CN114891886B - 用于诊断膀胱癌的核酸产品、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于诊断膀胱癌的核酸产品、试剂盒及应用。本发明利用C1orf141基因CpG岛的甲基化与膀胱的发生的相关性，通过检测样本中C1orf141基因CpG岛中各区域的甲基化水平，其检测的灵敏度和特异性均较高，能够对膀胱癌进行较准确的诊断或辅助诊断，可以有效区分膀胱癌患者和健康人，有效地提高了早期膀胱癌的检出率。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种用于诊断膀胱癌的核酸产品、试剂盒及应用。
背景技术
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，极易复发，严重危害人类的生命健康。膀胱癌的复发常呈周期性，肿瘤级别会进一步恶化，所以早诊断、早治疗和长期有效的监测对提高膀胱癌患者的生存率十分重要。
目前，常用的膀胱癌诊断方法包括尿脱落细胞学检查和膀胱镜检查。尿脱落细胞学检查虽然是无创的，且其检测特异性可达90％以上，但是其检测灵敏度较低，只有30％～40％。因此，某些患者不得不进行膀胱镜检查，膀胱镜检查费用较高，属于有创操作，在检查过程中会给患者带来较大的痛苦，且其结果受医师的经验和主观判断的影响，存在一定的误差。近年来有一些基于尿液的检测方法，如检测膀胱肿瘤抗原(bladder tumor antigen,BTA)和核基质蛋白22(nuclear matrix protein,NMP22)等，这些标记物的灵敏性相对较高，可达50％～70％，但特异性不佳，仅有60％～80％，所以未能广泛应用到临床中。
DNA甲基化是基因表达的重要表观遗传调控因子，在维持正常生物功能和疾病的发生发展中起着重要作用。肿瘤抑制相关基因甲基化程度的增加从而导致其活性降低或失活是多种肿瘤发生的早期事件，这种DNA甲基化模式的改变可能是最早可检测到的与肿瘤基因相关的变化之一。因此，DNA甲基化标志物被广泛地应用于常见癌症的诊断和预后，目前，研究人员发现了多种在膀胱癌中高甲基化的基因，其中一些已被开发为诊断产品，例如TWIST1和NID2或FGFR3和TERT等基因，然而这些甲基化标志物的诊断灵敏度和特异性仍然需要提高。
发明内容
本发明研究人员发现，尿液样本中存在着数量相当的脱落细胞的DNA可用于液体活检，脱落细胞DNA的CpG位点的甲基化可以成为检测或监测膀胱癌的标记物。而C1orf141(Chromosome 1Open Reading Frame 141)基因CpG岛的甲基化水平与膀胱癌的发生密切相关，且该基因DNA分子的异常甲基化频繁地发生在癌症早期。基于此，本申请提供一种用于诊断膀胱癌的核酸产品、试剂盒及应用。
一种检测C1orf141基因CpG岛甲基化水平的试剂在制备用于诊断膀胱癌的产品中的应用。
通过检测C1orf141基因CpG岛的甲基化水平，可以有效区分膀胱癌患者和健康人，其检测的灵敏度和特异性都较高，提高了膀胱癌的检出率。
在其中一个实施例中，以GRCh38.p13为参考基因组，所述试剂用于检测Chr1:67134645-67135071正链和/或负链的全长或部分区域的甲基化水平。
在其中一个实施例中，所述试剂用于检测以下至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平：
正链Chr1:67134645-67134767、
正链Chr1:67134757-67134897、
正链Chr1:67134910-67135071、
负链Chr1:67135060-67134936、
负链Chr1:67134912-67134762、以及
负链Chr1:67134772-67134653。
一种用于诊断膀胱癌的核酸产品，所述核酸产品用于检测C1orf141基因CpG岛的甲基化水平。
在其中一个实施例中，以GRCh38.p13为参考基因组，所述核酸产品包括检测Chr1:67134645-67135071正链和/或负链的全长或部分区域的甲基化水平的引物对。
在其中一个实施例中，所述核酸产品包括检测以下至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平的引物对：
正链Chr1:67134645-67134767、
正链Chr1:67134757-67134897、
正链Chr1:67134910-67135071、
负链Chr1:67135060-67134936、
负链Chr1:67134912-67134762、以及
负链Chr1:67134772-67134653。
在其中一个实施例中，所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示的测序引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:3～4所示的测序引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:5～6所示的测序引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:7～8所示的测序引物对、核苷酸序列如SEQID NO:9～10所示的测序引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:11～12所示的测序引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:13～14所示的检测引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:16～17所示的检测引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:19～20所示的检测引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:22～23所示的检测引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:25～26所示的检测引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO:28～29所示的检测引物对中的至少一对。
