CN105177164A - 一种用于宫颈癌早期筛查的分子标记和检测引物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于宫颈癌早期筛查的分子标记和检测引物，所述的分子标记为分子标记JAM3-M4，其核苷酸序列如:SEQ？ID？No.1，扩增在序列的引物序列如下示：JAM3-M4的正向引物序列如SEQ？ID？No.6所示，反向引物序列如SEQ？ID？No.7所示。本发明首次发现JAM3基因的M4位点的甲基化程度与宫颈病变有关，可作为宫颈癌早期筛查的分子标记。本发明的用于检宫颈癌早期筛查的分子标记的引物及试剂盒。

Description

一种用于宫颈癌早期筛查的分子标记和检测引物

技术领域

本发明涉及一种用于宫颈癌早期筛查的分子标记和检测引物，属于分子生物学和医学领域。

背景技术

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，全球每年新发病例约为528,000例，死亡病例约有266,000例，其中约85％发生在发展中国家。中国的发病率居高不下，为7.5/100,000，死亡率为3.4/100,000。在一些缺乏合理筛查的落后地区，发病率甚至高达81/100,000。初步估计，至2030年，每年死于宫颈癌的患者约有474,000例，其中超过95％可能发生于落后及发展中国家。因此，寻找宫颈癌早期筛查的分子标记，筛查出宫颈癌前病变以及肿瘤患者，实施有效的早诊、早治具有重要意义。

目前，我国采用的是以宫颈液基细胞学为主要内容的宫颈癌筛查策略，同时局部采用HPV-DNA+细胞学联合筛查。我国尚未建立完善的国家筛查体系，而且由于筛查的不平衡性(地域经济、医疗资源、公众认知等影响因素)，导致目前筛查缺乏与筛查过度并存、不规范治疗与过度治疗并存。宫颈液基细胞学存在1、单一应用敏感性不高(约为50％-85％)；2、ASCUS及LSIL的特异性不高；3、取材、制片、阅片水平的参差不齐，缺乏规范化的质量控制等缺陷。因此单一依赖细胞学检查容易造成假阴性，漏检率高。HPV-DNA检测能够显著提高灵敏度，但往往可能检出一过性HPV感染，而不是具有致病性高危型HPV持续感染。因此单一依靠HPV筛查，会造成过度诊断和过度治疗。

DNA甲基化是一个重要的表观遗传学机制。DNA甲基化，即未甲基化胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(Cytosine-phosphate-Guanosine,CpG)二核苷酸发生甲基化，是肿瘤抑制基因失活的关键机制之一。肿瘤抑制基因(TumorSuppressorGenes，TSG)发生丢失、突变、甲基化等变化导致正常功能丧失时，细胞的增殖失控形成恶性肿瘤。现已明确DNA甲基化是TSG失活的三种机制之一，且在某些情况下可能是唯一的机制。因而DNA甲基化在癌症发生发展中发挥重要作用。作为癌症发生的早期事件，DNA异常甲基化检测可以在患者出现临床表现或者影像学证据之前做到分子诊断，为癌症早期诊断提供新的途径。

国内外研究者利用肿瘤抑制基因甲基化检测，已经在宫颈癌早期筛查的研究中取得了令人振奋的进步，但是同一基因在不同研究之间存在较大差异，分析其原因可能为：1、基因甲基化位点的特异性；2、基因遗传背景的差异性；3、操作方法和实验试剂的异质性。因此，本领域急需进一步发现更有效更稳定更易应用于临床的宫颈癌特异性的甲基化早期筛查的生物标记物。

发明内容

针对上述研究进展和现有技术，本申请的发明人经过检索和查阅大量文献以及对TheCancerGenomeAtlas(TCGA)平台的数据分析，优选出数个候选基因的多个位点，其中多个为从未报道过的位点。通过测定、验证和分析，首次发现JAM3基因的M4位点随宫颈病变程度的加重甲基化的程度逐渐升高，可作为宫颈癌早期筛查的分子标记，因此，本发明提供了一种用于宫颈癌早期筛查的分子标记和检测引物。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于宫颈癌早期筛查的分子标记，JAM3-M4，CADM1-M2，CADM1-M8，DAPK1-M2或DAPK1-M3，核苷酸序列分别为：

JAM3-M4:CGCAGCCAGGGCTGGGACTCGGGCCTGGCTAGGGCGGGGGCCCTGGGACGCCCGGCAGTTGGACCGGGGCGGGGAGCTAATTTGGGATGGGGGGCCCGTCCCAGGCAGTGAGTCGGTCCCGGACAGCCGTCGGACCCC(SEQIDNO:1)，

