CN112375825B - 一种宫颈癌诊断、预后判断试剂盒 - Google Patents

一种宫颈癌诊断、预后判断试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明具体涉及一种宫颈癌诊断、预后判断试剂盒。宫颈癌目前仍是女性健康的一大威胁，现阶段，宫颈癌筛查方式是宫颈液基细胞学检查联合HPV病毒检测，但细胞学检测结果受人为主观影响较大，检测结果准确性不足。因此，提供更为准确的宫颈癌早期诊断技术具有重要的意义。基于上述现状，本发明通过筛查工作确认了MSC甲基化程度与宫颈癌发展状况呈正相关，基于该发现，本发明提供了一种用于宫颈癌早期筛查、诊断及预后情况判断的试剂盒，通过QMSP方式进行检测，显著提高了检测的灵敏度及特异性。

Description

一种宫颈癌诊断、预后判断试剂盒
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于宫颈癌早期筛查、诊断及预后情况判断的试剂盒。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
宫颈癌是女性第四大常见癌症，也是癌症导致女性死亡的第四大病因。根据国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer)发布的最新全球数据，2018年全球共有569847例宫颈癌新发病例，311365人死于宫颈癌。虽然HPV疫苗接种和早期宫颈癌筛查已成为预防该病的有效策略，但在中低收入国家中依然存在着该病较高的发病率和死亡率。尽管中国宫颈癌患者的生存率有了明显的提高，但相比于其他发达国家仍存在着一定的差距。
高危型人乳头瘤病毒HPV的持续感染，被认为是宫颈癌发生发展的主要原因。目前，临床上应用的宫颈癌筛查的主要方法是宫颈液基细胞学检查联合HPV病毒检测，但细胞学检测受到人为影响较大，漏诊几率较高，HPV检测特异性较低，存在过度治疗的局限性。近年来，随着对表观遗传学的研究，尤其是DNA甲基化检测技术的成熟，作为癌症发生的早期阶段，DNA甲基化检测逐步成为宫颈癌前病变检测的新兴诊断方法。大量甲基化基因如SOX1、PAX1、JAM3、EPB41L3、CADM1、MAL等也被认为是宫颈癌筛查的生物标志物。为了进一步提高宫颈癌的筛查效能，探索和开发更灵敏有效、更稳定便捷、更易应用于临床的分子标记物具有重要意义。
发明内容
针对上述研究进展和现有技术，发明人经过检索和查阅大量文献以及利用全基因组甲基化芯片对850k个甲基化位点进行筛选，并结合焦磷酸盐测序，最终筛选出一批在宫颈鳞癌中特异性高甲基化的基因。通过检测、验证和分析，本发明首次发现MSC基因随宫颈病变程度的加重，其DNA的甲基化程度逐渐升高，并且与宫颈癌分期密切相关，可以作为宫颈癌早期筛查的分子标记物。
基于上述研究成果，本发明提供以下技术方案：
本发明首先提供MSC基因作为宫颈癌诊断、预后和/或治疗标志物的应用。
所述MSC基因其核苷酸序列如下：
GCGGATTCTGGACTTGGGCGCCAACTCGTAGTCCACGCTCCCCGGGGTCAGCAGAGGGGCGCTCACGCTCTCGCCACCCACCTCGCTTTCTCACCCCGCGCTTCCCGGCCTGGGTTTTTAGTCTTCCTTGGAGCGCTCTCTGGCCTCCGCCTCCGCCAGGGAGCGGAAGGCGGAGACAGCGAGACTGGCCAGGGGGGAGGAAAGAGGACGCGTGTGGGCAAGGGGGACAACGGG(SEQ ID NO:1)。
依据本发明的研究结果，这些序列多位于CpG岛，基因组中绝大多数CpG岛位于启动子区、外显子区和第一内含子区。在肿瘤的发生过程中，启动子CpG岛胞嘧啶的异常高甲基化和整体基因的低甲基化导致整个基因的不稳定性和基因表达谱的改变，包括抑癌基因的失活、转录因子无法与DNA结合抑制转录等。依据本发明研究结论，MSC基因的甲基化程度与肿瘤发展情况呈正相关，特别是在宫颈癌中，MSC基因的甲基化率在宫颈癌不同发展时期具有显著的差异。
进一步的，以MSC基因甲基化程度作为检测目标，结合实时PCR检测方法的高灵敏性及特异性，可以有效的提高检测精度，提供更为可靠的早期筛查建议。
因此，本发明首先提供一种非诊断目的检测MSC甲基化程度的方法，所述方法包括以下步骤：获取待测样本中DNA并进行甲基化修饰，通过实时定量甲基化特异性PCR检测待测样本中MSC甲基化程度。
其次，本发明提供一种宫颈癌诊断试剂盒，所述试剂盒中包括SEQ IDNO:3-6所示序列的核苷酸物质。另外，上述试剂盒在宫颈癌早期筛查及预后判断等领域的应用方式也在本发明请求保护的范围之内。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
1、现有技术中还未见关于MSC基因甲基化检测的相关报告，本发明首次提供了关于MSC基因存在甲基化的报道并证实了其与肿瘤发展情况相关。
2、本发明提供了宫颈癌早期筛查的分子标记的引物及试剂盒，检测灵敏性、特异性、阳性预测值及阴性预测值经临床组织样本的初步以及大量的宫颈脱落细胞学的进一步验证，达到临床诊断的要求。
