CN116516005A - 一种用于检测头颈鳞癌的核酸产品、试剂盒及应用 - Google Patents

一种用于检测头颈鳞癌的核酸产品、试剂盒及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116516005A
CN116516005A CN202310332504.2A CN202310332504A CN116516005A CN 116516005 A CN116516005 A CN 116516005A CN 202310332504 A CN202310332504 A CN 202310332504A CN 116516005 A CN116516005 A CN 116516005A
Authority
CN
China
Prior art keywords
chr3
detecting
methylation
seq
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310332504.2A
Other languages
English (en)
Inventor
周谛晗
张良禄
董兰兰
周俊
万慧
阮彥添
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Original Assignee
Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd filed Critical Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Priority to CN202310332504.2A priority Critical patent/CN116516005A/zh
Publication of CN116516005A publication Critical patent/CN116516005A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于生物医学领域，更具体地，涉及一种用于检测头颈鳞癌的核酸产品、试剂盒及应用。本发明提供的检测头颈鳞癌的核酸产品，通过检测样本中TRH基因上的靶区域的甲基化水平，能够有效区分头颈鳞癌患者和非癌患者，可用于检测不同类型的头颈鳞癌，包括喉癌、口腔癌和鼻咽癌。本发明提供的试剂盒通过检测样本中TRH基因上的任一靶区域的甲基化水平，对头颈鳞癌组织样本和血浆样本均具有较高的检测灵敏度和特异性。

Description

一种用于检测头颈鳞癌的核酸产品、试剂盒及应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，更具体地，涉及一种用于检测头颈鳞癌的核酸产品、试剂盒及应用。
背景技术
大多数头颈部癌症起源于口腔、咽部和喉部的黏膜上皮细胞，这些头颈部癌症被统称为头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。口腔癌和喉癌通常与吸烟、酗酒有关，而咽癌则越来越多地归因于人乳头瘤病毒(HPV)的感染，尤其是HPV-16。因此，HNSCC通常可以分为HPV阳性或HPV阴性两大类。据统计，在2018年，全球范围内有89万HNSCC新发病例和45万死亡病例，且其发病率持续上升，预计到2030年其发病率将上浮30％(即每年约有108万新发病例)。尽管侵袭性HNSCC的组织学进展是从细胞非典型性增生(atypia)到细胞异型增生(dysplasia)再进展为癌的，但是大多数患者在确诊HNSCC时，疾病已经进入晚期且他们在临床上并没有明显的癌前病变，这给HNSCC患者的早诊早治疗带来了极大的困难。然而，在HNSCC的早期(即肿瘤细胞尚未发生转移时)确诊，可以显著提高患者的预后。因此，目前急需高灵敏度、高特异性的HNSCC的早期诊断方法，以改善患者的生存质量和生命周期。
异常的基因甲基化与癌症有着密切的关系，如抑癌基因启动子区域的高度甲基化会导致抑癌基因转录沉默，进而导致癌症发生和发展。因此，HNSCC中发生甲基化水平改变的基因可能作为其早期诊断的分子标志物，若可以通过液体活检的方法检测肿瘤细胞释放到体液中的表观遗传信息的变化，则可以对高危患者进行无创或微创诊断、从而提高早期HNSCC的检出率，进而提高患者的生存率。
目前临床上尚未有明确的可用于头颈鳞癌诊断的分子标志物，现有技术公开的一些用于诊断头颈鳞癌患者体液样本的分子标志物，其诊断性能仍需要进一步优化。因此，高灵敏度、高特异性的用于头颈鳞癌诊断的分子标志物仍然是急需的。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种用于检测头颈鳞癌的核酸产品、试剂盒及应用，以解决现有技术对于头颈鳞癌诊断的侵入性操作，诊断性能较差，尤其是对头颈鳞癌血浆样本的检测灵敏度和特异性较低，缺乏对喉癌、口腔癌、鼻咽癌等不同类型的头颈鳞癌的检测等问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种用于检测头颈鳞癌的核酸产品，其为用于检测样本中TRH基因CpG岛上的靶区域的甲基化水平的核酸产品；
以GRCh38.p14为参考基因组，所述靶区域包括Chr3:129974443-129974790负链的全长区域或部分区域中的至少一个。
优选地，所述Chr3:129974443-129974790负链的部分区域包括Chr3:129974631-129974785、Chr3:129974657-129974765、Chr3:129974646-129974737、Chr3:129974512-129974676、Chr3:129974540-129974662和Chr3:129974443-129974616。
优选地，所述核酸产品包括用于检测所述靶区域的甲基化水平的引物对，可选地，还包括检测探针。
优选地，所述核酸产品包括用于检测所述Chr3:129974443-129974790负链的全长区域的甲基化水平的甲基化引物对和非甲基化引物对；进一步优选地，所述甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.16～17所示，所述非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.18～19所示。
优选地，所述核酸产品包括用于检测所述Chr3:129974443-129974790负链的部分区域的甲基化水平的引物对和与所述引物对对应的检测探针。