在其中一个实施例中，所述核酸产品还包括与所述检测引物对对应的检测探针，其中，与核苷酸序列如SEQ ID NO:13～14所示的检测引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:16～17所示的检测引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:19～20所示的检测引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:22～23所示的检测引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:25～26所示的检测引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:28～29所示的检测引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQID NO:30所示。
一种用于诊断膀胱癌的试剂盒，包括以上任一实施例所述的核酸产品。
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、阳性对照品、阴性对照品、PCR反应试剂和测序试剂中的至少一种。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本文所述的“CpG岛”是指DNA上的一个区域，此区域富含大量的用磷酸酯键相连的胞嘧啶和鸟嘌呤。CpG二核苷酸通常集中在人类基因的启动子区域和外显子中。在正常人基因组中，CpG岛外的CpG位点通常是甲基化的，而CpG岛中的CpG位点通常处于非甲基化状态，这种甲基化的形式在随细胞分裂稳定的遗传。当肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG位点非甲基化程度增加，而CpG岛中的CpG位点呈高甲基化状态，导致染色体螺旋程度增加，转录抑制，基因表达缺失。
所述的“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
所述的“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化，或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较；在一些情况下，还对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。
所述的“TaqMan探针”是指包含5’端荧光报告基团和3’端荧光淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。
所述的“Chr1:67134910-67135071”是指在1号染色体上起始位点为67134910，终止位点为67135071的一段区域。本文中的其他区域编码原理与此相同，且本文中的编码均是以GRCh38.p13为参考基因组。
本申请一实施方式提供了一种检测C1orf141基因CpG岛甲基化水平的试剂在制备用于诊断膀胱癌的产品中的应用。
C1orf141基因位于人类1号染色体上，具体位置为Chr1:67092165-67141646，在NCBI上Gene ID为400757。C1orf141基因CpG岛的甲基化水平与膀胱癌的发生密切相关，且该基因DNA分子的异常甲基化频繁地发生在癌症早期。通过检测C1orf141基因CpG岛的甲基化水平，可以有效区分膀胱癌患者和健康人，其检测的灵敏度和特异性都较高，提高了膀胱癌的检出率。
在其中一个实施例中，膀胱癌包括膀胱尿路上皮癌。
在其中一个实施例中，以GRCh38.p13为参考基因组，上述试剂用于检测Chr1:67134645-67135071正链和/或负链的全长或部分区域的甲基化水平。
进一步地，上述试剂用于检测以下至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平：正链Chr1:67134645-67134767、正链Chr1:67134757-67134897、正链Chr1:67134910-67135071、负链Chr1:67135060-67134936、负链Chr1:67134912-67134762、以及负链Chr1:67134772-67134653。
优选地，上述试剂用于检测以下至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平：正链Chr1:67134910-67135071和负链Chr1:67135060-67134936。
本申请一实施方式还提供了一种用于诊断膀胱癌的核酸产品，该核酸产品用于检测C1orf141基因CpG岛的甲基化水平。
在其中一个实施例中，以GRCh38.p13为参考基因组，上述核酸产品包括检测Chr1:67134645-67135071正链和/或负链的全长或部分区域的甲基化水平的引物对。
进一步地，上述核酸产品包括检测以下至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平的引物对：正链Chr1:67134645-67134767、正链Chr1:67134757-67134897、正链Chr1:67134910-67135071、负链Chr1:67135060-67134936、负链Chr1:67134912-67134762、以及负链Chr1:67134772-67134653。
优选地，上述核酸产品包括检测以下至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平的引物对：正链Chr1:67134910-67135071和负链Chr1:67135060-67134936。
在其中一个实施例中，上述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示的测序引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:3～4所示的测序引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:5～6所示的测序引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:7～8所示的测序引物对、核苷酸序列如SEQID NO:9～10所示的测序引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:11～12所示的测序引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:13～14所示的检测引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:16～17所示的检测引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:19～20所示的检测引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:22～23所示的检测引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:25～26所示的检测引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO:28～29所示的检测引物对中的至少一对。