3、本发明用于宫颈癌早期筛查的分子标记的的引物专一性强，采用本发明的引物进行扩增时，扩增条件易于摸索，方便进行特异性扩增，优于其他引物。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中所述甲基化芯片中典型组织病理切片HE染色结果；
其中，(A,D)CIN3组织；(B,E)宫颈鳞癌组织；(C,F)正常宫颈上皮组织；A,B,C放大倍数为100倍；D,E,F放大倍数为200倍。
图2为实施例1中所述QMSP验证MSC甲基化水平；
其中，检测石蜡样本正常组织、CIN、CA组织中MSC启动子区甲基化水平，***P＜0.001。
图3为实施例1中所述焦磷酸测序中N、CIN、CA组织中各位点MSC甲基化率；
N、CIN、CA分别选取10例组织中的典型代表。
图4为实施例1中所述正常、宫颈上皮内瘤变、癌组织在7个位点中MSC的相对甲基化率直方图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，宫颈癌是威胁女性健康的重要因素，优化宫颈癌的早期诊断技术对于降低宫颈癌死亡率具有重要意义，现有宫颈癌的早期筛查手段为针对HPV病毒的细胞学检测，该检测方式存在较大的人为误差。为了提供了一种更为准确的早期筛查手段，本发明提供了一种用于宫颈癌诊断、预后判断的试剂盒，以MSC甲基化程度为检测目标，通过实时PCR方法进行检测，具有良好的检测灵敏度和精度。
本发明第一方面，提供一种非诊断目的检测MSC甲基化程度的方法，所述方法包括以下步骤：获取待测样本中DNA并进行甲基化修饰，通过实时定量甲基化特异性PCR检测待测样本中MSC甲基化程度。
优选的，所述检测方法具体步骤如下：提取待测样品的DNA并进行甲基化修饰，通过实时定量甲基化特异性PCR反应对MSC甲基化程度进行检测，所述检测过程采用β-actin作为内参。
进一步的，所述检测过程中所述的引物及序列如下：
MSC的引物：
MF:GATTGGTTAGGGGGGAGGAAA(SEQ ID NO:2)
MR:ACAACCCCCCAAACTCCATCT(SEQ ID NO:3)；
β-actin的引物：
MF:TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT(SEQ ID NO:4)；
MR:AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA(SEQ ID NO:5)。
在上述优选技术方案的一种具体的实施方式中，所述方法步骤如下：
(1)提取待测样品的DNA并进行甲基化修饰；
(2)实时定量甲基化特异性PCR扩增，β-actin：
(3)利用公式：2[Ct(β-actin)-Ct(target)]×10,000计算样品基因的甲基化程度。
(4)所述PCR反应条件：
Figure BDA0002778073600000041
本发明第二方面，提供一种宫颈癌诊断试剂盒，所述试剂盒中包括SEQ ID NO:3-6所示序列的核苷酸物质。
优选的，所述试剂盒中，还包括DNA提取试剂，DNA甲基化试剂及PCR反应体系。
优选的，所述试剂盒中，还包括甲基化及非甲基化DNA标准品。
在上述优选技术方案的一种具体实施方式中，所述待测样本DNA的提取方式如下，制备待测样品的石蜡包埋样本，脱蜡后抽提所述样本的DNA；所述抽提试剂来源于QIAampDNA FFPE Tissue(Qiagen,Germany)试剂盒。
在上述优选技术方案的一种具体实施方式中，所述DNA甲基化试剂来源于EZ DNAMethylation-GoldTM(Zymo Research，USA)试剂盒。
在上述优选技术方案的一种具体实施方式中，所述甲基化及非甲基化DNA标准品来源于EpiTect PCR Control DNA Set(Qiagen,Germany)。
在上述优选技术方案的一种具体实施方式中，所述PCR反应体系来源于PowerSYBR Green PCR Master Mix(ABI,USA)试剂盒。
本发明第三方面，提供第二方面所述宫颈癌诊断试剂盒在宫颈癌早期筛查领域的应用。
本发明第四方面，提供第二方面所述宫颈癌诊断试剂盒在宫颈癌预后情况判断领域的应用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
一、全基因组甲基化芯片筛选得到的MSC相关信息
收集正常宫颈组织、CIN3组织和宫颈癌组织各10例，确保切片中上皮细胞(正常宫颈)或瘤变细胞(CIN3或宫颈癌)含量＞30％(图1)，利用Illumina Infinium MethylationEPIC Bead Chip全基因组甲基化芯片对850k个甲基化位点进行筛选，根据Comprehensiveanalysis of DNA methylation data with RnBeads(Nat Methods.2014)报道的方法，进行差异DNA甲基化位点筛选。
二、在宫颈正常上皮-癌前病变-癌患者中的验证
1、QMSP验证