进一步优选地，所述核酸产品包括用于检测Chr3:129974631-129974785负链甲基化水平的如SEQ ID NO.20～21所示的引物对和如SEQ ID NO.22所示的检测探针；和/或，用于检测Chr3:129974657-129974765负链甲基化水平的如SEQ ID NO.23～24所示的引物对和如SEQ ID NO.25所示的检测探针；和/或，用于检测Chr3:129974646-129974737负链甲基化水平的如SEQ ID NO.26～27所示的引物对和如SEQ ID NO.28所示的检测探针；和/或，用于检测Chr3:129974512-129974676负链甲基化水平的如SEQ ID NO.29～30所示的引物对和如SEQ ID NO.31所示的检测探针；和/或，用于检测Chr3:129974540-129974662负链甲基化水平的如SEQ ID NO.32～33所示的引物对和如SEQ ID NO.34所示的检测探针；和/或，用于检测Chr3:129974443-129974616负链甲基化水平的如SEQ ID NO.35～36所示的引物对和如SEQ ID NO.37所示的检测探针。
优选地，所述检测探针5’端含有荧光报告基因，3’端含有荧光淬灭基团。
本发明还提供了一种用于检测头颈鳞癌的试剂盒，其包括所述的核酸产品。
优选地，所述试剂盒还包括PCR反应试剂、甲基化转化试剂、DNA提取试剂、DNA纯化试剂和质控品中的一种或多种。
本发明还提供了所述的核酸产品或所述的试剂盒在制备头颈鳞癌诊断产品中的应用。
优选地，所述头颈鳞癌包括喉癌、口腔癌和鼻咽癌中的至少一种。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明提供的一种用于检测头颈鳞癌的核酸产品，通过检测样本中TRH基因Chr3:129974443-129974790负链的全长区域或部分区域的甲基化水平，可有效区分头颈鳞癌患者和非癌患者。相对于现有技术，本发明提供的核酸产品可用于不同类型的头颈鳞癌的检测，包括喉癌、口腔癌和鼻咽癌。本发明提供的检测头颈鳞癌的核酸产品通过检测任一个靶区域的甲基化水平，其检测口腔癌组织样本的灵敏度最高可达94.12％，检测鼻咽癌组织样本的灵敏度最高可达95.24％，检测喉癌组织样本的灵敏度最高可达96.67％，其检测癌旁正常组织的特异性在80％左右；另外，本发明提供的检测头颈鳞癌的核酸产品通过检测任一个靶区域的甲基化水平，其检测头颈鳞癌患者血浆样本的灵敏度可达85％，特异性可达94％，AUC值为0.892。
(2)本发明提供的基于上述核酸产品制备的用于检测头颈鳞癌的试剂盒，通过检测样本中TRH基因Chr3:129974443-129974790负链的全长区域或部分区域(如部分区域1～6)的甲基化水平，对头颈鳞癌组织样本和血浆样本均具有较高的检出率，可有效区分头颈鳞癌样本和非癌样本。基于此，本发明提供了一些能够用于头颈鳞癌诊断的分子标志物，并提供了一种无创或微创、高灵敏度、高特异性的检测头颈鳞癌的方法。
附图说明
图1为部分区域1诊断HNSCC血浆样本的ROC曲线图。
图2为部分区域2诊断HNSCC血浆样本的ROC曲线图。
图3为部分区域3诊断HNSCC血浆样本的ROC曲线图。
图4为部分区域4诊断HNSCC血浆样本的ROC曲线图。
图5为部分区域5诊断HNSCC血浆样本的ROC曲线图。
图6为部分区域6诊断HNSCC血浆样本的ROC曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
术语“及/或”或“和/或”均是指包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
术语“多个”指两个以上；“多种”指两种以上；“以上”与数字结合表示数量时包括本数，例如“两个以上”包括两个。
术语“诊断”是指确定受试者的健康状态，涵盖检测疾病的存在与否、对治疗手段的反应、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。在一些情况下，术语“诊断”指的是作为一个单一因素用于确定、验证或确认患者的临床状态，“辅助诊断”用于在患者临床状态确定或验证过程中提供各种信息辅助判断，不作为唯一确定指标。一些实施例中，“检测”头颈鳞癌是指检测疾病的存在与否，即判断受试者是否患有头颈鳞癌。
术语“CpG岛”指DNA上的一个区域，此区域富含大量的用磷酸酯键相连的胞嘧啶和鸟嘌呤。CpG二核苷酸通常集中在人类基因的启动子区域和外显子中。在正常人基因组中，CpG岛外的CpG位点通常是甲基化的，而CpG岛中的CpG位点通常处于非甲基化状态，这种甲基化的形式在随细胞分裂稳定的遗传。当肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG位点非甲基化程度增加，而CpG岛中的CpG位点呈高甲基化状态，导致染色体螺旋程度增加，转录抑制，基因表达缺失。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选多于三个，并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素，而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100％，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。在本公开内容中，术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。“引物对”是指上游引物和下游引物组成的组。
术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一，能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经亚硫酸氢盐转化后，所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶，而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变，因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物，通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化的DNA序列区分开来。在本公开内容中，进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物，若Ct值满足所述要求(例如在组织样本中Ct≤38)，则表明目标序列是甲基化的。