进一步地，上述核酸产品还包括与上述检测引物对对应的检测探针，其中，与核苷酸序列如SEQ ID NO:13～14所示的检测引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:15所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:16～17所示的检测引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:19～20所示的检测引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:22～23所示的检测引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:25～26所示的检测引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:28～29所示的检测引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示。
在一些实施例中，上述核酸产品还包括内参引物对。在一些实施例中，内参引物对包括用于扩增真核细胞管家基因的引物对。在一个可选的具体示例中，该内参引物对包括用于扩增ACTB(β-actin)基因片段或GAPDH基因片段的引物对。
在一个可选的具体示例中，该内参引物对为扩增ACTB(β-actin)基因片段的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:31～32所示。
进一步地，上述核酸产品还包括与内参引物对对应的检测探针。在一个可选的具体示例中，与核苷酸序列如SEQ ID NO:31～32所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示。
在其中一个实施例中，上述检测探针为TaqMan荧光探针。检测探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。荧光报告基团可以是选自FAM、TET、VIC、JOE、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、NED和Texas Red中的一种，荧光淬灭基团可以是选自TAMRA、BHQ和MGB中的一种。可以理解的是，对目标区域甲基化的检测与对内参基因的检测可以在同一个反应孔中进行也可以在不同反应孔中进行，根据实际情况来合理选择检测探针的荧光基团。在一个可选的具体示例中，对目标区域甲基化的检测与对内参基因的检测在同一个反应孔中进行，其中，目标区域甲基化的检测探针的荧光报告基团为FAM，其荧光淬灭基团为MGB；内参基因的检测探针的荧光报告基团为VIC，其荧光淬灭基团为BHQ-1。
在一些实施例中，该核酸产品还包括PCR内部控制品。该PCR内部控制品包括内部控制核酸片段、内部控制引物对及内部控制检测探针。
具体地，PCR内部控制品是指监控是否存在PCR抑制物及反应系统(包括试剂、PCR程序和荧光采集)是否正常的DNA序列。在PCR体系中加入内部控制品能够辨别假阴性和假阳性。可以理解的是，在其他一些具体示例中，上述核酸产品可以不含PCR内部控制品。
本申请一实施方式还提供了一种用于诊断膀胱癌的试剂盒，包括以上任一实施例所述的核酸产品。
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、阳性对照品、阴性对照品、PCR反应试剂和测序试剂中的至少一种。
具体地，甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。在一个可选的具体示例中，甲基化转化试剂包括亚硫酸氢盐。
在其中一个实施例中，PCR反应试剂包括PCR缓冲液、dNTP、MgCl2和DNA聚合酶。
本申请一实施方式还提供了一种检测C1orf141基因CpG岛甲基化水平的方法，包括步骤a1、步骤a2和步骤a3。具体地：
步骤a1：获取待测样本的DNA。
步骤a2：对上述DNA进行转化。
具体地，可采用亚硫酸氢盐对DNA进行转化。
步骤a3：采用上述任一实施例所述的核酸产品或上述任一实施例所述的试剂盒对经过转化的DNA进行甲基化水平的检测。
具体地，甲基化水平的检测方法包括但不限于以下任一种：甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。
在其中一个实施例中，上述待测样本包括尿液样本和组织样本中的至少一种。
上述用于诊断膀胱癌的核酸产品、试剂盒及应用，利用C1orf141基因CpG岛的甲基化与膀胱的发生的相关性，通过检测样本中C1orf141基因CpG岛中各区域的甲基化水平，其检测的灵敏度和特异性均较高，能够对膀胱癌进行较准确的诊断或辅助诊断，可以有效区分膀胱癌患者和健康人，有效地提高了早期膀胱癌的检出率。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
1.收集样本
于武汉某医院收集64例经病理检测确诊的膀胱尿路上皮癌患者及78例进行常规体检的健康人的尿液样本，收集到的每份尿液样本的体积大于50mL。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。
2.提取样本DNA
利用武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试剂盒(鄂汉械备20210740号)进行尿液样本DNA的提取，具体步骤如下所示。
1)裂解结合
准备洁净的5mL离心管，向其中加入100μL蛋白酶K。尿液样本混匀后取2mL至准备好蛋白酶K的离心管中，依次加入2mL裂解结合液和20μL磁珠，上下颠倒混匀后，置于混匀仪上于25℃裂解30min，保持磁珠处于悬浮状态。
2)洗涤
将离心管置于磁力架上，吸磁2min，至溶液澄清后，颠倒数次冲洗管盖上残留的磁珠，直至全部吸磁完成。小心吸除废液，加入2mL洗涤液，涡旋混匀10次以上，使磁珠完全分散，再次吸磁2min，至溶液澄清后，颠倒数次冲洗管盖上残留的磁珠，直至全部吸磁完成。
3)漂洗
小心吸除废液，先加入500μL漂洗液将磁珠洗涤至底部后将磁珠悬浮液转移至新的2mL离心管中，再加入500μL漂洗液将5mL离心管管壁上残余的磁珠完全洗涤到底部，瞬时离心后转移全部磁珠悬浮液到2mL离心管中，涡旋混匀10次以上使磁珠完全分散，吸磁2min，至溶液澄清后，颠倒数次冲洗管盖上残留的磁珠，直至全部吸磁完成。重复漂洗一次。