CADM1-M2:GTCCTCCGCCACTTGTTGCTCCCGGGTCCTGCAGCTCTGGAGCTGCAAGGAGGGGCTTTGCAGGCTCAGAGCCCTGCTGCATCCCCTCCTGCATCGCCGCTCGCACCCCGCGGCCCC(SEQIDNO:2)，

CADM1-M8:GCCGCCGCACACTGGGATCCGCTCGGCAGCACTACACTCGCCATGTCGGGCACCTGCCTCAGACTGGCGGCGTTGGCTGCCTCCGGAGCCCGAGCGGACAGCTAATGAGA(SEQIDNO:3)，

DAPK1-M2:CGCTTGCAGGGTCCCCATTGGCCGCCTGCCGGCCGCCCTCCGCCCAAAAGGCGGCAAGGAGCCGAGAGGCTGCTTCGGAGTGTGAGGAGGACAGCCGGACCGAGCCAACGCCGGGGACTTTGTTCCCTCCGCGGAGGGGACTCGGCAACTCGCAGCGGCAG

(SEQIDNO:4)，

DAPK1-M3:GTCCCCATTGGCCGCCTGCCGGCCGCCCTCCGCCCAAAAGGCGGCAAGGAGCCGAGAGGCTGCTTCGGAGTGTGAGGAGGACAGCCGGACCGAGCCAACGCC(SEQIDNO:5)。

这些序列多位于CpG岛。CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，而在基因组的某些区段，CpG保持或高于正常概率，这些区段被称作CpG岛，在哺乳动物基因组中的1～2kb的DNA片段，它富含非甲基化的CpG双倍体。CpG岛主要位于基因的启动子和第一外显子区域，约有60％以上基因的启动子含有CpG岛。GC含量大于50％，长度超过200bp。

CpG岛常位于转录调控区附近，密切参与基因表达的调控和影响染色质的结构。

一种检测上述的用于宫颈癌早期筛查的分子标记的引物，所述引物序列分别如下示：

JAM3-M4的引物：MF:CGTAGTTAGGGTTGGGATTC(SEQIDNO:6)

MR:GAAATCCGACGACTATCCGA(SEQIDNO:7)，

CADM1-M2的引物：MF:GTTTTTCGTTATTTGTTGTTTTC(SEQIDNO:8)

MR:GAAACCGCGAAATACGAACG(SEQIDNO:9)，

CADM1-M8的引物：MF:GTCGTCGTATATTGGGATTC(SEQIDNO:10)

MR:TCTCATTAACTATCCGCTCG(SEQIDNO:11)，

DAPK1-M2的引物：MF:CGTTTGTAGGGTTTTTATTGGTC(SEQIDNO:12)

MR:CTACCGCTACGAATTACCGA(SEQIDNO:13)，

DAPK1-M3的引物：MF:GTTTTTATTGGTCGTTTGTC(SEQIDNO:14)

MR:GACGTTAACTCGATCCGACT(SEQIDNO:15)。

上述的引物在制备用于宫颈癌早期筛查的试剂盒或检测传感器中的应用。

一种非诊断目的体外检测样品JAM3-M4，CADM1-M2，CADM1-M8，DAPK1-M2或DAPK1-M3甲基化程度的方法，步骤如下：

(1)提取待测样品的DNA并进行甲基化修饰；

(2)实时定量甲基化特异性PCR扩增，β-actin：MF:TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT，MR:AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA；

(3)利用公式：2^{[Ct(β-actin)-Ct(target)]}×10,000计算样品基因的甲基化程度。

所述PCR反应条件：

检测上述基因的甲基化程度除了可以达到宫颈癌早期筛查的目的，还可以为研究以上基因的生物学功能和意义提供一定的帮助。DNA甲基化是肿瘤抑癌基因失活的重要机制，通过检测上述基因的甲基化程度后，可后续研究相应基因的表达，调控生物学行为的具体机制。另外，目前去甲基化治疗，恢复抑癌基因的活性也成为临床肿瘤治疗的新靶点。

DNA甲基化及甲基化特异性PCR(MethylationspecificPCR，MSP)的原理：在正常人基因组中，CpG岛外的CpG位点通常是甲基化的，而CpG岛中的CpG位点通常处于非甲基化状态，这种甲基化的形式在随细胞分裂稳定的遗传。当肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG位点非甲基化程度增加,而CpG岛中的CpG位点呈高甲基化状态，导致染色体螺旋程度增加，转录抑制，基因表达缺失。甲基化特异性PCRPCR(MethylationspecificPCR，MSP)是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一，能发现最低约50pgDNA的甲基化，其基本原理为:单链DNA经过亚硫酸氢盐修饰后，所有未甲基化的胞嘧啶(cytosine，C)脱氨转变为尿嘧啶(uracil，U)，而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变，因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物，通过PCR扩增即可将甲基化(Methylation，M)与非甲基化(Unmethylation，U)DNA序列区分开来。