术语“甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术也是基于不同甲基化状态的DNA经亚硫酸氢盐转化后的序列差异来设计合适的引物对，从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来，但是qMSP最终的检测指标为荧光信号，因此，在qMSP反应系统中，除加入甲基化检测引物以外，还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统的甲基化特异性PCR技术相比，qMSP检测DNA甲基化水平的灵敏度和特异性更高，更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段，且该技术不需要凝胶电泳检测，操作更加简便。
术语“TaqMan探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。
术语“AUC”是“曲线下面积”的缩写。具体地，其是指接受者操作特征(ROC)曲线下面积。ROC曲线是诊断测试的不同可能切割点的真阳性率相比于假阳性率的图。其取决于所选择切割点的灵敏度与特异性之间的权衡(灵敏度的任何增加将伴随着特异性的降低)。ROC曲线下面积(AUC)是诊断测试准确度的度量(面积越大越好；最佳值是1；随机测试将具有位于对角线上的ROC曲线，面积为0.5)。
术语“分子标志物”是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标，如蛋白质、DNA或RNA等，具有非常广泛的用途。分子标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。筛选可用于疾病筛查、早期诊断的分子标志物可大大提高患者的临床治疗效果。头颈鳞癌原发部位众多，病理类型多样，其复杂程度居全身肿瘤之首，在临床应用时，高灵敏度、高特异性的分子标志物对于提高头颈鳞癌的检出率是十分重要的，因而需要探索能满足临床需求的、诊断性能优异的分子标志物，特别是高特异性的分子标志物。
在人类基因组中，TRH(Thyrotropin releasing hormone)基因位于3号染色体上，以GRCh38.p14为参考基因组，其物理位置为Chr3:129974720-129977935。TRH基因编码的蛋白质为促甲状腺激素释放激素家族中的一员，该蛋白参与促甲状腺激素和催乳素的调节和分泌。促甲状腺激素释放激素的缺乏与下丘脑甲状腺功能减退症有关。
本发明提供的一种用于检测头颈鳞癌的核酸产品，其为用于检测TRH基因CpG岛上的靶区域的甲基化水平的核酸产品；以GRCh38.p14为参考基因组，所述靶区域选自Chr3:129974443-129974790负链的全长区域或部分区域中的至少一种。
一些实施例中，所述Chr3:129974443-129974790负链的部分区域包括Chr3:129974631-129974785、Chr3:129974657-129974765、Chr3:129974646-129974737、Chr3:129974512-129974676、Chr3:129974540-129974662和Chr3:129974443-129974616。
以GRCh38.p14为参考基因组，靶区域的信息如下表所示。
靶区域 核苷酸序列
Chr3:129974443-129974790负链的全长区域 SEQ ID NO.1
Chr3:129974631-129974785负链(部分区域1) SEQ ID NO.4
Chr3:129974657-129974765负链(部分区域2) SEQ ID NO.6
Chr3:129974646-129974737负链(部分区域3) SEQ ID NO.8
Chr3:129974512-129974676负链(部分区域4) SEQ ID NO.10
Chr3:129974540-129974662负链(部分区域5) SEQ ID NO.12
Chr3:129974443-129974616负链(部分区域6) SEQ ID NO.14
一些实施例中，所述核酸产品包括用于检测上述靶区域的甲基化水平的引物对，可选地，还包括检测探针。本申请中，所述引物对及检测探针没有特别的限定，本领域技术人员在确定上述核苷酸序列作为目标序列之后，可根据本领域已知的方法和工具设计特异性引物对及探针，只要可以实现检测上述核苷酸序列是否发生甲基化的目的即可。
一些实施例中，所述核酸产品包括用于检测上述Chr3:129974443-129974790负链的全长区域的甲基化水平的甲基化引物对和非甲基化引物对。
对应地，检测上述Chr3:129974443-129974790负链的部分区域的甲基化水平时，所述核酸产品包括用于检测上述Chr3:129974443-129974790负链的部分区域的甲基化水平的引物对，以及与所述引物对对应的检测探针。
一些实施例中，所述核酸产品选自如下组合中的至少一组：
SEQ ID NO.16～17所示的甲基化引物对和SEQ ID NO.18～19所示的非甲基化引物对；
和/或，SEQ ID NO.20～21所示的引物对和SEQ ID NO.22所示的检测探针；
和/或，SEQ ID NO.23～24所示的引物对和SEQ ID NO.25所示的检测探针；
和/或，SEQ ID NO.26～27所示的引物对和SEQ ID NO.28所示的检测探针；
和/或，SEQ ID NO.29～30所示的引物对和SEQ ID NO.31所示的检测探针；
和/或，SEQ ID NO.32～33所示的引物对和SEQ ID NO.34所示的检测探针；
和/或，SEQ ID NO.35～36所示的引物对和SEQ ID NO.37所示的检测探针。
在一些实施例中，上述核酸产品还包括内参引物对和内参引物对的检测探针。可选地，内参引物对是针对ACTB基因设计的检测引物对。在一个可选地具体示例中，ACTB基因的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.38～39所示，ACTB基因的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示。可以理解的是，在其他实施例中，还可以选择其他基因作为内参基因，此时，内参引物对和检测探针对应设计即可。
一些实施例中，本发明所用检测探针为荧光探针。例如为TaqMan探针，上述靶区域的检测探针和上述内参基因ATCB的检测探针均含有荧光报告基因和荧光淬灭基因，其中检测探针的5’端含有荧光报告基团，所述荧光报告基团包括FAM、ROX、CY5、VIC、TET、JOE、HEX等中的任意一种；检测探针的3’端包含有荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团包括MGB、BHQ1、BHQ-2、BHQ-3中的任意一种。