4)洗脱
取下离心管短暂离心收集残余的液体，置于磁力架上吸磁完成后，用小枪头吸去残余的液体。将离心管开盖放置5min使磁珠表面无光泽。加入50μL洗脱液TE(Tris-EDTAbuffer solution，TE缓冲液)，轻轻震荡使磁珠分散，置于56℃洗脱10min，每隔3min取出轻轻震荡，使磁珠处于悬浮状态。
5)收集DNA溶液
取出离心管，离心收集管盖及管壁上的液体，置于磁力架上吸磁1min，小心吸取上清即得DNA溶液。
3.样本DNA转化
样本DNA的转化所用试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)，具体操作步骤如下所示：
加入40μL上述DNA溶液到200μL PCR管，加入110μL转化混合液，混匀后置于PCR仪中，设置程序为：95℃10min，64℃90min，4℃1h。
4.样本DNA纯化
样本DNA的纯化所用试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)，具体操作步骤如下所示：
1)将转化产物转入2mL离心管，加入600μL结合液及10μL磁珠，混匀静置结合15min，期间每3min震荡混匀5s，使磁珠一直处于悬浮状态；短暂离心，将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后(约1min)，小心移除上清。
2)加入600μL漂洗液，涡旋混匀20s分散磁珠；短暂离心，将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后(约1min)，小心移除上清。
3)加入800μL脱硫剂，涡旋混匀20s分散磁珠，室温静置15min脱硫，期间每5min震荡混匀5s，使磁珠一直处于悬浮状态。
4)加入800μL漂洗液，涡旋混匀20s分散磁珠；短暂离心，将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后(约1min)，小心移除上清。
5)重复步骤4)一次。
6)短暂离心将液体收集至管底，将离心管置于磁力架上，小心吸尽上清；开盖于25℃放置约5min至磁珠表面无光泽。
7)加入30μL洗脱液TE，涡旋使磁珠充分悬浮于洗脱液中，56℃孵育10min，期间每3min涡旋混匀一次促进核酸充分洗脱。
8)短暂离心，将离心管置于磁力架上静置2min，转移DNA溶液至新的离心管中。
5.PCR扩增及测序
以上述步骤中得到的尿液样本的DNA为模板，分别以表1中的区域1～区域6的简并引物对作为引物(同时扩增甲基化和未甲基化的DNA片段)，按照表2配置PCR反应体系，PCR体系中用到的DNA聚合酶为PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Takara,Cat:R010A)，按照表3展示的扩增程序进行PCR扩增。在PCR扩增结束后，分别使用表3中的简并引物作为测序引物对扩增产物进行桑格尔(Sanger)测序，同时从5’端和3’端测序。其中，区域1～区域6的原始核苷酸序列分别如表9中SEQ ID NO:34～SEQ ID NO:39所示。
表1
表2
| 组分 | 用量(μL) |
| <![CDATA[10×Taq buffer(Mg<sup>2+</sup>Free)]]> | 5 |
| <![CDATA[25mM Mg<sup>2+</sup>]]> | 4 |
| dNTP Mix(10mM each) | 1 |
| 上游引物(10μM) | 1 |
| 下游引物(10μM) | 1 |
| DNA聚合酶 | 0.5 |
| 模板DNA | 10 |
| 超纯水 | 补至50 |
表3
6.测序结果分析
对于测序成功的序列，根据测序峰图对每个样本各个扩增子中的差异CpG位点的甲基化情况进行分析。一个CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化情况分为两种，即非甲基化和甲基化，其中甲基化又分为完全甲基化和部分甲基化。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果为胸腺嘧啶，则其为非甲基化的。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果仍然为胞嘧啶，则其为完全甲基化的。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果既有胞嘧啶也有胸腺嘧啶(双峰)，则其为部分甲基化的。
如果一个扩增子中95％以上的CpG二核苷酸中胞嘧啶是甲基化的，则认为此样本在该基因区域是甲基化阳性的。计算各类样本中的甲基化阳性数目和甲基化阴性数目，并计算甲基化阳性和甲基化阴性的比例。灵敏度为病理结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例，特异性为病理结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。C1orf141基因CpG岛区域1～区域6在64例膀胱癌患者和78例健康人尿液样本中的甲基化状态、灵敏度和特异性如表4所示。
表4
由表4可以看出，C1orf14基因CpG岛区域1～区域6区分膀胱癌患者和健康人的尿液样本的效果良好。整体来看，C1orf141基因CpG岛区域1～区域6检测膀胱癌患者尿液样本的灵敏度都高于64％，其在健康人尿液样本中的检测特异性也都高于64％。其中，C1orf141基因CpG岛区域3和区域4检测的灵敏度和特异性均高于其它区域，其检测灵敏度大于81％，其检测特异性高于88％。
实施例2
本实施例中步骤1～4与实施例1中步骤1～4相同，此外，还包括以下步骤：
5.甲基化特异性荧光定量PCR
将各样本经亚硫酸氢盐转化后的DNA分别进行甲基化特异性荧光定量PCR以检测各个样本中C1orf141基因CpG岛区域7～区域12的甲基化水平，其中，区域7～区域12分别是位于区域1～区域6内的片段，区域7～区域12的原始核苷酸序列分别如表9中SEQ ID NO:40～SEQ ID NO:45所示，表5中的各核酸组合可检测的甲基化位点如表10所示。
每个区域单独进行检测，即一个PCR管中除加入必须的反应成分和模板以外，每次只加入一个区域的检测引物对和检测探针，同时加入内参基因ACTB的检测引物对和检测探针。检测探针均为TaqMan探针，C1orf141基因目标区域的检测探针5’端的荧光报告基团为FAM，3’端的荧光淬灭基团为MGB，ACTB基因的检测探针5’端的荧光报告基团为VIC，3’端的荧光淬灭基团为BHQ-1。C1orf141基因CpG岛区域7～区域12及ACTB基因的上下游检测引物及检测探针序列如表5所示。采用Invitrogen Platinum II Taq热启动DNA聚合酶(Invitrogen,Cat:14966005)进行PCR扩增，PCR反应配置体系如表6所示，按照表7展示的扩增程序进行PCR扩增。