本发明的有益效果：

本申请的发明人经过检索和查阅大量文献以及对TheCancerGenomeAtlas(TCGA)平台的数据分析，优选出数个候选基因的多个位点，其中有多个为从未报道过的位点。通过测定、验证和分析，首次发现JAM3基因的M4位点的甲基化程度与宫颈病变有关，可作为宫颈癌早期筛查的分子标记。

本发明用于宫颈癌早期筛查的分子标记的的引物及试剂盒，检测灵敏性、特异性、阳性预测值及阴性预测值经临床组织样本的初步以及大量的宫颈脱落细胞学的进一步验证，达到临床诊断的要求。

JAM3-M4对于分流高危型HPV阳性的患者以及细胞学筛查结果为ASCUS(特别是小于30岁的患者)及LSIL患者临床效能高，在分流临床上尚存争议的CIN2方面也有一定的提示意义。

本发明用于宫颈癌早期筛查的分子标记的的引物专一性强，采用本发明的引物进行扩增时，扩增条件易于摸索，方便进行特异性扩增，优于其他引物。

附图说明

图1为甲基化特异性PCR(MSP)初步检测4个基因的27个位点在宫颈癌组织和正常对照宫颈组织中甲基化差异性表达水平；

图2为-CADM1-M2、CADM1-M8、DAPK1-M2、DAPK1-M3及JAM3-M4在早期诊断和筛查中的应用价值；

图3为JAM3-M4在宫颈无瘤变-癌前病变-癌患者脱落细胞的甲基化水平；

图4为ROC曲线分析JAM3-M4甲基化的临床诊断效能；

图5为CIN2病例的免疫组化染色及焦磷酸测序。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。

1、宫颈脱落细胞的DNA提取：

取患者的宫颈脱落细胞，采用QlAampDNAMiniKit(QiagenGmbH,Germany)试剂盒提取，最终所得DNA溶液80μL；

2、血清游离DNA甲基化修饰：

取1μg提取的脱落细胞DNA，采用QIAampEpiTectBisμLfiteKits(QiagenGmbH,Germany)试剂盒修饰，最终所得修饰后DNA溶液30μL；

3、实时定量甲基化特异性PCR(QMSP)反应体系的构建与优化：

1).实时引物序列：

JAM3-M4的引物：MF:CGTAGTTAGGGTTGGGATTC(SEQIDNO:6)

MR:GAAATCCGACGACTATCCGA(SEQIDNO:7)，

β-actin的引物：MF:TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT(SEQIDNO:16)

MR:AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA(SEQIDNO:17)。

2).实时PCR反应体系的优化：

实时PCR反应套装来自1×PowerGreenPCRMasterMix(ABI,USA)

实时PCR反应体系：

模板：1μL------修饰后DNA；

引物：1μL-------终浓度为50nM；

MIX：10μL

ddH₂O：8μL

对本发明的检测方法的检测灵敏性、特异性、阳性预测值和阴性预测值及临床标本检测应用的验证和评估

1、所使用的试剂盒为：

(1)宫颈组织及脱落细胞的DNA提取：QlAampDNAMiniKit(QiagenGmbH,Germany)试剂盒；

(2)DNA甲基化修饰：QIAampEpiTectBisμLfiteKitsQiagenGmbH,Germany)试剂盒；

(3)甲基化及非甲基化DNA标准品：EpiTectPCRControlDNASet(QIAGEN,59695)；

(4)实时PCR反应套装：1×PowerGreenPCRMasterMix(ABI,USA)；

(5)PCR反应套装：AmpliTaq360MasterMix(ABI，USA)；

2、实时PCR条件：

实时PCR反应条件：

3、实时PCR结果判断

(1)JAM3-M4甲基化程度的计算公式为2^{[Ct(β-actin)-Ct(target)]}×10,000；

(2)内参β-actin的CT值大于32，认为样本不符合质控，样本不合格；

(3)监测SYBRGreenPCR体系的溶解曲线，如果实验样本的溶解温度与标准品的溶解温度偏差±2℃，则该样本视为无效，需重新检测。

一、甲基化特异性PCR(MSP)初步检测4个基因的27个位点在宫颈癌组织和正常对照宫颈组织中甲基化差异性表达水平

取2μg临床组织样本DNA进行甲基化修饰得到反应模板；由图1可以看出，在代表性的癌和正常宫颈组织中，癌可见明显阳性条带，正常未见明显条带。标准品：M标准品和U标准品以及未修饰模板验证了引物的特异性。表1基于两组别的P值列出了差异最明显的5个位点的阳性例数及统计学P值。说明：经过初步筛选，选出了5对差异最明显的MSP引物进一步进行实时PCR的研究。