一些实施例中，本发明提供了检测TRH基因Chr3:129974443-129974790负链的全长区域的甲基化水平的甲基化检测引物对和非甲基化检测引物对，进一步通过PCR扩增待测样本中经转化处理的模板DNA后，进行桑戈尔测序来评估目标区域的甲基化水平，即亚硫酸氢盐测序法。
一些实施例中，本发明提供了检测TRH基因Chr3:129974443-129974790负链的各个部分区域的甲基化水平的引物对和与之对应的检测探针，进一步通过甲基化特异性荧光定量PCR法(qMSP)检测各个目标区域的甲基化水平。
本发明还提供了一种用于检测头颈鳞癌的试剂盒，该试剂盒包括上述用于检测样本中TRH基因CpG岛上的靶区域的甲基化水平的核酸产品。
一些实施例中，上述试剂盒还包括扩增试剂(PCR反应试剂)、将未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的甲基化转化试剂、DNA提取试剂、DNA纯化试剂、质控品、阳性对照和阴性对照中的一种或多种。
一些实施例中，甲基化转化试剂为亚硫酸盐转化试剂或酶法转化试剂。
一些实施例中，扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或多种。
一些实施例中，质控品包括阳性参考品和阴性参考品。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒的检测样本包括不限于血浆样本、血清样本、唾液样本、组织样本或口腔、鼻咽等拭子来源的细胞样本。
本发明还提供了一种通过检测样本中TRH基因CpG岛上的Chr3:129974443-129974790负链的部分区域(如部分区域1～6)的甲基化水平来诊断或辅助诊断各种头颈鳞癌的方法，包括如下步骤：提取受试者的血浆样本DNA并用亚硫酸氢盐处理，以经转化和纯化的DNA为模板，加入用于检测头颈鳞癌的Chr3:129974443-129974790负链的部分区域的甲基化水平的引物对和与引物对对应的检测探针，以及试剂盒其他组分，进行qPCR反应，获得样本中扩增Chr3:129974443-129974790负链的部分区域的Ct值，计算样本中扩增Chr3:129974443-129974790负链的部分区域的Ct值与扩增内参基因的Ct值的差值(ΔCt)，将ΔCt与截断值进行比较，进而判断待测样本是否为头颈鳞癌阳性样本(若ΔCt值大于截断值，则该样本为头颈鳞癌阴性样本，若ΔCt小于等于截断值，则该样本为头颈鳞癌阳性样本)。
可以理解的是，在其他实施例中，上述检测头颈鳞癌的试剂盒检测样本中TRH基因CpG岛上的Chr3:129974443-129974790负链的全长区域或部分区域的甲基化水平的方法不限于亚硫酸氢盐测序法和qMSP法，还可以是其他方法。例如甲基化特异性微阵列法、全基因组亚硫酸氢盐测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法或甲基化敏感性限制性内切酶法。
基于本发明公开的内容，本领域技术人员可以采用任何本领域熟知的技术对上述样本中TRH基因CpG岛上的靶区域的甲基化水平进行检测，对头颈鳞癌进行诊断，无论采用何种技术，其都是属于本发明的保护范围。
本发明还提供了上述核酸产品或试剂盒在制备头颈鳞癌诊断产品中的应用。头颈鳞癌诊断产品可以为试剂、试剂盒、芯片和测序文库等中的一种或多种。可选地，所述试剂可以是冻干粉状、溶液、悬浮液、乳液等产品形态。头颈鳞癌诊断产品能够用于检测喉癌、口腔癌和鼻咽癌中的至少一种。
需要说明的是，本发明提供的头颈鳞癌诊断产品并不限于上述所列举的核酸产品、头颈鳞癌检测试剂盒，只要能满足头颈鳞癌的诊断或辅助诊断的需求的产品均在本发明的保护范围内。
本发明提供了能够用于诊断头颈鳞癌的分子标志物，并进一步提供了检测头颈鳞癌的核酸产品及试剂盒。本发明提供的检测头颈鳞癌的试剂盒可以有效区分头颈鳞癌患者和非癌患者，适用于诊断不同类型的头颈鳞癌，包括喉癌、口腔癌、鼻咽癌，且对头颈鳞癌组织样本和血浆样本均有较高的灵敏度和特异性。本发明提供的试剂盒检测口腔癌组织样本的灵敏度最高可达94.12％，检测鼻咽癌组织样本的灵敏度最高可达95.24％，检测喉癌组织样本的灵敏度最高可达96.67％，其检测癌旁正常组织的特异性在80％左右；另外，其检测头颈鳞癌患者血浆样本的灵敏度可达85％，特异性可达94％，AUC值为0.892。
需要说明的是，基于人类疾病诊断的复杂性，本申请所述的检测头颈鳞癌的试剂盒所获得的结果仅作为头颈鳞癌诊断的中间结果或提示患者患有头颈鳞癌的可能性或风险，还需结合个体的临床表现及其他生理指标最终得出是否罹患头颈鳞癌的结论。
以下结合具体实施例，对上述技术方案详细说明。
实施例1亚硫酸氢盐测序法检测Chr3:129974443-129974790区域负链DNA的甲基化水平及其诊断HNSCC组织样本的性能
在实施例1中，发明人以SEQ ID NO.1(以GRCh38.p14为参考基因组，Chr3:129974443-129974790负链)所示区域作为分子标志物，通过亚硫酸氢盐测序的方法检测该区域的甲基化水平，从而分析该方法诊断头颈鳞癌的性能。
1.样本收集：
本实施例收集了经病理活检确诊为头颈鳞状细胞癌患者(即口腔、鼻咽部或喉部出现癌变的患者)的癌组织样本和对应的癌旁正常组织样本各106例。其中，口腔癌组织样本和对应的癌旁正常组织样本分别为34例，鼻咽癌组织样本和对应的癌旁正常组织样本分别为42例，喉癌组织样本和对应的癌旁正常组织样本分别为30例，所述癌组织样本均为处于癌症中晚期的样本。所有的组织样本都为福尔马林固定且经石蜡包埋的样本，所有样本的收集过程获得伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书。
2.组织样本DNA的提取：
使用QIAamp DNAFFPE Tissue Kit(56404)提取组织样本基因组DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。
3.组织样本DNA的转化和纯化：
将提取好的样本基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化和纯化，所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843)，具体实验操作参见试剂盒说明书。
4.亚硫酸氢盐测序：