在对目的基因的不同区域分别进行检测时，阴性对照和阳性对照同步进行检测。阴性对照为纯化水。阳性对照的制备方法为：将ACTB基因的扩增区域对应的经亚硫酸氢盐完全转化后的序列进行人工合成，并克隆至载体上，形成人工合成质粒。将完全甲基化的C1orf141基因区域7～区域12对应的经亚硫酸氢盐转化后的序列进行人工合成，并分别克隆至载体，形成人工合成质粒。C1orf141基因区域7～区域12的阳性对照由103拷贝/微升的ACTB基因人工合成质粒和103拷贝/微升的区域7～区域12的人工合成质粒按体积比1:1混合而成，例如：区域7的阳性对照为103拷贝/微升的ACTB基因人工合成质粒和103拷贝/微升的区域7的人工合成质粒按体积比1:1混合而成。
表5
表6
| 组分 | 规格 | 体积(μL) |
| Platinum II PCR缓冲液 | 5× | 5 |
| dNTPs | 各2.5mM | 3 |
| C1orf141基因目标区域上游引物 | 10μM | 0.5 |
| C1orf141基因目标区域下游引物 | 10μM | 0.5 |
| C1orf141基因目标区域检测探针 | 10μM | 0.5 |
| ACTB基因上游引物 | 10μM | 0.5 |
| ACTB基因下游引物 | 10μM | 0.5 |
| ACTB基因检测探针 | 10μM | 0.5 |
| DNA聚合酶 | / | 0.5 |
| 待测样本DNA | / | 5 |
| 纯化水 | / | 补至25 |
表7
6.PCR结果分析
PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1～2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。
当阴性对照无扩增，阳性对照有明显的指数增长期，且阳性对照中目的基因和内参基因的Ct值均在26～30之间，待检样本的内参基因的Ct值≤35时，表明当次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
当某一检测区域在尿液样本上的Ct值≤45时，即认为该样本在此区域被检出甲基化，即诊断为癌症阳性；若某一检测区域在尿液样本上的Ct值>45，则认为该样本在这一检测区域为甲基化阴性，即诊断为癌症阴性。C1orf141基因CpG岛区域7～区域12在64例膀胱癌患者和78例健康人尿液样本中的甲基化状态、灵敏度和特异性如表8所示，灵敏度和特异性的计算方法与实施例1相同。
表8
由表8可以看出，C1orf141基因CpG岛区域7～区域12可以用来区分膀胱癌患者和健康人的尿液样本。从整体来看，C1orf141基因CpG岛区域7～区域12检测膀胱癌患者尿液样本的灵敏度都高于67％，其在健康人尿液样本中的检测特异性也都高于69％。最明显的是，C1orf141基因CpG岛区域9和区域10检测的灵敏度和特异性均高于其它区域，其检测灵敏度约为80％，其检测特异性高于89％。
由于C1orf141基因CpG岛区域3和区域4分别涵盖C1orf141基因CpG岛区域9和区域10，则优选检测C1orf141基因Chr1:67134910-67135071(包括正负链)的甲基化状态可以有效区分膀胱癌患者和健康人。
表9
表10
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。
序列表
<110> 武汉艾米森生命科技有限公司
<120> 用于诊断膀胱癌的核酸产品、试剂盒及应用
<160> 45
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaattaaggg taatattgag gaagt 25
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggaatcaaa caaatataaa acc 23
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggggtttgtt tgattttaat tatat 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggggttaaaa atcaaaattt acata 25
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggtttcgta ttttgaaata aatt 24
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aggaaactct actctctaaa cctttc 26
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtttaggtt ttttagaggt aggtag 26
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcctttcctc cctcttctaa ctc 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaagggttgg aagagttgaa aat 23
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctaacctcaa ccacactctc cc 22
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gttgaggtta ggtaagtgtg ggat 24
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gggaacaaca ttaaaaaaac tcatt 25
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atgtaaaggg ttttttcgcg 20
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atcaaacaaa tataaaaccg cg 22
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gagtttttcg ggttcgtttt tcg 23
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tatatttttt cggtttaggt ttcg 24