在齐鲁医院妇产科收集了正常宫颈-癌前病变-癌患者的石蜡标本，其中包括正常宫颈组织36例，CIN 36例及宫颈鳞癌85例。从以上所述的样品中提取DNA后，对其进行亚硫酸氢盐修饰作为QMSP的模板。通过QMSP进一步验证其在早期诊断和筛查中的应用价值。随病变程度加重，MSC的甲基化程度逐渐升高，在诊断分组间的差异明显，如图2所示。
1、石蜡组织标本的DNA提取
取患者石蜡包埋组织标本，二甲苯酒精脱蜡后采用QIAamp DNA FFPE Tissue(Qiagen,Germany)试剂盒提取DNA，最终获得DNA溶液100μL。
2、DNA甲基化修饰
取2μg DNA溶液，采用EZ DNA Methylation-GoldTM(Zymo Research，USA)试剂盒修饰，最终所得亚硫酸盐修饰后DNA溶液30μL。
3、实时定量甲基化特异性PCR(QMSP)反应体系的构建与优化：
1).实时引物序列：
MSC的引物：
MF:GATTGGTTAGGGGGGAGGAAA
MR:ACAACCCCCCAAACTCCATCT
β-actin的引物：
MF:TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT
MR:AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA
2).实时PCR反应体系的优化：
实时PCR反应套装来自Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI,USA)试剂盒
表1 实时PCR反应体系
Figure BDA0002778073600000061
对本发明的检测方法的检测灵敏性、特异性、阳性预测值和阴性预测值及临床标本检测应用的验证和评估。
2、焦磷酸测序验证
MSC在正常宫颈、癌前病变和癌患者的亚硫酸盐修饰后的DNA标本中随机选出N(n＝10)，CIN(n＝10)，CA(n＝10)样本进行焦磷酸测序，对MSC的甲基化水平更进一步地量化和验证(图3和图4)。
实施例2一种宫颈癌诊断试剂盒
1、所使用的试剂盒为:
(1)石蜡组织标本的DNA提取：QIAamp DNA FFPE Tissue(Qiagen,Germany)试剂盒
(2)DNA甲基化修饰：EZ DNA Methylation-GoldTM(Zymo Research，USA)试剂盒
(3)甲基化及非甲基化DNA标准品:EpiTect PCR Control DNA Set(Qiagen,Germany)
(4)实时PCR反应套装：Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI,USA)试剂盒
(5)PCR反应套装：AmpliTag Gold 360 Master Mix(ABI,USA)试剂盒
2、实时PCR条件：
实时PCR反应条件：
Figure BDA0002778073600000071
实时PCR结果判断：
MSC甲基化程度的计算公式为2[Ct(β-actin)-Ct(target)]×10,000；
内参β-actin的CT值大于32，认为样本不符合质控，样本不合格；
监测SYBR Green PCR体系的溶解曲线，如果实验样本的溶解温度与标准品的溶解温度偏差±2℃，则该样本视为无效，需重新检测。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学齐鲁医院
<120> 一种宫颈癌诊断、预后判断试剂盒
<130> 2010
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 234
<212> DNA
<213> MSC核苷酸序列
<400> 1
gcggattctg gacttgggcg ccaactcgta gtccacgctc cccggggtca gcagaggggc 60
gctcacgctc tcgccaccca cctcgctttc tcaccccgcg cttcccggcc tgggttttta 120
gtcttccttg gagcgctctc tggcctccgc ctccgccagg gagcggaagg cggagacagc 180
gagactggcc aggggggagg aaagaggacg cgtgtgggca agggggacaa cggg 234
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gattggttag gggggaggaa a 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acaacccccc aaactccatc t 21
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tggtgatgga ggaggtttag taagt 25
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaccaataaa acctactcct cccttaa 27

Claims (1)

1.检测MSC甲基化水平的试剂在制备用于诊断宫颈鳞癌的产品中的应用。
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