以GRCh38.p14为参考基因组，以物理位置为Chr3:129974443-129974790的负链DNA为靶区域，通过亚硫酸氢盐测序法检测靶区域的甲基化水平。具体地，对于经提取和亚硫酸氢盐转化的DNA模板，分别设计甲基化检测引物对和非甲基化检测引物对，并将其同时加入PCR扩增体系中用于扩增靶区域，将获得的扩增子构建至pMD-18T载体上，并送测序公司进行桑戈尔测序，以分析靶区域的甲基化水平。
Chr3:129974443-129974790负链的碱基序列(5’-3’)：
GATCCGGGGACTCGGGATCCGCAGTCGGCAGGTCAGGAGTCTGCAGCGCTGAGGACC
CCGGGCGCCTGCCGAGCCCTCTTCAGATGGGCCGCCGCTTATATCTGCGCCAGGCGGCG
GCTCGAGTGAGGTCAGCGGGGAGGGGTCGCGGCCGCCGGGAAGGGGCGCTGACGGC
AGCCGGCCCCGCGGGACCCCGCCCGCCTGCTCCTCCGGAAATCTGGGGCGGGGACGG
TGGGGACCGGAGCCGGGGCGCGGAGGCACTGGCCGCAGGATGGGGCGCCGGCGCGG
GGTCGTTTCTGCACCACCTCTGGAGATCTGTTGACGAGAACACGCGTGTAGGGGGCAAAGGGA(SEQID NO.1)。
完全甲基化的Chr3:129974443-129974790负链经亚硫酸氢盐转化后的序列(5’-3’)：
GATTCGGGGATTCGGGATTCGTAGTCGGTAGGTTAGGAGTTTGTAGCGTTGAGGATTTCGGGCGTTTGTCGAGTTTTTTTTAGATGGGTCGTCGTTTATATTTGCGTTAGGCGGCGGTTCGAGTGAGGTTAGCGGGGAGGGGTCGCGGTCGTCGGGAAGGGGCGTTGACGGTAGTCGGTTTCGCGGGATTTCGTTCGTTTGTTTTTTCGGAAATTTGGGGCGGGGACGGTGGGGATCGGAGTCGGGGCGCGGAGGTATTGGTCGTAGGATGGGGCGTCGGCGCGGGGTCGTTTTTGTATTATTTTTGGAGATTTGTTGACGAGAATACGCGTGTAGGGGGTAAAGGGA(SEQ ID NO.2)。
未甲基化的Chr3:129974443-129974790负链经亚硫酸氢盐转化后的序列(5’-3’)：
GATTTGGGGATTTGGGATTTGTAGTTGGTAGGTTAGGAGTTTGTAGTGTTGAGGATTTTGGGTGTTTGTTGAGTTTTTTTTAGATGGGTTGTTGTTTATATTTGTGTTAGGTGGTGGTTTGAGTGAGGTTAGTGGGGAGGGGTTGTGGTTGTTGGGAAGGGGTGTTGATGGTAGTTGGTTTTGTGGGATTTTGTTTGTTTGTTTTTTTGGAAATTTGGGGTGGGGATGGTGGGGATTGGAGTTGGGGTGTGGAGGTATTGGTTGTAGGATGGGGTGTTGGTGTGGGGTTGTTTTTGTATTATTTTTGGAGATTTGTTGATGAGAATATGTGTGTAGGGGGTAAAGGGA(SEQ ID NO.3)。
本实施例中，甲基化引物对和非甲基化引物对的设计十分重要，第一，要求甲基化检测引物对具有良好的检测灵敏度，即当模板中含有大于等于1％的甲基化DNA序列时，即可扩增得到甲基化的DNA产物；第二，要求甲基化引物对对于发生甲基化的靶区域具有极好的扩增特异性，而非甲基化引物对对于未发生甲基化的靶区域具有极好的扩增特异性，即甲基化检测引物对不会扩增非甲基化的模板，且非甲基化检测引物对不会扩增甲基化的模板。另外，通过调整PCR反应体系中甲基化引物对和非甲基化引物对的配比，致使当模板中存在大于等于1％的靶区域的甲基化DNA序列时，扩增产物仅为甲基化的DNA序列。根据上述要求，本实施例提供了检测Chr3:129974443-129974790区域的负链DNA甲基化水平的甲基化引物对和非甲基化引物对，甲基化上游引物(5’-3’)：GGGGGATTCGGGATTCG(SEQ IDNO.16)，甲基化下游引物(5’-3’)：CCCTTTACCCCCTACACGAGTA(SEQ ID NO.17)，非甲基化上游引物(5’-3’)：GATTTGGGGATTTGGGATTTG(SEQ ID NO.18)，非甲基化下游引物(5’-3’)：TCCCTTTACCCCCTACACACATA(SEQ ID NO.19)。
将上述甲基化引物对和非甲基化引物对分别人工合成，以经亚硫酸氢盐转化的组织样本DNA为模板，按照表1的配方配置PCR反应体系，按照表2提供的程序进行PCR扩增。PCR扩增结束后，将产物纯化回收，进行TA连接，然后将扩增产物连接至pMD-18T载体上，连接产物转化大肠杆菌后，挑取阳性克隆提取质粒并送公司进行桑戈尔测序，同时从5’端和3’端测序。
表1 PCR扩增体系
组分 用量(μL)
10×Taq buffer(Mg2+ Free) 5
25mM Mg2+ 4
dNTP Mix(10mM each) 1
甲基化上游引物(10μM) 1
甲基化下游引物(10μM) 1
非甲基化上游引物(10μM) 0.5
非甲基化下游引物(10μM) 0.5
热启动Taq DNA聚合酶 0.5
模板DNA 10
超纯水 补至50
表2 PCR反应程序
5.结果分析：
剔除测序失败的样本，保留测序成功的样本进行结果分析。
根据测序峰图对每个样本中扩增子的CpG位点的甲基化情况进行分析。一个CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化情况分为两种，即非甲基化和甲基化，其中甲基化又分为完全甲基化和部分甲基化。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果为胸腺嘧啶，则其为非甲基化的。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果仍然为胞嘧啶，则其为完全甲基化的。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果既有胞嘧啶也有胸腺嘧啶(双峰)，则其为部分甲基化的。