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tttacgaaat aaaaaaaacg tcg 23
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggagaacgtt ttatcgattt cggg 24
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tcgcgggtta ttcgtttc 18
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aataaacaaa actcgacaac cg 22
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ttttagtaac gcgttttcgg ttcg 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
taggtaggta gagttcggta atcg 24
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aactccgcga attactcgc 19
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cggatcgagg acgcgttgtt aa 22
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gcgaaatagg aaaaacgtcg 20
<210> 26
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tcgatccaaa ccccgct 17
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gttttcggag tcggtgggac g 21
<210> 28
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aagtgtggga tcgcggc 17
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cgcggaagaa ttttttgtat tt 22
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
agaggcgagt tcggggggt 19
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
aaggtggttg ggtggttgtt ttg 23
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
aataacaccc ccaccctgc 19
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ggagtggttt ttgggtttg 19
<210> 34
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
aaattaaggg caacattgag gaagctcatt aatatttagt ttagaagatg caaagggttc 60
ttccgcgaac ctggaagagc cccccgggct cgcctctcgc cgcggtccca cacttgcctg 120
acc 123
<210> 35
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cttgcctgac ctcaaccaca ctctcccggt ccaggccccg ctggagaacg tcccaccgac 60
tccggggaca gaaaggccgt ttatgtaaaa cgacgttttt cctatttcgc ctcccaccct 120
catgcaaatt ttgattttca a 141
<210> 36
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ttccgcaccc tgaaacaaac ctcatctcct ttcctccctc ttctggctcc gcgggttact 60
cgccccgccc ccacccttca gtcccttagc aacgcgtcct cggtccgtag aaaccggttg 120
ccgagctctg cctacctctg aaaggcctag agagcagagt tc 162
<210> 37
<211> 125
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tctaggcctt tcagaggtag gcagagctcg gcaaccggtt tctacggacc gaggacgcgt 60
tgctaaggga ctgaagggtg ggggcggggc gagtaacccg cggagccaga agagggagga 120
aagga 125
<210> 38
<211> 151
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gaagggttgg aagagttgaa aatcaaaatt tgcatgaggg tgggaggcga aataggaaaa 60
acgtcgtttt acataaacgg cctttctgtc cccggagtcg gtgggacgtt ctccagcggg 120
gcctggaccg ggagagtgtg gttgaggtca g 151
<210> 39
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gttgaggtca ggcaagtgtg ggaccgcggc gagaggcgag cccggggggc tcttccaggt 60
tcgcggaaga accctttgca tcttctaaac taaatattaa tgagcttcct caatgttgcc 120
<210> 40
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
atgcaaaggg ttcttccgcg aacctggaag agccccccgg gctcgcctct cgccgcggtc 60
ccacacttgc ctgac 75
<210> 41
<211> 94
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
cacactctcc cggtccaggc cccgctggag aacgtcccac cgactccggg gacagaaagg 60