表1

引物序列如下示：

JAM3-M4的引物：MF:CGTAGTTAGGGTTGGGATTC(SEQIDNO:6)

MR:GAAATCCGACGACTATCCGA(SEQIDNO:7)，

JAM3-U4的引物：UF:TGTAGTTAGGGTTGGGATTT(SEQIDNO:18)UR:CAAAATCCAACAACTATCCA(SEQIDNO:19)，

CADM1-M2的引物：MF:GTTTTTCGTTATTTGTTGTTTTC(SEQIDNO:8)

MR:GAAACCGCGAAATACGAACG(SEQIDNO:9)，

CADM1-U2的引物：UF:GTTTTTTGTTATTTGTTGTTTTTG(SEQIDNO:20)

UR:AAAACCACAAAATACAAACA(SEQIDNO:21)，

CADM1-M8的引物：MF:GTCGTCGTATATTGGGATTC(SEQIDNO:10)

MR:TCTCATTAACTATCCGCTCG(SEQIDNO:11)，

CADM1-U8的引物：UF:GTTGTTGTATATTGGGATTT(SEQIDNO:22)

UR:TCTCATTAACTATCCACTCA(SEQIDNO:23)，

DAPK1-M2的引物：MF:CGTTTGTAGGGTTTTTATTGGTC(SEQIDNO:12)

MR:CTACCGCTACGAATTACCGA(SEQIDNO:13)，

DAPK1-U2的引物：UF:TGTTTGTAGGGTTTTTATTGGTTG(SEQIDNO:24)

UR:CCTACCACTACAAATTACCA(SEQIDNO:25)，

DAPK1-M3的引物：MF:GTTTTTATTGGTCGTTTGTC(SEQIDNO:14)

MR:GACGTTAACTCGATCCGACT(SEQIDNO:15)，

DAPK1-U3的引物：UF:TTTTATTGGTTGTTTGTTGG(SEQIDNO:26)

UR:CCCAACATTAACTCAATCCA(SEQIDNO:27)。

二、在宫颈无瘤变-癌前病变-癌患者中的验证

1)5个初步筛选出位点的验证-QMSP

在齐鲁医院妇产科门诊阴道镜室收集了宫颈无瘤变-癌前病变-癌患者的脱落细胞，其中包括慢性宫颈炎53例，CIN159例，CIN271例，CIN363例及宫颈鳞癌20例。从以上所述的样品中提取DNA后，对其进行亚硫酸氢盐修饰作为QMSP的模板。MSP筛选出了癌与正常组织中甲基化频率差异度最大的5个位点--CADM1-M2、CADM1-M8、DAPK1-M2、DAPK1-M3及JAM3-M4，通过QMSP进一步验证其在早期诊断和筛查中的应用价值。随病变程度加重，基因位点的甲基化程度逐渐升高，以JAM3-M4尤为明显，在诊断分组间的差异明显，如图2所示。

2)焦磷酸测序验证JAM3-M4在宫颈无瘤变-癌前病变-癌患者脱落细胞的甲基化水平

从实时PCR的样本各个分组中随机选出NILM(n＝8)，CIN1(n＝10)，CIN2QMSP阴性(QM-)(n＝9)，CIN2QMSP阳性(QM+)(n＝8)，CIN3(n＝10)，cancer(n＝9)样本进行焦磷酸测序，对JAM3-M4位点的甲基化水平更进一步地量化和验证(图3A和B)。为了跟之前的实时PCR的结果分析一致，跟临床需要阴道镜处理的组织学诊断相符，CIN1-，CIN2，CIN3+分类的焦磷酸测序统计学分析如图3C。

三、JAM3-M4在临床中的应用分析

1)JAM3-M4单独应用于临床早期筛查

目前在临床上广泛用于早期筛查的检验方法是细胞学和HPV,将JAM3-M4的检验效能(敏感性、特异性、阳性预测值及阴性预测值)与这两者比较，如表2，提示与HPV和细胞学相比，尽管敏感性和阴性预测值有轻微下降，但是特异性和阳性预测值有显著提高，在以CIN3为界值时表现尤为明显。