对于某一待测样本，如果扩增子中95％以上的CpG二核苷酸中胞嘧啶是甲基化的，则认为此样本中该靶区域是甲基化阳性的；如果扩增子中所有CpG二核苷酸都是未甲基化的，则认为此样本中该靶区域是甲基化阴性的。计算各类样本中的甲基化阳性数目和甲基化阴性数目，并计算甲基化阳性和甲基化阴性的比例。灵敏度是指测序成功的且病理结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例。特异性是指测序成功的且病理结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。以Chr3:129974443-129974790区域的负链DNA为靶区域，通过亚硫酸氢盐测序法检测其甲基化水平诊断头颈鳞状细胞癌组织样本的灵敏度和特异性结果如表3所示。
表3Chr3:129974443-129974790负链的甲基化水平诊断HNSCC组织样本性能
由表3可以看出，以Chr3:129974443-129974790区域的负链DNA作为靶区域时，其在HNSCC癌组织样本中的甲基化水平(甲基化阳性样本的例数)明显高于其在癌旁正常组织样本中的甲基化水平(甲基化阴性样本的例数)。通过设计甲基化引物对和非甲基化引物对扩增经亚硫酸氢盐转化的模板DNA，再使用桑戈尔测序法检测靶区域的甲基化水平，可以有效区分HNSCC组织样本和癌旁正常组织样本。具体地，该方法检测口腔癌、鼻咽癌和喉癌组织样本的灵敏度分别为93.1％、95％和92.86％，该方法检测口腔癌、鼻咽癌和喉癌癌旁正常组织样本的特异性分别为84.38％、85％和79.31％。
实施例2
本实施例提供甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)法检测Chr3:129974443-129974790负链的部分区域DNA的甲基化水平的方法及其诊断HNSCC组织样本的性能数据。
在实施例2中，发明人以TRH基因Chr3:129974443-129974790负链的部分区域1(Chr3:129974631-129974785负链)、部分区域2(Chr3:129974657-129974765负链)、部分区域3(Chr3:129974646-129974737负链)、部分区域4(Chr3:129974512-129974676负链)、部分区域5(Chr3:129974540-129974662负链)、部分区域6(Chr3:129974443-129974616负链)作为靶区域，设计针对各个部分区域的甲基化检测引物对和对应的检测探针，通过qMSP法检测各个部分区域甲基化水平，从而分析该方法诊断头颈鳞癌的性能。具体检测过程如下所示。
1.组织样本的收集、组织样本DNA的提取、转化和纯化同实施例1。
2.甲基化特异性荧光定量PCR反应：
以亚硫酸氢盐转化后的Chr3:129974443-129974790区域负链DNA为模板，分别设计针对各个部分区域的甲基化检测引物对和检测探针，检测待测样本中各个部分区域的甲基化水平。具体地，以Chr3:129974443-129974790负链区域的部分区域1～6为靶区域，共设计6对甲基化检测引物对和与之对应的检测探针，分别检测部分区域1～6的DNA的甲基化水平，其中部分区域1～6可以覆盖Chr3:129974443-129974790区域的全长。要求甲基化检测引物扩增灵敏度高，其扩增目标区域的扩增效率在90％-110％之间，且其扩增特异性良好，不会扩增非甲基化的模板，也不会引起其它非特异性扩增。部分区域的DNA序列及经亚硫酸氢盐转化后的序列如表4所示，用以扩增部分区域的甲基化检测引物对、检测探针的核苷酸序列以及可检测的甲基化的胞嘧啶位点如表5所示。
表4甲基化检测引物对可扩增的部分区域1～6的DNA序列
表5甲基化检测引物对、检测探针的核苷酸序列及可检测的甲基化的胞嘧啶位点
以从组织样本中提取的、经亚硫酸氢盐转化和纯化的DNA为模板，使用表5中提供的甲基化引物对和探针检测各个样本中各部分区域的甲基化水平。在对每个样本进行检测时，除加入各部分区域特异性的甲基化引物对和探针以外，还需加入内参基因ACTB的检测引物对和检测探针，上游引物：5’-AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG-3’(SEQ ID NO.38)，下游引物：5’-AATAACACCCCCACCCTGC-3’(SEQ ID NO.39)，检测探针：5’-GGAGTGGTTTTTGGGTTTG-3’(SEQ ID NO.40)，用以监测样本质量及结果判读。配置PCR反应体系用到的热启动Taq酶以及PCR缓冲液购自Invitrogen(Cat:14966005)，qPCR的配置体系如表6所示。在使用qMSP法检测各部分区域在样本中的甲基化水平时，还需设置阴性对照和阳性对照。阴性对照PCR管的模板为TE缓冲液，其它成分与实验管相同；阳性对照PCR管的模板为103copies/μL含转化后ACTB序列的质粒和103copies/μL含转化后各个部分区域DNA序列的质粒混合物，其它成分也与实验管相同。随后，按照表7展示的程序进行qMSP反应。
本实施例中所用到的探针均为TaqMan探针，该探针5’端为荧光基团，如FAM、ROX、VIC、CY5等，其3’端为荧光淬灭基团，如BHQ、MGB等。本实施例中检测各部分区域甲基化水平的探针其5’端荧光基团为FAM，其3’端荧光淬灭基团为MGB，检测ACTB基因的探针其5’端荧光基团为VIC，其3’端荧光淬灭基团为BHQ。
表6 qMSP反应体系
组分 规格 体积(μL)
Platinum II PCR缓冲液 5× 5
dNTPs 各2.5mM 3
部分区域的上游引物 10μM 0.5
部分区域的下游引物 10μM 0.5
检测探针 10μM 0.5
ACTB上游引物 10μM 0.5
ACTB下游引物 10μM 0.5
ACTB检测探针 10μM 0.5
Taq酶 / 0.5
待测样本DNA / 5
超纯水 / 补至25
表7 qMSP反应程序
qPCR反应结束后，调整基线，并设置阈值，阈值必须位于指数扩增期内，穿越阈值与X轴平行的直线称为阈值线，阈值线与扩增曲线的交点所对应的循环数即为Ct值。分析qPCR反应的结果，要求①阴性对照PCR管无扩增(即不起线)；②阳性对照PCR管有明显的指数增长期，且阳性对照PCR管的目标基因的Ct值在26～30之间；③待测样本的内参基因的Ct值小于等于33。若阳性对照、阴性对照和内参基因均满足上述要求，则可以分析待测样本的检测结果并进行结果判读，否则，当次实验无效，必须重新进行检测。
3.结果判读
对于组织样本，若使用某一对甲基化检测引物和探针进行扩增的Ct值≤38，认为该样本在此扩增区域为甲基化阳性，该样本为头颈鳞癌阳性样本；若使用某一对甲基化检测引物和探针进行扩增的Ct值>38，认为该样本在此扩增区域为甲基化阴性，该样本为头颈鳞癌阴性样本。根据上述标准，通过qMSP法检测部分区域1～6的甲基化水平，进而诊断头颈鳞癌组织样本的性能如表8和表9所示。
表8部分区域1～6在HNSCC组织样本中检测的甲基化阳性/甲基化阴性(例)
