医学检验实验室有限公司。
表10
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Claims (10)
1.一种宫颈癌相关基因DNA甲基化PCR-荧光探针法检测试剂盒，其特征在于，包括核酸扩增试剂和对照品；所述宫颈癌相关基因DNA甲基化PCR-荧光探针法检测试剂盒检测的为6种宫颈癌相关抑癌基因，包括FAM19A4、PHACTR3、SST、ZIC1、PAX1、ZNF671。
2.根据权利要求1所述的宫颈癌相关基因DNA甲基化PCR-荧光探针法检测试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂包括甲基化反应液A、甲基化反应液B、甲基化PCR Master MIX。
3.根据权利要求2所述的宫颈癌相关基因DNA甲基化PCR-荧光探针法检测试剂盒，其特征在于，所述甲基化反应液A包括FAM19A4、PHACTR3、SST、ZIC1、PAX1、ZNF671中三种基因的引物和荧光探针，以及内部质控基因ACTB的引物和荧光探针、工艺用水；所述甲基化反应液A包括ZNF671引物、ZNF671-FAM荧光探针、FAM19A4引物、FAM19A4-CY5荧光探针、PHACTR3引物、PHACTR3-Texas Red荧光探针、ACTB引物、ACTB-VIC荧光探针。
4.根据权利要求3所述的宫颈癌相关基因DNA甲基化PCR-荧光探针法检测试剂盒，其特征在于，所述ZNF671引物包括40～60μmol/L ZNF671-上游引物(SEQ ID NO.1)、40～60μmol/L ZNF671-下游引物(SEQ ID NO.2)；所述ZNF671-FAM荧光探针为40～60μmol/LZNF671-FAM(SEQ ID NO.3)；
所述FAM19A4引物包括40～60μmol/L FAM+19A4-上游引物(SEQ ID NO.4)、40～60μmol/L FAM19A4-下游引物(SEQ ID NO.5)；所述FAM19A4-CY5荧光探针为40～60μmol/LFAM19A4-CY5荧光探针(SEQ ID NO.6)；
所述PHACTR3引物包括40～60μmol/L PHACTR3-上游引物(SEQ ID NO.7)、40～60μmol/L PHACTR3-下游引物(SEQ ID NO.8)；所述PHACTR3-Texas Red荧光探针为40～60μmol/LPHACTR3-Texas Red荧光探针(SEQ ID NO.9)；
所述ACTB引物包括40～60μmol/L ACTB-上游引物(SEQ ID NO.19)、40～60μmol/LACTB-下游引物(SEQ ID NO.20)；所述ACTB-VIC荧光探针为40～60μmol/L ACTB-VIC荧光探针(SEQ ID NO.21)。
5.根据权利要求2所述的宫颈癌相关基因DNA甲基化PCR-荧光探针法检测试剂盒，其特征在于，所述甲基化反应液B包括FAM19A4、PHACTR3、SST、ZIC1、PAX1、ZNF671中三种基因的引物和荧光探针，以及内部质控基因ACTB的引物和荧光探针；所述甲基化反应液B包括ZIC1引物、ZIC1-FAM荧光探针、PAX1引物、PAX1-CY5荧光探针、SST引物、SST-Texas Red荧光探针、ACTB引物、ACTB-VIC荧光探针。
6.根据权利要求5所述的宫颈癌相关基因DNA甲基化PCR-荧光探针法检测试剂盒，其特征在于，所述ZIC1引物包括40～60μmol/L ZIC1-上游引物(SEQ ID NO.10)、40～60μmol/LZIC1-下游引物(SEQ ID NO.11)；所述ZIC1-FAM荧光探针为40～60μmol/L ZIC1-FAM(SEQID NO.12)；
所述PAX1引物包括40～60μmol/L PAX1-上游引物(SEQ ID NO.13)、40～60μmol/LPAX1-下游引物(SEQ ID NO.14)；所述PAX1-CY5荧光探针为40～60μmol/L PAX1-CY5荧光探针(SEQ ID NO.15)；
所述SST引物包括40～60μmol/L SST-上游引物(SEQ ID NO.16)、40～60μmol/L SST-下游引物(SEQ ID NO.17)；所述SST-Texas Red荧光探针为40～60μmol/L SST-Texas Red荧光探针(SEQ ID NO.18)；
所述ACTB引物包括40～60μmol/L ACTB-上游引物(SEQ ID NO.19)、40～60μmol/LACTB-下游引物(SEQ ID NO.20)；所述ACTB-VIC荧光探针为40～60μmol/L ACTB-VIC荧光探针(SEQ ID NO.21)。
7.根据权利要求2所述的宫颈癌相关基因DNA甲基化PCR-荧光探针法检测试剂盒，其特征在于，所述甲基化反应液A、甲基化反应液B、甲基化PCR Master MIX的体积比为1：1：(1.5～4)。
8.一种根据权利要求1～7任一项所述的宫颈癌相关基因DNA甲基化PCR-荧光探针法检测试剂盒的使用方法，其特征在于，抽提DNA，甲基化检测前样本处理，荧光PCR检测：荧光PCR试剂准备、扩增条件设定、检测通道设定、参比荧光设定，检测，M值计算和判断阴阳性，结果判定。
9.根据权利要求8所述的宫颈癌相关基因DNA甲基化PCR-荧光探针法检测试剂盒的使用方法，其特征在于，综合6基因包括FAM19A4、PHACTR3、SST、ZIC1、PAX1、ZNF671的ΔCT值，通过试剂盒配套计算软件计算出M值。
10.根据权利要求8所述的宫颈癌相关基因DNA甲基化PCR-荧光探针法检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述判断阴阳性的cut-off值为0.4～0.6之间。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117757991A (zh) * | 2023-12-27 | 2024-03-26 | 海宁奥羚医学检验实验室有限公司 | 一种HPV16/18病毒基因在宫颈脱落细胞中DNA和mRNA的POCT检测方法 |
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2023
- 2023-04-19 CN CN202310423914.8A patent/CN117089614A/zh active Pending
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|---|---|---|---|---|
| CN117757991A (zh) * | 2023-12-27 | 2024-03-26 | 海宁奥羚医学检验实验室有限公司 | 一种HPV16/18病毒基因在宫颈脱落细胞中DNA和mRNA的POCT检测方法 |
| CN117757991B (zh) * | 2023-12-27 | 2024-05-28 | 海宁奥羚医学检验实验室有限公司 | 一种HPV16/18病毒基因在宫颈脱落细胞中DNA和mRNA的POCT检测方法 |
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