ccgtttatgt aaaacgacgt ttttcctatt tcgc 94
<210> 42
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ccgcgggtta ctcgccccgc ccccaccctt cagtccctta gcaacgcgtc ctcggtccgt 60
agaaaccggt tgccgagctc tgcctacc 88
<210> 43
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
aggtaggcag agctcggcaa ccggtttcta cggaccgagg acgcgttgct aagggactga 60
agggtggggg cggggcgagt aacccgcgga gcc 93
<210> 44
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gcgaaatagg aaaaacgtcg ttttacataa acggcctttc tgtccccgga gtcggtggga 60
cgttctccag cggggcctgg accg 84
<210> 45
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
aagtgtggga ccgcggcgag aggcgagccc ggggggctct tccaggttcg cggaagaacc 60
ctttgcatct 70
Claims (5)
1.一种检测C1orf141基因CpG岛甲基化水平的试剂在制备用于诊断膀胱癌的产品中的应用；以GRCh38.p13为参考基因组，所述试剂用于检测以下至少一个区域的甲基化水平：
正链Chr1:67134645-67134767、
正链Chr1:67134757-67134897、
正链Chr1:67134910-67135071、
负链Chr1:67135060-67134936、
负链Chr1:67134912-67134762、
负链Chr1:67134772-67134653、
正链Chr1:67134692-67134766、
正链Chr1:67134773-67134866、
正链Chr1:67134958-67135045、
负链Chr1:67135046-67134954、
负链Chr1:67134866-67134783、以及
负链Chr1:67134759-67134690。
2.一种用于诊断膀胱癌的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品包括检测以下至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平的引物对：
正链Chr1:67134645-67134767、
正链Chr1:67134757-67134897、
正链Chr1:67134910-67135071、
负链Chr1:67135060-67134936、
负链Chr1:67134912-67134762、以及
负链Chr1:67134772-67134653；
所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示的测序引物对、核苷酸序列如SEQID NO:3～4所示的测序引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:5～6所示的测序引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:7～8所示的测序引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:9～10所示的测序引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:11～12所示的测序引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:13～14所示的检测引物对、核苷酸序列如SEQ IDNO:16～17所示的检测引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:19～20所示的检测引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:22～23所示的检测引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:25～26所示的检测引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO:28～29所示的检测引物对中的至少一对。
3.根据权利要求2所述的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品还包括与所述检测引物对对应的检测探针，其中，与核苷酸序列如SEQ ID NO:13～14所示的检测引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:16～17所示的检测引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:19～20所示的检测引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示，与核苷酸序列如SEQ IDNO:22～23所示的检测引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:25～26所示的检测引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示，与核苷酸序列如SEQ ID NO:28～29所示的检测引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示。
4.一种用于诊断膀胱癌的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求2或3所述的核酸产品。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、阳性对照品、阴性对照品、PCR反应试剂和测序试剂中的至少一种。
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| GR01 | Patent grant | ||
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