表9qMSP检测部分区域1～6的甲基化水平诊断HNSCC组织样本的性能
由表9可以看出，通过qMSP法检测组织样本中Chr3:129974443-129974790负链的部分区域1～6的甲基化水平，都可以有效区分头颈鳞癌组织样本和癌旁正常组织样本。从总灵敏度和总特异性来看，通过检测部分区域1的甲基化水平诊断HNSCC组织样本的灵敏度最高，可达95.34％，其诊断癌旁正常组织样本的特异性为80.25％。通过检测部分区域2的甲基化水平诊断癌旁正常组织样本的特异性最高，可达81.42％，其检测HNSCC组织样本的灵敏度为90.68％；通过检测部分区域6的甲基化水平的诊断性能略低，其检测HNSCC组织样本的灵敏度为89.89％，其检测癌旁正常组织的特异性为74.41％。另外，通过检测部分区域1～6的甲基化水平，对不同类型的头颈鳞癌均有较好的诊断效果。
实施例3
本实施例提供qMSP法检测Chr3:129974443-129974790负链的部分区域的甲基化水平进而诊断HNSCC血浆样本的性能数据。
1.血液样本收集
共招募213名志愿者，其中有54名为经病理组织活检确诊为口腔鳞状细胞癌的患者，有65名为经病理组织活检确诊为鼻咽癌的患者，有44名为经病理组织活检确诊为喉癌的患者，剩余50名志愿者为健康人，分别获取每名志愿者的血液样本。所述样本收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书。
2.血浆游离(cell free DNA,cfDNA)DNA的提取
从每名志愿者体内抽取大于8mL静脉血，收集的抗凝血样本，室温静置后，3000rpm离心10分钟，获得血浆样本。使用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA(cfDNA)提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取，具体操作按照试剂盒说明书进行。
3.样本DNA的转化和纯化
采用武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)对其进行转化，随后对转化的DNA进行纯化，用于后续实验，具体操作步骤参见试剂盒说明书。
4.qMSP反应
以经转化、纯化的血浆cfDNA作为模板，使用表5提供的甲基化引物对和探针，按照实施例2提供的方法进行qMSP反应，以检测血浆样本中Chr3:129974443-129974790负链的部分区域1～6的甲基化水平。
5.结果分析
qMSP反应后，可得到扩增每个样本中部分区域1～6的Ct值，再计算其与内参基因ACTB的Ct值之差ΔCt，并根据得到的ΔCt值进行ROC(receiver operatingcharacteristic curve,ROC)分析。在IBM SPSS软件中，将头颈鳞癌患者血浆样本的状态变量定为“1”，将健康人血浆样本的状态变量定为“0”，点击“分析”-“ROC曲线图”，分别指定检验变量和状态变量的值，将状态变量的值定为1，并选择“较小的检验结果表示更明确的检验”，得出检验HNSCC的ROC分析结果，选择约登指数(灵敏度+特异性-1)最大时的ΔCt为截断值，并得到平均AUC(area under curve,AUC)值、灵敏度和特异性数值，结果如表10所示，部分区域1、2、3、4、5、6诊断HNSCC血浆样本的ROC曲线分别如图1、图2、图3、图4、图5、图6所示。
表10 qMSP检测部分区域1～6的甲基化水平诊断HNSCC血浆样本的性能
部分区域 灵敏度 特异性 AUC值 截断值
1 83.2％ 94％ 0.881 11.89
2 78.9％ 92％ 0.845 11.90
3 84.5％ 92％ 0.884 12
4 82％ 92％ 0.876 11.95
5 85％ 94％ 0.892 12
6 81.4％ 92％ 0.856 11.96
由表10可以看出，通过qMSP法检测部分区域1～6的甲基化水平诊断HNSCC血浆样本的效果优异，其AUC值都大于0.84。具体地，通过检测部分区域1～6的甲基化水平诊断HNSCC患者血浆样本的灵敏度范围为78.9％～85％，其检测健康人血浆样本的特异性范围为92％～94％。其中，通过检测部分区域5的甲基化水平诊断HNSCC患者和健康人血浆样本的性能最好，其检测HNSCC患者的灵敏度最高，可达85％，其检测健康人血浆样本的特异性为94％，其AUC值可达0.892，此时的截断值为12。
综上，通过检测Chr3:129974443-129974790负链的全长区域或部分区域，都可以有效区分头颈鳞癌患者和非癌患者，其中部分区域1诊断HNSCC患者组织样本的性能最好，部分区域5诊断HNSCC患者血浆样本的性能最好。无论是选择组织样本，还是选择血浆样本，本发明提供的核酸产品、检测试剂和检测试剂盒都可以有效区分头颈鳞癌患者和非癌患者，为头颈鳞癌患者带了无创或微创、且检测灵敏度和特异性较高的诊断产品，可以提高HNSCC的检出率，进而提高HNSCC患者的生存率。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测头颈鳞癌的核酸产品，其特征在于，其为用于检测样本中TRH基因CpG岛上的靶区域的甲基化水平的核酸产品；
以GRCh38.p14为参考基因组，所述靶区域包括Chr3:129974443-129974790负链的全长区域或部分区域中的至少一个。
2.如权利要求1所述的核酸产品，其特征在于，所述Chr3:129974443-129974790负链的部分区域包括Chr3:129974631-129974785、Chr3:129974657-129974765、Chr3:129974646-129974737、Chr3:129974512-129974676、Chr3:129974540-129974662和Chr3:129974443-129974616。
3.如权利要求1或2任一项所述的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品包括用于检测所述靶区域的甲基化水平的引物对，可选地，还包括检测探针。
4.如权利要求3所述的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品包括用于检测所述Chr3:129974443-129974790负链的全长区域的甲基化水平的甲基化引物对和非甲基化引物对；
优选地，所述甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.16～17所示，所述非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18～19所示。