表2

2)与细胞学结合的应用—联合筛查和分流筛查

①联合筛查即在早期筛查时，同时应用细胞学和甲基化检测，其检验效能及与目前常用的细胞学与HPV联合筛查的对比如表3所示，尽管敏感性和阴性预测值有轻微下降，但是特异性和阳性预测值有显著提高，在以CIN3为界值时表现尤为明显。

表3

②分流筛查即在早期筛查时，首先应用细胞学检查，然后对细胞学诊断异常的患者，进行甲基化检测，对其进行分流，决定是否进行阴道镜检并处理，JAM3-M4的分流效能及与常用的HPV分流的对比如表4所示；鉴于细胞学诊断为HSIL的特异性较高，分流的意义不大，故将JAM3-M4分流细胞学诊断为LSIL和ASCUS的患者进行单独分析，如表5所示，对于分流细胞学诊断为LSIL的效能分析，特异性和阳性预测值显著升高，而敏感性和阴性预测值未有影响；对于分流细胞学诊断为ASCUS的效能分析，特异性和阳性预测值显著提高，敏感性和阴性预测值有一定程度下降。但是对于年龄小于30岁(HPV高感染率的年龄段)的细胞学诊断为ASCUS患者，7例均为HPV阳性，5例为CIN1-，JAM3-M4均为阴性，提示分流意义更大。

表4

表5

3)与HPV结合的应用—联合筛查和分流筛查

①联合筛查即在早期筛查时，同时应用HPV和甲基化检测，其检验效能及与目前常用的细胞学与HPV联合筛查的对比如表6所示，尽管敏感性有轻微下降，但是特异性、阳性预测值显著提高，阴性预测值在CIN3+/CIN1-和CIN3+/CIN2-诊断学分组轻度升高，在CIN2+/CN1-略微下降。

表6

②分流筛查即在早期筛查时，首先应用HPV检查，然后对HPV阳性的患者，进行甲基化检测，对其进行分流，决定是否进行阴道镜检并处理，JAM3-M4的分流效能及与常用的细胞学分流的对比如表7所示；特异性和阳性预测值显著升高，敏感性轻微下降，阴性预测值略有上升。

表7

4)ROC曲线分析JAM3-M4甲基化的临床诊断效能

ROC曲线是临床检验常用的一种统计方法，能够比较不同诊断试验对疾病识别能力。针对不同的人群——图4(A)所有收集的病例、(B)细胞学诊断异常的病例、(C)细胞学诊断为ASCUS的病例、(D)细胞学诊断为LSIL的病例、(E)HPV阳性的病例，通过ROC曲线(曲线下面积为衡量指标)分析研究了JAM3-4甲基化的临床诊断效能；曲线下面积提示对临床上的分流均较有意义。

5)分流CIN2的指示意义

鉴于以上分析，以CIN3为界值的临床诊断效能均高于CIN2+/CIN1-。荟萃文献分析，CIN病变可以分为复制型(CIN1和CIN2)及转化型(CIN2和CIN3)病变。复制型和转化型的CIN2通过形态学观察无法区分，2014版WHO的指南提出用组织学切片进行免疫组化P16的染色，根据阳性阴性将CIN分流为HSIL和LSIL，代表性的CIN2病例的免疫组化染色及焦磷酸测序如图5示。所有的CIN2病例中，P16的阳性率为69.78％,而JAM3-M4的阳性率为48.84％.两者的相符率为60.47％(p＝0.119)，虽然统计学意义不显著，但是还是存在一定分流指示意义。

Claims (5)

1.一种用于宫颈癌早期筛查的分子标记，其特征是：所述分子标记为JAM3-M4，其核苷酸序列如:SEQIDNo.1所示。

2.一种检测权利要求1所述的用于宫颈癌早期筛查的分子标记的引物，所述引物序列如下：JAM3-M4的正向引物序列如SEQIDNo.6所示，反向引物序列如SEQIDNo.7所示。

3.权利要求2所述的引物在制备用于宫颈癌早期筛查的试剂盒或检测传感器中的应用。

4.一种非诊断目的体外检测样品JAM3-M4甲基化程度的方法，其特征是：步骤如下：

(1)提取待测样品的DNA并进行甲基化修饰；

(2)实时定量甲基化特异性PCR扩增，β-actin的正向引物序列如SEQIDNo.16所示，反向引物序列如SEQIDNo.17所示；

(3)利用公式：2^{[Ct(β-actin)-Ct(target)]}×10,000计算样品基因的甲基化程度。

5.权利要求4所述的方法，其特征是：所述PCR反应条件：