5.如权利要求3所述的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品包括用于检测所述Chr3:129974443-129974790负链的部分区域的甲基化水平的引物对和与所述引物对对应的检测探针；
优选地，所述核酸产品包括用于检测Chr3:129974631-129974785负链甲基化水平的如SEQ ID NO.20～21所示的引物对和如SEQ ID NO.22所示的检测探针；和/或，用于检测Chr3:129974657-129974765负链甲基化水平的如SEQ ID NO.23～24所示的引物对和如SEQID NO.25所示的检测探针；和/或，用于检测Chr3:129974646-129974737负链甲基化水平的如SEQ ID NO.26～27所示的引物对和如SEQ ID NO.28所示的检测探针；和/或，用于检测Chr3:129974512-129974676负链甲基化水平的如SEQ ID NO.29～30所示的引物对和如SEQID NO.31所示的检测探针；和/或，用于检测Chr3:129974540-129974662负链甲基化水平的如SEQ ID NO.32～33所示的引物对和如SEQ ID NO.34所示的检测探针；和/或，用于检测Chr3:129974443-129974616负链甲基化水平的如SEQ ID NO.35～36所示的引物对和如SEQID NO.37所示的检测探针。
6.如权利要求5所述的核酸产品，其特征在于，所述检测探针5’端含有荧光报告基因，3’端含有荧光淬灭基团。
7.一种用于检测头颈鳞癌的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至6任一项所述的核酸产品。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应试剂、甲基化转化试剂、DNA提取试剂、DNA纯化试剂和质控品中的一种或多种。
9.如权利要求1至6任一项所述的核酸产品或如权利要求7或8所述的试剂盒在制备头颈鳞癌诊断产品中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述头颈鳞癌包括喉癌、口腔癌和鼻咽癌中的至少一种。
CN202310332504.2A 2023-03-30 2023-03-30 一种用于检测头颈鳞癌的核酸产品、试剂盒及应用 Pending CN116516005A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310332504.2A CN116516005A (zh) 2023-03-30 2023-03-30 一种用于检测头颈鳞癌的核酸产品、试剂盒及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310332504.2A CN116516005A (zh) 2023-03-30 2023-03-30 一种用于检测头颈鳞癌的核酸产品、试剂盒及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116516005A true CN116516005A (zh) 2023-08-01

Family

ID=87398490

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310332504.2A Pending CN116516005A (zh) 2023-03-30 2023-03-30 一种用于检测头颈鳞癌的核酸产品、试剂盒及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116516005A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2021128519A1 (zh) Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒
CN113604563B (zh) 一种肝癌诊断或辅助诊断的核酸组合、检测试剂盒及其应用
CN114891886B (zh) 用于诊断膀胱癌的核酸产品、试剂盒及应用
CN116555423A (zh) 肺癌甲基化标志物组合、检测产品及其应用
CN116516005A (zh) 一种用于检测头颈鳞癌的核酸产品、试剂盒及应用
CN115948561B (zh) 一种用于食管鳞癌诊断或辅助诊断的试剂、检测试剂盒及其应用
CN114959030B (zh) 检测hcg9基因甲基化的试剂在制备诊断膀胱癌的产品中的应用
CN114941029B (zh) 肝癌的生物标志物、核酸产品和试剂盒
CN115094139B (zh) 检测甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用以及膀胱癌诊断试剂盒
CN114150065B (zh) 一种结直肠癌或癌前病变的标记物及其应用
CN117587124A (zh) 诊断胰腺癌的检测试剂和试剂盒及应用
CN116356027A (zh) 一种用于食管鳞癌或癌前病变检测的试剂、试剂盒及应用
CN116694763A (zh) 一种用于肝细胞癌检测的核酸产品、试剂盒及应用
CN117265110A (zh) 一种用于检测肺鳞癌的试剂盒及应用
CN116676384A (zh) 胃癌的生物标志物、核酸产品和试剂盒
CN116287229A (zh) 检测食管癌的试剂及试剂盒
CN117248021A (zh) 一种用于尿路上皮癌或癌前病变检测的核酸组合、试剂盒及应用
CN117778572A (zh) 一种用于检测甲状腺癌的核酸组合、检测试剂盒及应用
WO2023083348A1 (zh) 用于食管癌诊断的甲基化检测试剂及试剂盒
CN116083586A (zh) 诊断食管癌的核酸产品、试剂盒及用途
CN117144012A (zh) 一种用于肺腺癌检测的甲基化分子标志物、试剂盒及应用
CN116694767A (zh) 一种用于肺癌检测的试剂、试剂盒及应用
CN117778582A (zh) 用于检测胃癌的核酸组合、试剂盒及应用
CN117004713A (zh) 用于诊断或辅助诊断胃癌的生物标志物和试剂盒
CN116751863A (zh) 一种用于检测咽部恶性肿瘤分子标志物甲基化水平的试剂盒及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination